丁寧 張明香

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肝細(xì)胞核因子4α增強(qiáng)型1.0倍HBV復(fù)制子體外復(fù)制模型建立及初步應(yīng)用

丁寧 張明香

【摘要】目的 建立一種肝細(xì)胞核因子4α（HNF4α）增強(qiáng)型1.0倍HBV復(fù)制子體外復(fù)制模型。方法 從臨床獲得的急性乙型肝炎患者血清中擴(kuò)增并克隆HBV全長(zhǎng)DNA；手術(shù)獲得肝組織中提取總RNA，擴(kuò)增并克隆HNF4α基因cDNA。Bsp QI/ScaI雙酶切回收HBV全長(zhǎng)DNA，HNF4α基因cDNA定向連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（＋）中，構(gòu)建pcDNA3.1-4α表達(dá)載體。將HBV全長(zhǎng)DNA1μg/孔，按比例共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-4α（0，0.5μg，1μg）于Hep G2細(xì)胞，96 h后檢測(cè)細(xì)胞上清中的HBs Ag、HBeAg和HBVDNA；以0.5μg/1μGpcDNA3.1-4α與HBV全長(zhǎng)DNA共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，加入不同濃度LAM（0，100μMol/L）和ETV（0，10μMol/L），評(píng)價(jià)建立的體外復(fù)制模型。結(jié)果 1％TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定HBV全長(zhǎng)DNA和HNF4α cDNAPCR產(chǎn)物，條帶長(zhǎng)度為3.2 kb和1.5 kb；目的片段克隆后測(cè)序鑒定正確。膠回收HBV全長(zhǎng)DNA克隆質(zhì)粒酶切目的片段，構(gòu)建的pcDNA3.1-4α表達(dá)載體酶切鑒定正確后，測(cè)序鑒定。不同濃度比例的pcDNA3.1-4α與HBV全長(zhǎng)DNA轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞后，0μg/1μg組合：HBeAg陰性，HBs Ag陰性，上清HBVDNA載量為103；0.5μg/1μg組合：HBeAg陰性，HBs AGA值從0.1升高到1.99，上清HBVDNA載量從1×103IU/ML升高到4 ×104IU/ML；1μg/1μg組合：HBeAg陰性，HBs AGA值從0.1升高到2.4，上清HBVDNA載量從1×103IU/ML升高到1×105IU/ML；LAM從0～100μMol/L，細(xì)胞上清HBVDNA降低了97.6％；ETV從0～10μMol/L，上清HBVDNA降低了99.0％。結(jié)論 HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBV復(fù)制子體外復(fù)制模型，可以體外評(píng)價(jià)臨床常用抗病毒藥物，為后續(xù)HBV研究提供新思路。

【關(guān)鍵詞】HNF4α；乙型肝炎；體外復(fù)制；抗乙肝藥物

HBV感染具有高度的組織與種屬特異性，而目前的Hep G2和Huh7等人肝癌來(lái)源的細(xì)胞系能夠表達(dá)肝細(xì)胞蛋白，所以目前常用DNA轉(zhuǎn)染到永生化細(xì)胞系技術(shù)建立HBV感染體外細(xì)胞培養(yǎng)體系。但由于HBV基因組的緊湊及其相互重疊的結(jié)構(gòu)一度成為構(gòu)建HBVDNA轉(zhuǎn)染用載體面臨的難題。目前采用至少1.1倍的HBV全長(zhǎng)基因組序列放入真核表達(dá)載體中，體外轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HBVpgRNA，達(dá)到體外復(fù)制的目的。所以目前的真核表達(dá)載體存在一些問(wèn)題：①構(gòu)建比較復(fù)雜，構(gòu)建策略會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；②都是過(guò)表達(dá)的產(chǎn)物，不能真實(shí)模擬病毒體內(nèi)的復(fù)制力；③在體外細(xì)胞系中病毒沒(méi)有完整的生活史。1995年Günther等［1］用含有特異性酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)引物擴(kuò)增出HBV全長(zhǎng)基因組，酶切后轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞系后可以使HBV無(wú)縫自連后表達(dá)，但由于缺乏外源強(qiáng)效啟動(dòng)子，1.0倍自連HBV復(fù)制子在體外病毒表達(dá)量較低。肝細(xì)胞核因子4α（hepatoeyte nuelear factor-4α，HNF4α）是核激素受體超家族的一種保守性的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟高表達(dá)，參與維護(hù)肝細(xì)胞分化、脂肪代謝、藥物解毒、白蛋白合成、能量代謝、膽汁酸合成等重要功能。Tang等［2］構(gòu)建在核心啟動(dòng)子近端的HNF4α結(jié)合位點(diǎn)的4個(gè)堿基突變后發(fā)，該突變型HNF4α不能與核心啟動(dòng)子近端的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，但HBV3.5 kb MRNA表達(dá)較野生株有輕微的下降，而HBV復(fù)制力則明顯下降。因此核激素受體HNF4α為HBVpgRNA合成和病毒復(fù)制所必需，且是一個(gè)具有增強(qiáng)HBV復(fù)制作用的調(diào)控因子。本研究將能夠表達(dá)HNF4α因子的真核表達(dá)載體與可自連的1.0倍HBV全長(zhǎng)序列共轉(zhuǎn)染體外肝癌細(xì)胞系中，構(gòu)建一種利用HNF4a增強(qiáng)型1.0倍HBV復(fù)制子的體外模型，并初步應(yīng)用。

