冷依伊，任梅滲，蒙正群，楊澤曉，姚學(xué)萍，王印

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130）

豬偽狂犬病病毒致病機(jī)理及其變異的研究進(jìn)展

冷依伊1，2，任梅滲1，2，蒙正群1，2，楊澤曉1，姚學(xué)萍1，王印1，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130）

豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）屬于皰疹病毒I型，可引起家畜和多種野生動物以發(fā)熱、呼吸道癥狀和神經(jīng)癥狀為特征的急性傳染病。文章對豬偽狂犬病病毒的病原特征、臨床癥狀和致病機(jī)理進(jìn)行描述，尤其是對目前已發(fā)現(xiàn)的在致病性中存在關(guān)鍵作用的11種主要的糖蛋白，如gE、gD和TK等進(jìn)行了詳細(xì)綜述，以期為豬偽狂犬病致病機(jī)理、基因變異情況和豬偽狂犬病疫苗研究提供依據(jù)。

豬偽狂犬病病毒；流行現(xiàn)狀；潛伏感染；致病機(jī)理；變異

偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一類急性傳染病，在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中對豬的危害大，可通過水平與垂直傳播，因此傳染率高，且后果嚴(yán)重。PRV可導(dǎo)致病豬機(jī)體內(nèi)多方面組織、器官受損，雖然偽狂犬病臨床癥狀十分明顯，但存在潛伏感染，給防治工作帶來很大挑戰(zhàn)。其致病機(jī)理一直是獸醫(yī)界關(guān)注的關(guān)鍵問題，這與豬偽狂犬病的疾病控制密切相關(guān)，隨著PRV變異的出現(xiàn)，致病機(jī)理的研究顯得更為重要。

1 PRV感染

1.1 PRV臨床癥狀

偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的家畜及野生動物的急性傳染病，若新生仔豬感染PRV，病毒最初定位于扁桃體，以高熱、神經(jīng)癥狀為特征，4周齡內(nèi)的仔豬常1～2 d內(nèi)死亡，且死亡率很高；成年豬多為隱性感染，也可表現(xiàn)發(fā)熱和呼吸系統(tǒng)癥狀，有時(shí)還可見上呼吸道卡他性炎癥；懷孕母豬50%主要表現(xiàn)出流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎；康復(fù)豬可以通過鼻腔分泌物及唾液持續(xù)排毒。PRV可通過直接接觸而感染，主要經(jīng)呼吸道和消化道傳播，也能通過吸入帶毒的飛沫或污染的飼料而感染。目前PRV已分布至世界范圍內(nèi)[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為外觀皮膚無出血點(diǎn)、斑，耳朵稍暗紅，鼻孔有分泌物。斷乳前后仔豬發(fā)病率和死亡率較低，而一旦拉黃色稀糞時(shí)，常以死亡為轉(zhuǎn)歸[2]。成年豬能夠經(jīng)受感染并生存下來，但也因此成為了PRV的天然儲存庫和傳染源，同時(shí)PRV在豬水平和垂直傳播均可以發(fā)生，所以應(yīng)對豬進(jìn)行重點(diǎn)防護(hù)，以免病毒發(fā)生進(jìn)一步傳播。所以，偽狂犬病的發(fā)生主要取決于豬的年齡、主動和被動的免疫水平、導(dǎo)致感染的病毒株毒力以及病毒的數(shù)量[3]。

1.2 PRV潛伏感染

潛伏感染是皰疹病毒科的共同特點(diǎn)之一，是指機(jī)體感染病毒后以非活化的狀態(tài)存在于機(jī)體的感染神經(jīng)節(jié)中，感染動物無任何癥狀，不產(chǎn)生具有感染性的病毒粒子。Wheeler等[4]曾報(bào)道過在病毒潛伏感染期，病毒的基因組仍可在腦干等神經(jīng)部位檢測到，但大部分基因的轉(zhuǎn)錄處于靜止?fàn)顟B(tài)，僅少數(shù)基因可以表達(dá)。

動物試驗(yàn)表明，PRV的潛伏感染可以分為兩個(gè)階段[5]。首先，PRV在口腔、鼻腔黏膜繁殖（也可直接進(jìn)入鼻咽部感覺神經(jīng)的末梢），經(jīng)過第1輪復(fù)制后構(gòu)成原發(fā)感染灶。然后，病毒經(jīng)三叉神經(jīng)、嗅神經(jīng)、舌咽神經(jīng)的神經(jīng)末梢，進(jìn)入嗅球和三叉神經(jīng)節(jié)，在其中復(fù)制一段時(shí)間后以核衣殼的形式存在，即構(gòu)成潛伏感染，這一過程大約需要2～4周的時(shí)間。視神經(jīng)為顱腔內(nèi)較靠前的一對神經(jīng)，由間腦發(fā)出，PRV感染視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞后，沿著視神經(jīng)順向感染視交叉上的二級神經(jīng)元[6]。

