●孟杰劉剛呂國平

原花青素影響成骨細胞中NF-κB及細胞因子的變化

●孟杰1劉剛2呂國平1

本研究擬觀察原花青素對成骨細胞中細胞因子的影響。方法：培養(yǎng)成骨樣細胞MC3T3，與原花青素共孵育后，收集細胞，加入細胞裂解液提取細胞中總蛋白，Trail法提取總mRNA，分別通過Western blot 和RT-PCR方法，觀察細胞因子以及NF-κB表達水平的變化。結(jié)果：與對照組相比，ELISA結(jié)果提示，原花青素應(yīng)用后，細胞因子IL-10、IL-6、和IL-13的含量顯著降低（P＜ 0.01），同時體現(xiàn)劑量依賴性。RT-PCR和免疫蛋白印跡結(jié)果表明，與空白對照組相比，原花青素可以顯著降低MC3T3細胞中NF-κB的表達（P＜ 0.01）。結(jié)論：原花青素可以降低成骨細胞中細胞因子及NF-κB的表達水平。

成骨細胞；原花青素；NF-κB; IL-6

成骨細胞是骨代謝的主要功能細胞，調(diào)節(jié)破骨細胞對骨的吸收，決定骨的形成[1]。在骨吸收時，白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）起到了重要的作用，成骨細胞可以合成分泌IL-6。細胞因子如IL-1等能刺激或增加成骨細胞產(chǎn)生IL-6，誘導(dǎo)骨吸收和破骨細胞樣細胞的形成[2-3]。本研究擬以原花青素為研究對象，通過培養(yǎng)成骨樣細胞MC3T3，利用分子生物學(xué)手段，從蛋白和基因水平觀察成骨細胞中細胞因子和NF-κB的變化，探討原花青素影響成骨細胞生物活性的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

原花青素購自中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%；NF-κB抗體購自sigma公司；成骨樣細胞MC3T3細胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細胞庫；MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司；dNTP和TagDNA聚合酶購自Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

MC3T3細胞，接種于細胞培養(yǎng)板（2×105），MEM培養(yǎng)基（含10%滅活胎牛血清），置37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。分為原花青素處理組（5mol/L，20 mol/L）和對照組。

1.3 ELISA檢測細胞因子的變化

按照上述分組，收集各組對數(shù)生長期的MC3T3細胞上清，ELISA試劑盒(上海凱博)測定IL-10、IL-6、和IL-13的含量。

1.4 NF-κB蛋白表達

按照上述分組，收集各組細胞，加入1ml胞裂解緩沖液，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集上清。Bradford 法蛋白定量，緩沖液稀釋蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入NF-κB抗體孵育（1:1000稀釋），4℃過夜，再加入二抗（辣根酶標(biāo)記，1：500）, 室溫條件，振蕩1小時，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，Bio-Rad圖像軟件分析圖像間的差異，計算灰度值，分析各組間差異。

1.5 NF-κB mRNA表達

按照上述分組，取對數(shù)生長期的細胞，Tzail (Invitrogen公司)法提取細胞總RNA，RT-PCR 分析NF-κB mRNA表達的變化。NF-κB 基因引物：5'-TCAATGGCTACACAGGAC CA-3'；反義5'-CACTGTCACCTGGAAC-CAGA -3'。β- actin 序列：5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3'；反義5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3'。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）合成cDNA模板。反應(yīng)體系為90℃，2min；94℃，2min；60℃，1min；72℃，1min；30cycles；60℃，2min。PCR產(chǎn)物5 ul，加1 ul的loading buffer混勻，加入樣品孔內(nèi)；接通電源，DNA樣品由負極往正極泳動，電壓為5V/cm，1%瓊脂糖凝膠電泳分離30min，終止電泳。0.5%溴化乙錠（EB）染色后，凝膠成像儀觀察圖像，β- actin作內(nèi)參考照，分析各組間mRNA表達水平的差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細胞因子水平變化

與空白對照組相比，原花青素（5mol/L）可以降低細胞因子的水平（P＜0.05），而原花青素（20mol/L）能夠顯著降低細胞因子的水平（P＜ 0.01）。

2.2 NF-κB mRNA表達變化

RT-PCR結(jié)果表明，原花青素（5mol/L）可以降低細胞中NF-κB mRNA表達水平（P＜0.05）；經(jīng)20mol/L原花青素處理后，NF-κB mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）。

2.3 NF-κB蛋白表達變化

Western blot結(jié)果也表明同樣的趨勢, 如圖3所示，原花青素（5mol/L）可以降低細胞中NF-κB 蛋白表達水平（P＜0.05）；經(jīng)20mol/L原花青素處理后，NF-κB 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。

3 討論

原花青素是一類天然多酚類化合物，具有很強的抗氧化活性。研究證實，原花青素可以有效地清除自由基，抑制氧自由基的產(chǎn)生，進而減少IκB的降解，同時下調(diào)iNOS的表達，最終可以抑制缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)。原花青素結(jié)構(gòu)中的羥基位點，可與雌激素受體(ER)相結(jié)合，增強甲狀腺釋放激素的作用，從而抑制骨的吸收，促進骨的形成[13-14]。

本試驗中，通過不同濃度的原花青素與MC3T3細胞孵育后，通過Western blot 和RT-PCR方法，觀察細胞因子以及NF-κB表達水平的變化。ELISA結(jié)果提示，原花青素應(yīng)用后，細胞因子IL-10、IL-6、和IL-13的含量顯著降低，同時體現(xiàn)劑量依賴性。RT-PCR和免疫蛋白印跡結(jié)果表明，與空白對照組相比，原花青素可以顯著降低MC3T3細胞中NF-κB的表達。提示原花青素可能通過調(diào)控成骨細胞中NF-κB通路，影響細胞因子的表達，改變成骨細胞的生物學(xué)活性，發(fā)揮進一步的生物效應(yīng)。本研究將為原花青素的進一步研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

（作者單位：1解放軍理工大學(xué)門診部；2南京軍區(qū)總醫(yī)院骨科）

[1] Gallagher JC. Advances in bone biology and new treatments for bone loss. Maturitas. 2008,20;60(1):65-9.

[2] Kwan Tat S, Padrines M, Théoleyre S. IL-6, RANKL, TNF-alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15(1):49-60.

[3] Roodman GD. Treatment strategies for bone disease. Bone Marrow Transplant. 2007;40(12):1139-46.

[4] Voehringer D. Basophil modulation by cytokine instruction. Eur J Immunol. 2012;42(10):2544-50.