材料與方法

一、主要試劑

Blood DNA提取試劑盒和組織RNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)），PCReasy MIx（全式金生物有限公司，北京），DNA膠回收試劑盒（Qiagen，德國(guó)），T-A克隆試劑盒（Pro mega，美國(guó)），RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen，美國(guó)），Bsp QI/Sca I和Eco RI/Ba MHI核酸內(nèi)切酶（NEB公司，美國(guó)），pcDNA3.1（＋）真核表達(dá)載體（Invitrogen，美國(guó)），DMEM、胎牛血清（Gibico，美國(guó)），Hep G2肝癌細(xì)胞系（本室自存）。引物序列由上海生工生物公司合成。

二、引物設(shè)計(jì)

HBV全長(zhǎng)擴(kuò)增引物按照文獻(xiàn)［1］合成，HNF4α擴(kuò)增引物從NCBI獲得HNF4αcDNA（GenBank Nu Mber：NM_000545）提交序列，按照序列信息合成。見(jiàn)表1。

三、血清HBVDNA的提取及全長(zhǎng)基因組擴(kuò)增

從臨床獲得2份慢性乙型肝炎患者血清，HBVDNA定量為1.23×105IU/ML和3.68×106IU/ML，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取血清中HBVDNA，PCR擴(kuò)增體系：2×PCRMix 25μL，F(xiàn)ULL-HBVF1μL，F(xiàn)ULL-HBVR1μL，HBVDNA5μL，dd H2O補(bǔ)足到50μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃5 min；94℃40 s，60℃100 s，72℃8 min×35循環(huán)；72℃10 min；4℃保持。PCR產(chǎn)物全部加入1％TAE瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行電泳鑒定，在約3.2 kb陽(yáng)性條帶樣本進(jìn)行切膠，按照試劑盒說(shuō)明回收目的PCR產(chǎn)物片段，產(chǎn)物以30μLEB重溶產(chǎn)物DNA，置于-20℃保存。

四、肝組織中HNF4α MRNA的提取及cDNA擴(kuò)增

從臨床肝癌手術(shù)患者獲得的癌旁新鮮組織，立即加入液氮在研缽內(nèi)研碎，然后嚴(yán)格按照Qiagen組織RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以oligd T引物在42℃作用90 min，70℃15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，將MRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增體系：2×PCRMix 25μL，4αF0.5μL，4α R0.5μL，cDNA產(chǎn)物5μL，dd H2O補(bǔ)足到50μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃3 min；94℃15 s，55℃20 s，72℃40 s×35循環(huán)；72℃10 min；4℃保持。PCR產(chǎn)物全部加入1％TAE瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，在約500 bp陽(yáng)性條帶樣本進(jìn)行切膠，按照試劑盒說(shuō)明回收目的PCR產(chǎn)物片段，產(chǎn)物以30μLEB重溶產(chǎn)物DNA，置于-20℃保存。

表1　HBV全長(zhǎng)擴(kuò)增引物和HNF4α反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增引物