目前關(guān)于潛伏感染的建立、維持及激活機(jī)制尚不明確。通過研究，人們已知PRV的DNA既能以附體的形式存在[7]，也可以插入潛伏感染的神經(jīng)DNA。一方面，潛伏的基因組一般為沉默基因，當(dāng)受到外界的刺激因素（應(yīng)激、外周組織損傷或某些藥物）后，潛伏感染被激活，病毒可通過軸突運(yùn)輸返回外周組織，通過口、鼻或生殖道分泌物排毒。另一方面，PRV潛伏的細(xì)胞可能逃避了免疫系統(tǒng)的清除。Aleman等[8]在研究PRV對細(xì)胞程序性死亡的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，PRV可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞死亡，阻礙或延遲被病毒侵染的細(xì)胞程序性死亡，并在被侵染細(xì)胞內(nèi)最大限度地增殖。因此，在免疫細(xì)胞遭到破壞時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)不一定能清除被PRV侵染的細(xì)胞。

2 偽狂犬病病毒病原學(xué)

2.1 PRV病原特性

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）A型皰疹病毒亞科[9]。而皰疹病毒亞科分為3種類型：甲亞科、乙亞科和丙亞科[10]。乙亞科是宿主范圍最窄，并且復(fù)制周期最長的一類；丙亞科大多感染淋巴樣干細(xì)胞，因此易在淋巴組織中形成潛伏期，同時(shí)存在B細(xì)胞或者T細(xì)胞特異性；而PRV屬于皰疹病毒甲亞科水痘皰疹病毒屬，其宿主選擇范圍很廣，并且復(fù)制周期短，在短時(shí)間甚至幾小時(shí)內(nèi)便可產(chǎn)生細(xì)胞病變，同時(shí)包裝成病毒顆粒，從而在大腦神經(jīng)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生潛伏感染，并確定潛伏期。雖然PRV與人的甲型皰疹病毒有高度同源性，并且可選擇的宿主范圍廣，但是PRV卻不能感染人[11]，這也大幅減少了之前偽狂犬病病毒大肆傳播與感染的擔(dān)憂。

2.2 形態(tài)學(xué)特征

偽狂犬病病毒粒子呈球形，囊膜表面有呈放射狀排列的纖突[12]，成熟的病毒粒子直徑約150～180 nm，基本由4個(gè)結(jié)構(gòu)構(gòu)成：核芯（包含有病毒的雙股DNA基因組）、核衣殼（由162個(gè)中空的殼粒組成，直徑約100 nm左右的二十面體，具有保護(hù)基因組DNA的作用）、被膜和囊膜（包裹被膜的，且含有很多病毒糖蛋白）[13]。成熟皰疹病毒顆粒的核衣殼和囊膜之間存在一定空隙，但幾乎都由被膜蛋白填充，當(dāng)囊膜和被感染的細(xì)胞膜融合時(shí)，被膜蛋白和核衣殼將同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞，從而輔助細(xì)胞接受病毒，但此過程在PR病毒蛋白質(zhì)開始合成之后便會停止[14]。PRV的囊膜由磷脂雙分子層組成，是病毒在轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體內(nèi)的組裝過程中融合細(xì)胞膜而形成的，皰疹病毒的糖蛋白幾乎存在所有被感染細(xì)胞的細(xì)胞膜和病毒的囊膜上，囊膜蛋白在病毒出芽、內(nèi)化、包膜、出胞、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、誘發(fā)保護(hù)性免疫、免疫逃避以及免疫應(yīng)答方面均有重要作用，并且在免疫應(yīng)答時(shí)還能促進(jìn)胞體的形成。

3 偽狂犬病的致病機(jī)理

研究PRV毒力的致病機(jī)理有助于評估目前所用疫苗株的安全性，同時(shí)可以了解不同PRV毒株引起各種疾病的臨床癥狀的相關(guān)機(jī)理。PRV的毒力受多種基因控制，但不同的基因在構(gòu)成PRV毒力中所起的作用不同。決定PRV毒力的蛋白質(zhì)大致可分為3類[15]：介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主體內(nèi)并擴(kuò)散的囊膜糖蛋白；病毒編碼與DNA代謝或磷酸化有關(guān)的酶；與病毒裝配有關(guān)的蛋白質(zhì)。而經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過PRV的UL41基因的產(chǎn)物形成的囊膜蛋白具有RNase活性[16]，能降解宿主mRNA。而在PRV基因組編碼形成的16種囊膜蛋白上存在11種糖蛋白[17]，即gB（UL27）、gC（UL44）、gD（US6）、gE（US8）、gG（US4）、gH（UL22）、gK（UL53）、gI、gL（UL1）、gM和gN（UL49.5）。對PRV糖蛋白的研究具有重要意義，不僅有助于了解PRV與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，而且對于皰疹病毒的分子進(jìn)化關(guān)系及糖蛋白免疫學(xué)的研究具有特別價(jià)值。

