蔡珍珍徐廣有董海影溫秋婷于秀文王紹清張曉杰張靜艷

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柴胡皂苷對抑郁模型大鼠海馬神經元的保護作用*

蔡珍珍①徐廣有①董海影①溫秋婷①于秀文①王紹清①張曉杰①張靜艷①

【摘要】目的：探討柴胡皂苷對抑郁模型大鼠行為及海馬神經元細胞凋亡的保護作用。方法：采用隨機數字表法將60只SD雄性大鼠分為對照組、模型組、氟西汀組和柴胡皂苷組，每組15只。采用慢性不可預見性應激刺激（CUMS）加孤養(yǎng)方式復制抑郁模型。于造模第2天開始，對氟西汀組和柴胡皂苷組大鼠進行灌胃給藥。在實驗的第1、7、14、21天，通過糖水消耗量實驗檢測大鼠行為學改變。采用RT-PCR法對各組大鼠腦海馬神經元JNK、Bad mRNA進行定量分析。結果：對照組、柴胡皂苷組、氟西汀組第14及21天糖水偏愛度均高于模型組，JNK、Bad mRNA表達量均低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論：柴胡皂苷可以有效控制大鼠抑郁癥狀，其機制可能與降低海馬組織中JNK、Bad蛋白表達有關。

【關鍵詞】柴胡皂苷； 海馬； 抑郁； 凋亡信號調節(jié)激酶1

①齊齊哈爾醫(yī)學院 黑龍江 齊齊哈爾 161006

First-author’s address：Qiqihar Medical College，Qiqihar 161006，China

抑郁癥的發(fā)病機制目前有多種假說，有觀點認為抑郁易損基因與心理應激的共同作用，導致的氧化應激、神經元凋亡與抑郁癥的發(fā)生密切相關[1]?；趯ふ铱挂钟糇饔玫陌兄委燑c，科學界開展了大量的研究，并取得一定的進展[2-3]。柴胡皂苷是柴胡的主要成分，具有解郁醒腦、改善抑郁樣癥狀的作用，但機制尚不明確。本實驗從柴胡皂苷抗凋亡、緩解神經元損傷角度探討其抗抑郁作用機制，現具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2～3月齡清潔級雄性健康SD大鼠60只，體重180～200 g，由大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（遼）2008-0002。采用隨機數字表法將其分為正常對照組、模型組、氟西汀組和柴胡皂苷組共四組，每組15只。

1.2 藥品及試劑 柴胡皂苷（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供，批號：ZL043583DY），鹽酸氟西汀膠囊（蘇州俞氏藥業(yè)有限公司。批號：H20093454），PCR試劑盒、反轉錄試劑盒由寶生物工程有限公司提供。

1.3 儀器 PCR System擴增儀2700為Applied Biosystems公司產品，熒光定量PCR儀ABI7300為ABI公司產品。

1.4 方法

1.4.1 造模及給藥 對照組不給予任何刺激。其余各組大鼠均分籠飼養(yǎng)并進行21 d慢性不可預見性應激（CUMS）刺激，方法根據Katz法進行改進[4]。于造模第2天開始氟西汀組采用氟西汀1.2 mg/（kg·d），柴胡皂苷組采用柴胡皂苷25 mg/（kg·d）進行灌胃給藥，對照組及模型組給予等量生理鹽水。

1.4.2 大鼠行為學評價 在實驗的第1、7、14、21天測定1 h大鼠飲用1％蔗糖水及純水量，計算大鼠糖水偏愛度（糖水偏愛度＝糖水消耗量/總液體消耗量×100％）。

1.4.3 RT-PCR法檢測JNK、Bad的mRNA含量 分離海馬，按RNAiso Reagent試劑盒操作流程提取海馬組織總RNA并測驗RNA純度及濃度。按照SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）kit試劑盒說明進行實驗，反應體系為25 μL。反應引物：JNK-F1：5’-CTGTGCTAATGACCTGCTTGTTG-3’，JNK-R1：5’-TACCCGAGAGTTTGGGCTGT-3’，Bad-F1：5’-AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG-3’，Bad-R1：5’-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3’，按下列公式計算△△Ct值：△CT（test）＝CT（target，test）-CT（ref，test），△CT（calibritor）＝CT（target，cal）-CT（ref，cal），△△CT＝△CT（test）-CT（calibritor），各樣品mRNA表達水平均用2-△△CT表示。

1.5 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 13.0軟件包對所得數據進行統(tǒng)計學處理，計量數據使用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學有意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學評價 對照組、柴胡皂苷組、氟西汀組第14及21天糖水偏愛度均高于模型組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

2.2 柴胡皂苷對大鼠海馬JNK、Bad mRNA表達的影響 對照組、柴胡皂苷組、氟西汀組JNK、Bad mRNA表達量均低于模型組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