五、全長(zhǎng)HBV和HNF4α cDNA的克隆

連接：T4 DNA連接酶Buffer 1μL，PGEM○R-TEasy載體（50 ng）1μL，膠回收DNA3μL，T4 DNA連接酶（3 U/μL）1μL，加dd H2O補(bǔ)足10μL，輕柔混勻，短暫離心，4℃過(guò)夜。轉(zhuǎn)化：從-70℃冰箱中取出的JM109感受態(tài)細(xì)胞置于冰上5 min，待菌液完全融化后，輕柔吹打混合后，取50μL感受態(tài)細(xì)胞加入連接體系的EP管中，靜置于冰上20 min，在42℃水浴中熱擊1 min，確保轉(zhuǎn)化EP管不能震動(dòng)。隨后迅速將管子移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2 min。每管連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中加入平衡至室溫的500μLSOC培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)化管恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)，37℃，180 r/min搖菌1 h。按照300μL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基/板的比例將培養(yǎng)基均勻涂布于含有X-Gal/IPTG/氨芐的固體平板培養(yǎng)皿表面。將上述培養(yǎng)皿置于37℃過(guò)夜。第二天挑取白色菌斑單克隆進(jìn)行鑒定。菌落PCR鑒定：將10μL純水加入PCR管中，采用無(wú)菌牙簽挑取白色單克隆菌落放于水中涮一下，再于復(fù)制板膠上劃幾下，編好號(hào)的PCR管置于95℃的金屬浴中10 min，隨后冰浴3 min裂菌。復(fù)制板置于37℃孵箱中過(guò)夜培養(yǎng)。以裂解菌液產(chǎn)物為模板，與1.3和1.4 PCR反應(yīng)條件和體系相同，進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物1％TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定，有目的片段則為陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆菌液送測(cè)序?qū)⒍ā?/p>

六、轉(zhuǎn)染級(jí)HBV全長(zhǎng)DNA制備

將已知序列信息的HBV全長(zhǎng)克隆菌液，37℃，220 rp m搖菌過(guò)夜，按照試劑盒提取質(zhì)粒，以Bsp QI/ Sca I雙酶切質(zhì)粒，酶切體系為：NEBBuffer 3.1 10μL，Bsp QI1.5μL，Sca I1.5μL，HBV全長(zhǎng)質(zhì)粒50μL，加dd H2O補(bǔ)足到100μL，先在體系中加入Bsp QI，50℃孵育5～6 h，然后再加入Sca I，37℃孵育過(guò)夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定后為4條帶，膠回收3.2 kb的目的片段，取20μL洗脫液溶解回收HBV全長(zhǎng)目的片段，紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

七、pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將測(cè)序的HNF4α cDNA克隆菌液和轉(zhuǎn)化了pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒的菌液，37℃，220 r/min搖菌過(guò)夜，按照試劑盒提取質(zhì)粒，分別以Eco RI/Ba MHI雙酶切質(zhì)粒，酶切體系為：NEBBuffer 3.1 3μL，Eco RI1μL，Ba MHI1μL，HNF4α cDNA質(zhì)粒/pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒5μL，加dd H2O補(bǔ)足到30μL，37℃孵育過(guò)夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)1％TAE瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收5.3 kb和396 bp的目的片段，取15μL洗脫液分別溶解回收目的片段。連接體系：T4 DNA連接酶Buffer 1μL，酶切pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒產(chǎn)物1μL，酶切HNF4α cDNA產(chǎn)物3μL，T4 DNA連接酶（3 U/μL）1μL，加dd H2O補(bǔ)足10μL，置于4℃過(guò)夜。轉(zhuǎn)化和菌落PCR與1.5條件相同。陽(yáng)性克隆送測(cè)序鑒定。

八、pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒與全長(zhǎng)HBVDNA共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞系鑒定

提取轉(zhuǎn)染級(jí)的pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒并測(cè)定其濃度，Hep G2細(xì)胞提前一天鋪板，2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按HBVDNA1μg/孔轉(zhuǎn)染，HBVDNA與轉(zhuǎn)染試劑X-geme HD按1∶2.5混合于Optim-MEM培養(yǎng)基分別加入pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒0μg，0.5μg，1μg中室溫孵育30 min，緩慢滴加轉(zhuǎn)染混合物到無(wú)血清培養(yǎng)基孵育的Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵育4～5 h后，棄去上清，PBS清洗細(xì)胞2遍后，加入1 ML含2％胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵育96 h后收取Hep G2細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)上清液中的HBs Ag和HBeAg，上清經(jīng)Dnase I酶37℃消化過(guò)量的DNA過(guò)夜，75℃10 min滅活后，用熒光定量PCR方法檢測(cè)HBVDNA載量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