糖蛋白是動物機(jī)體免疫系統(tǒng)識別的成分，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PRV有11種糖蛋白[18]，這11種糖蛋白是病毒顆粒和被感染細(xì)胞的表面組成部分，成為宿主免疫防御的主要靶標(biāo)。病毒增殖的必需的糖蛋白主要有g(shù)B、gD、gH、gL、gK；非必需糖蛋白是決定毒力的因子，主要有g(shù)E、gI、gG、gC、gM、gN等。在病毒與細(xì)胞的融合過程中，至少有4種糖蛋白參與其中：即gB、gD、gH、gL。缺少任何一種蛋白質(zhì)，病毒都不會與細(xì)胞膜相融合。在細(xì)胞囊膜與細(xì)胞膜融合后，核衣殼開始釋放入細(xì)胞內(nèi)，并在5 min內(nèi)沿微管轉(zhuǎn)移至核膜上臨近核孔的位置上，衣殼的一個(gè)頂點(diǎn)正對核孔，將病毒DNA注入細(xì)胞核內(nèi)[19]。下面將對幾種主要的糖蛋白進(jìn)行分析。

3.1 PRV的gC基因作用機(jī)理

動物感染PRV后，病毒將吸附在靶細(xì)胞上，病毒的囊膜糖蛋白和細(xì)胞表面的蛋白受體之間會產(chǎn)生特異性結(jié)合。PRV對細(xì)胞的吸附有可逆性吸附和不可逆性吸附兩個(gè)階段[20]。首先是可逆性階段，Hampl等[21]認(rèn)為gC通過和細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白相互作用來實(shí)現(xiàn)PRV對靶細(xì)胞的最初接觸，相結(jié)合時(shí)細(xì)胞囊膜和細(xì)胞質(zhì)膜均未發(fā)生改變，此時(shí)肝素鈉溶液可以將PRV病毒粒子洗脫下來。隨著吸附時(shí)間的延長，在適宜的條件下，病毒與細(xì)胞表面其他受體相繼結(jié)合，引起細(xì)胞和囊膜產(chǎn)生變化，使可逆性結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嫘越Y(jié)合。Schmidt等[22]用gC和gD的真核表達(dá)質(zhì)粒分別免疫豬，結(jié)果均能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，用含gC基因的DNA疫苗免疫可對PRV-75V19毒株攻毒起完全保護(hù)作用，對NIA-3株P(guān)RV攻毒只能起到部分保護(hù)。接種豬除了產(chǎn)生抗gC的抗體外，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對gC的特異性的細(xì)胞應(yīng)答，這一結(jié)果為研制基因疫苗控制偽狂犬病帶來了新的希望。但如果用表達(dá)gC的核酸疫苗進(jìn)行免疫，則能很好保護(hù)豬以抵抗PRV-75V19毒株的致死性攻擊，并能保護(hù)豬部分抵抗PRV強(qiáng)毒NIA-3株的攻擊。