表1　各組大鼠糖水偏愛度比較（±s）?。?/p>

表1　各組大鼠糖水偏愛度比較（±s）?。?/p>

*與模型組比較，P＜0.01

組別　　實驗前　　第7天　　第14天　　第21天對照組（n＝15）　69.47±7.09　72.80±6.53　77.91±1.76*　82.13±10.01*模型組（n＝15）　 68.39±11.05　66.73±8.63　51.77±13.87　37.62±12.64柴胡皂苷組（n＝15）　67.28±9.58　65.71±6.73　72.23±12.07*　76.58±11.72*氟西汀組（n＝15）　68.77±9.43　65.49±6.40　74.27±13.74*　75.66±12.36*

表2　各組大鼠JNK、Bad mRNA相對表達量比較（±s）

表2　各組大鼠JNK、Bad mRNA相對表達量比較（±s）

*與模型組比較，P＜0.01

組別　JNK mRNA　Bad mRNA對照組（n＝15）　 1.01±0.02*　1.27±0.10*模型組（n＝15）　5.23±0.18　 4.26±0.47柴胡皂苷組（n＝15）　3.13±0.20*　3.41±0.25*氟西汀組（n＝15）　2.76±0.14*　3.01±0.45*

3 討論

隨生活環(huán)境改變，影響人類健康的心境疾病逐年增多，其中尤以抑郁癥為著，為探討抗抑郁新藥國內外科研團隊開展了多年的研究[4-5]。抑郁癥的機制復雜，根治不徹底是現今醫(yī)療界的難題[6]。本實驗采用孤養(yǎng)結合CUMS復制大鼠抑郁模型，探討柴胡皂苷的抗抑郁作用。

本實驗采用糖水消耗量檢測評價大鼠抑郁程度。隨造模時間增加，大鼠抑郁樣癥狀加重，糖水偏愛度減少證實其快感缺失嚴重。通過糖水消耗實驗證實本實驗成功復制大鼠抑郁模型。

JNK屬于細胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedprotein kinase kinase kinase，MAP3Ks）家族的成員[8]。JNK蛋白可被紫外線照射、炎性因子等多種凋亡刺激所激活[9-10]。激活的JNK又可導致下游級聯(lián)反應，促進神經元凋亡。JNK激活后可通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是上調促凋亡相關蛋白的表達從而激活死亡受體凋亡通路，另一條途徑是通過調節(jié)Bcl-2家族成員的活性參與線粒體介導的細胞凋亡通路。

凋亡蛋白Bad是Bcl-2家族成員之一。Bad在外周及中樞神經元、淋巴細胞、生殖細胞及許多上皮細胞中均有表達[11-12]。Bad在凋亡刺激信號作用于促凋亡成員時發(fā)生構型改變，易位并插入線粒體外膜發(fā)揮促凋亡活性[13]。

綜上所述，本研究采用慢性不可預見性應激刺激結合孤養(yǎng)，成功建立抑郁大鼠模型，主要表現為糖水消耗量減少。本實驗通過柴胡皂苷與氟西汀對抑郁大鼠進行灌胃給藥后，大鼠海馬神經元中JNK蛋白表達明顯降低，其下游蛋白亦發(fā)生級聯(lián)反應，Bad蛋白呈現低表達。說明柴胡皂苷可能通過抑制海馬神經元JNK蛋白表達，下調Bad蛋白表達，從而減少神經細胞凋亡。

目前抑郁癥的病理機理尚不完全明確[14-15]。但結合大鼠糖水消耗量的改善，可以證實，柴胡皂苷抗抑郁作用明顯，其抗抑郁作用的機制可能與降低大鼠海馬組織中的JNK、Bad蛋白表達有關。

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Protective Effect of Saikosaponin on the Hippocampal Neuron of Depression Model Rats

/CAI Zhenzhen，XU Guang-you，DONG Hai-ying，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（03）：028-030

【Abstract】Objective：To investigate the protective effect of Saikosaponin on the behavior and the apoptosis of hippocampus neurons in depression model rats.Method：60 SD rats were randomly divided into the control group，the model group，the Saikosaponina group and the Fluoxetine group，15 rats in each group.Solitary and chronic mild unpredictability stimulation were used to copy the model of depression.From the second day after modeling successfully，the Saikosaponina group and the Fluoxetine group were given intragastrical administration.On the first，seventh，fourteenth and twenty-first day of the experiment，sugar water consumption experiment was used to detect the behavioral change of the rats.Real-time PCR was used for the quantitative analysis of JNK，Bad mRNA. Result：The preference degree of sugar water in the the control group，the Saikosaponina group and the Fluoxetinebook=29,ebook=33group was higher than that in the model group，the expression quantities of JNK，Bad mRNA in the the control group，the Saikosaponina group and the Fluoxetine group were lower than those in the model group，the differences were all statistically significant（P＜0.01）.Conclusion：Saikosaponina can effectively control the depressive symptoms of rats. Its mechanism may be related to the decreasing of JNK，Bad protein expression in hippocampus.

【Key words】Saikosaponin； Hippocampus； Depression； Apoptosis signal regulating kinase-1

收稿日期：（2015-12-09） （本文編輯：王利）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.03.009

通信作者：張靜艷

*基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12531784）