九、HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBVDNA復(fù)制子初步應(yīng)用

轉(zhuǎn)染前1天將Hep G2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔置于24孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至60％～80％融合時(shí)，每孔加入全長(zhǎng)HBVDNA0.5μg和0.5μGpcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到Hep G2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后4 h，分別加入不同濃度的核苷（酸）類似物（LAM0，100μMol/L，ETV0，10μMol/L），隔天更換為含有相應(yīng)藥物濃度的新培養(yǎng)液，連續(xù)作用4 d。收集細(xì)胞上清，上清經(jīng)Dnase I酶37℃消化過(guò)量的DNA過(guò)夜，75℃10 min滅活后，采用熒光定量PCR方法進(jìn)行HBVDNA定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)　果

一、HBVDNA全長(zhǎng)以及HNF4α cDNA基因PCR擴(kuò)增

從臨床獲得5份急性肝炎患者血清，血清HBVDNA為1×104～106IU/ML。從肝癌患者外科手術(shù)獲得2份癌旁組織樣本，分別按說(shuō)明書(shū)提取HBVDNA和肝組織總RNA，特異性引物擴(kuò)增HBV全基因組DNA3.2 kb產(chǎn)物和HNF4α cDNA1.5 kb產(chǎn)物，1％TAE鑒定見(jiàn)圖1，圖2。

圖1　HBV全長(zhǎng)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

圖2　HNF4α cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定

二、HBVDNA全長(zhǎng)DNA以及HNF4α cDNA克隆

將PCR產(chǎn)物按照試劑盒說(shuō)明書(shū)膠回收目的片段，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，挑取白色陽(yáng)性克隆菌落PCR鑒定后，菌液送測(cè)序鑒定。見(jiàn)圖3。

三、轉(zhuǎn)染級(jí)HBV全長(zhǎng)DNA的制備

HBVDNA克隆經(jīng)菌落PCR和測(cè)序鑒定后，搖菌，提質(zhì)粒，Bsp QI/Sca I雙酶切后，膠回收3.2 kb目的片段，紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度。見(jiàn)圖4。

四、pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

HNF4α cDNA克隆質(zhì)粒與pcDNA3.1（＋）空載體質(zhì)粒經(jīng)Eco RI/Ba MHI雙酶切，膠回收1.5 kb的目的片段，將回收的pcDNA3.1（＋）載體與HNF4α cDNA片段通過(guò)T4dna連接酶連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化，涂板，挑菌提質(zhì)粒，經(jīng)Eco RI/Ba MHI雙酶切鑒定，5.3 kb和1.5 kb有單一條帶，條帶正確的質(zhì)粒送測(cè)序。見(jiàn)圖5。

圖3　目的片段克隆及鑒定

圖4　Bsp QI/ScaI雙酶切HBV全長(zhǎng)克隆載體電泳鑒定

五、pcDNA3.1-4α載體質(zhì)粒與全長(zhǎng)HBVDNA共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞系鑒定

預(yù)先接種Hep G2細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染1μg/孔HBV全長(zhǎng)DNA，分別按比例加入0、0.5和1 μGpcDNA3.1-4α表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，96 h后檢測(cè)上清中HBs Ag、HBeAg和HBVDNA載量。細(xì)胞上清中ELISA檢測(cè)HBeAg都低于0.2（A值），轉(zhuǎn)染不同濃度pcDNA3.1-4α的細(xì)胞上清中HBs Ag和上清中HBVDNA定量，隨pcDNA3.1-4α的濃度增加而升高。見(jiàn)圖6。

六、HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBVDNA復(fù)制子初步應(yīng)用

預(yù)先接種Hep G2細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)染1μg/孔HBV全長(zhǎng)DNA，分別加入0.5μGpcDNA3.1-4α表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后加入不同濃度的核苷（酸）類似物（LAM0，100μMol/L，ETV0，10μMol/ L），96 h后檢測(cè)上清中HBs Ag和HBVDNA載量。見(jiàn)圖7。

圖5　pcDNA3.1-4α真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

圖6　不同濃度pcDNA3.1-4α與HBV全長(zhǎng)DNA共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清標(biāo)志物檢測(cè)

圖7　不同濃度抗病毒藥物對(duì)HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBVDNA復(fù)制子的評(píng)價(jià)

討　論

長(zhǎng)期的HBV慢性感染會(huì)導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌，仍是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一［3］。由于感染人的HBV顆粒無(wú)法直接感染正常的體外無(wú)限增殖細(xì)胞，所以能夠支持HBV復(fù)制的體外培養(yǎng)體系的篩選制約了對(duì)HBV生活周期的深入研究，比如病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，病毒的組裝，運(yùn)輸與分泌等［4］。

1995年Günther等［1］用含有特異性酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)引物擴(kuò)增出HBV全長(zhǎng)基因組，酶切后轉(zhuǎn)染體外細(xì)胞系后可以使HBV無(wú)縫自連后表達(dá)，但由于缺乏外源強(qiáng)效啟動(dòng)子，1.0倍自連HBV復(fù)制子在體外病毒表達(dá)量較低，在細(xì)胞上清中也檢測(cè)不到HBs Ag和HBeAg，但該策略為后續(xù)HBV體外轉(zhuǎn)染研究奠定了基礎(chǔ)。1996年Weiss等［5］將含1.2倍HBV基因組的pSPT1.2-HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，該細(xì)胞培養(yǎng)上清中能夠檢測(cè)到HBV復(fù)制中間體。2004年Yang等［6］應(yīng)用PCR擴(kuò)增出HBV全基因，構(gòu)建了1.1 倍HBV真核表達(dá)載體PHY106。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞，篩選出1.1倍HBV穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。1.1倍體HBV轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是目前HBV復(fù)制所需最小拷貝數(shù)的細(xì)胞模型。隨著研究的深入，新的HBVDNA體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型不斷出現(xiàn)，但所有模型都不能與宿主體內(nèi)HBV感染完全一致，除1.0倍HBV復(fù)制子之外，其他都有外源強(qiáng)效的啟動(dòng)子，使HBV各元件過(guò)表達(dá)后在肝來(lái)源的癌細(xì)胞系中表達(dá)，缺失HBVcccDNA生活史階段，不能真實(shí)反映HBV的復(fù)制特點(diǎn)。

HNF4α是核激素受體超家族的一種保守性的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟高表達(dá)，參與肝細(xì)胞多種重要功能。隨著對(duì)HNF4α研究的深入，發(fā)現(xiàn)它也是調(diào)控上皮細(xì)胞表型的重要基因，可阻斷肝纖維化、肝硬化等肝臟慢性疾病的進(jìn)程，同時(shí)，HNF4α與HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制有關(guān)，但機(jī)制尚不完全清楚。Long等［7］發(fā)現(xiàn)，肝組織中HNF4α表達(dá)量與HBs Ag、HBc Ag和HBVDNA的表達(dá)量呈正相關(guān)，證明在感染HBV的患者組織中的HNF4α可能支持HBV復(fù)制。Tang等［8］體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HNF4α可以通過(guò)刺激前基因組3.5 kb MRNA的合成，從而支持HBV在非肝源細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，這表明HNF4α轉(zhuǎn)錄因子可能操縱了限制HBV嗜肝性的某些分子開(kāi)關(guān)。裴彥禎等［9］研究證明，HBVDNA水平在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者肝臟組織中逐漸降低。Ning等［10］研究表明，實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化、肝癌進(jìn)程中，肝細(xì)胞HNF4α表達(dá)逐漸降低。因此，現(xiàn)有體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系都是癌組織來(lái)源的，其HNF4α低表達(dá)或不表達(dá)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA復(fù)制力低下，所以干預(yù)提高體外細(xì)胞系中HNF4α的表達(dá)可以增強(qiáng)HBVDNA的復(fù)制能力。

本研究從急性肝炎患者血清中擴(kuò)增出HBV全長(zhǎng)序列，分離出單克隆。從肝組織中獲得HNF4α MRNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA單克隆，將HNF4α cDNA放入pcDNA3.1真核表達(dá)載體中。不同比例共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-4α表達(dá)質(zhì)粒和HBV全長(zhǎng)DNA，結(jié)果顯示，0.5μg/1μg轉(zhuǎn)染組合，對(duì)HBV就有很強(qiáng)的增效作用，HBeAg陰性，HBs AGA值從0.1升高到1.99，上清HBVDNA載量從1×103IU/ML升高到4×104IU/ML。1μg/1μg轉(zhuǎn)染組合：HBeAg陰性，HBs AGA值從0.1升高到2.4，上清HBVDNA載量從1×103IU/ML升高到1×105IU/ML，以上數(shù)據(jù)顯示HNF4α可以增強(qiáng)1.0倍HBV復(fù)制子的體外表達(dá)，但對(duì)HBeAg沒(méi)有增效作用。

選取拉米夫定和恩替卡韋來(lái)評(píng)價(jià)建立的HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBVDNA復(fù)制子系統(tǒng)，LAM從最低濃度（0）到最大濃度（100μMol/L），HBs AGA值從2.05降到0.2，上清HBVDNA載量從1.1×105IU/ML降低到2.6×103IU/ML；ETV從最低濃度（0）到最大濃度（10μMol/L），HBs AGA值從2.18降到0.12，上清HBVDNA載量從2.2×105IU/ML降到2.0×103IU/ML。以上數(shù)據(jù)顯示建立的HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBVDNA復(fù)制子系統(tǒng)可以體外評(píng)價(jià)核苷類抗病毒藥物。

總之，HNF4α體外表達(dá)可以增強(qiáng)HBV復(fù)制力，建立的HNF4α增強(qiáng)型1.0倍HBVDNA復(fù)制子系統(tǒng)可以有效的評(píng)價(jià)抗病毒藥物，該系統(tǒng)更接近的模擬HBV在感染患者體內(nèi)的復(fù)制情況，為后續(xù)HBV的研究提供了新的思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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9 裴彥禎，韓濤，馬驍艷，等. HBs Ag及HBVDNA定量水平在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中的變化.中華肝臟病雜志，2011，10：743.

10 Ning BF，Ding J，Yin C，et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha suppresses the develop ment of hepatocellular carcino ma. Cancer Res，2010，70：7640-7651.

（本文編輯：錢燕）

Construction and initial application of HNF4 α enhanced 1.0-fold HBVreplication modelinvitro

DINGNing，ZHANGMing-xiang. Departmentof liver diseases，the Sixth People＇s Hospitalof Shenyang，Shenyang 110006，China

【Abstract】Objective To construct a hepatocyte nuclear factor 4 alpha（HNF4 α）enhanced 1.0-fold hepatitis Bvirus （HBV）replication Model. Methods Afull-length HBVDNAfro Mseru Mof acute hepatitis B（AHB）patients was isolated for am plification and cloning，and total RNAof liver tissue fro Msurgery was extracted for HNF4 α gene cDNAam plifying and cloning. Bsp QI/ScaIwas used to digest HBVDNAplasmid and recover HBVDNAproduction. HNF4 α gene cDNAwas directionally connected to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1（＋）for construction of pcDNA3.1-4 α expression vector. Hep G2 cells were transfected with full-length HBVDNA（1μg/well），according to proportion of transfection pcDNA3.1-4 α（0μg，0.5μg，1μg）. After 96 hours，HBs Ag，HBe AGlevels and HBVDNAload in cell supernatant were detected. Hep G2 cells were transfected with 0.5μg/1μGpcDNA3.1-4 α and full-length HBVDNA，w hich were added with different concentrations of LAM（0μMol/L，100μMol/L）and ETV（0μMol/L，10μMol/L）to evaluate the replication Modelin vitro. Results The 1％TAEagarose gel detection showed that the lengths of the strips of full-length HBVDNAand HNF4 α cDNAPCRproduct were 3.2 kb and 1.5 kb，respectively，of w hich cloning target frag ments were sequenced and identified. The full-length HBVDNAwas recycled fro Mgel for cloning digested target frag ments. The constructed pcDNA3.1-4 α expression vector was sequenced and identified. Hep G2 cells were transfected with different ratios of pcDNA3.1-4 α and full-length HBVDNA.In 0μg/1μGgroup，HBe AGand HBs AGwere negative with a HBVDNAload of 103in supernatant；in 0.5μg/1μGgroup，HBe AGwas negative and HBs AGODrose fro M0.1 to 1.99 with an increasing HBVDNAload fro M1×103to 4×104；in 1μg/1μGgroup，HBe AGwas negative and HBs AGODbook=29,ebook=33rose fro M0.1 to 2.4 with an increasing HBVDNAload fro M1×103to 1×105. HBVDNAload in supernatant was reduced by 97.6％as lamivudine increasing fro M0μMol/Lto 100μMol/L，and was also reduced by 99.0％as entecavir increasing fro M0μMol/Lto 10μMol/L. Conclusion HNF4 α enhanced 1.0-fold HBVreplication Model is constructed successfully，w hich could be used to evaluate anti-HBVagents in vitro and provide new insights for HBVstudy.

【Key words】HNF4 alpha；Hepatitis Bvirus；Replication in vitro；Antiviral HBV

收稿日期：（2015-08-27）

Corresponding author：DINGNing，Email：dingningwz_1976@sina.com

通信作者：丁寧，Email：dingning wz_1976@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)分課題：慢性病毒性肝炎中西醫(yī)結(jié)合治療方案優(yōu)化研究（2012ZX1005004-001）

作者單位：110006 沈陽(yáng)市第六人民醫(yī)院肝病科