3.2 PRV的gD基因作用機(jī)理

PRV囊膜糖蛋白gD在病毒與細(xì)胞最初接觸時(shí)產(chǎn)生作用，是病毒侵入靶細(xì)胞所必需的[23]，主要改變病毒在細(xì)胞膜上的吸附狀態(tài)。雖然PRV gD是病毒在細(xì)胞間傳遞必需的糖蛋白，但并未參與吸附與穿透的病毒感染過程，然而gD基因的缺失將直接導(dǎo)致病毒性能的改變。經(jīng)研究表明，利用PRV保護(hù)性抗原基因gD進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)免疫小鼠能產(chǎn)生較高滴度的抗體，并在疫苗免疫3次后抵抗強(qiáng)毒攻擊。此外，Haagmans等[24]構(gòu)建含PRV gD基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，以其接種新生仔豬或小鼠，結(jié)果顯示都能產(chǎn)生中等水平的中和抗體并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增生。用強(qiáng)毒接種免疫動物，同時(shí)以空質(zhì)粒載體作為對照組，可發(fā)現(xiàn)單純的DNA疫苗如gD所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)通常不足以提供機(jī)體完全的抗病毒保護(hù)，攻毒后機(jī)體還有一個(gè)排毒的過程并且出現(xiàn)一些臨床癥狀，對PRV的攻擊不具保護(hù)力[25]。研究表明，gD基因的DNA疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的體液免疫反應(yīng)[26]，并且gD可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非補(bǔ)體依賴性抗體，應(yīng)用PRV gD基因在大腸桿菌中表達(dá)的產(chǎn)物或gD基因的重組病毒載體疫苗，給小鼠或豬免疫接種，或注射gD單抗均可抵抗PRV的致死性攻擊。Heffner等[27]研究發(fā)現(xiàn)，gD基因缺失的PRV在培養(yǎng)細(xì)胞和動物體內(nèi)不會產(chǎn)生有感染性的子代病毒粒子，病毒只能通過細(xì)胞間的接觸進(jìn)行傳播，這為研制更為安全的PRV弱毒疫苗和PRV載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3.3 PRV的gB基因作用機(jī)理

糖蛋白gB屬于同源二聚體，是PRV的一種主要囊膜糖蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，對病毒的復(fù)制和感染是必需的，也是皰疹病毒中最保守的糖蛋白之一[28]。在病毒的穿入過程中可以促進(jìn)病毒包膜與細(xì)胞膜融合，同時(shí)在核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，促進(jìn)病毒粒子對外層核膜，以及感染和未感染細(xì)胞膜間的融合。gB基因DNA疫苗接種豬可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生以細(xì)胞免疫為主的免疫反應(yīng)，特別是CDs+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助記憶性T細(xì)胞反應(yīng)[29]，并可以減少動物在感染早期的排毒。

3.4 PRV的gE基因作用機(jī)理

PRV在神經(jīng)元的傳播中，gE屬于必需糖蛋白，是PRV從視網(wǎng)膜、嗅覺上皮細(xì)胞、三叉神經(jīng)節(jié)侵入中樞神經(jīng)組織所必需的[30]。研究表明，缺失gE的PRV通過嗅神經(jīng)和三叉神經(jīng)等途徑來實(shí)現(xiàn)在周圍組織的繁殖、對一級神經(jīng)元的感染以及向中央神經(jīng)系統(tǒng)的傳播等[31]，但很難引起豬中央神經(jīng)系統(tǒng)的二、三級神經(jīng)元感染。gE對PRV的毒力表達(dá)、侵襲神經(jīng)和沿著神經(jīng)傳遞等方面起著決定性的作用。Kritas等[32]于1994年報(bào)道PRV的gE缺失株不能侵入豬神經(jīng)系統(tǒng)的第二級、第三級神經(jīng)細(xì)胞，而PRV的gI缺失株卻能侵入豬神經(jīng)系統(tǒng)的第二級神經(jīng)細(xì)胞，不能侵入第三級神經(jīng)細(xì)胞，兩個(gè)缺失株表現(xiàn)了不同的生物學(xué)表型，從而認(rèn)為gE對PRV神經(jīng)親和性的影響遠(yuǎn)比gI的重要。gE/gI復(fù)合物是影響病毒生長的功能成分，并與gC之間的相互作用主導(dǎo)病毒的釋放[33]。gE、gI和gC都缺失時(shí)，病毒從細(xì)胞中釋放的能力明顯降低，這是因?yàn)間E影響細(xì)胞融合后病毒在細(xì)胞間的直接傳播，而gC使釋放的病毒吸附感染細(xì)胞的能力下降。這3種糖蛋白影響病毒的生長與釋放，具有高度的細(xì)胞特異性。由于gE缺失疫苗在病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)方面被認(rèn)為比其他單個(gè)非必需糖蛋白缺失苗更安全，不會影響病毒的復(fù)制和中和抗體的產(chǎn)生，是所有野毒株均表達(dá)的一類糖蛋白[34]。這種高度保守性表明其可以做為一個(gè)標(biāo)志性蛋白用于分子水平的診斷，區(qū)別野毒感染動物和疫苗接種動物，為清除PRV提供良好前景。

3.5 PRV其余糖蛋白作用機(jī)理

gG是由感染細(xì)胞釋放出來的非病毒子成分，常常存在于感染細(xì)胞的分泌物中，除gG外的糖蛋白均是成熟病毒粒子的結(jié)構(gòu)成分。有研究表明，gK可能阻止病毒與細(xì)胞的再次融合。PRV糖蛋白gM能抑制感染和非感染細(xì)胞間膜的融合[35]，此功能是通過從胞質(zhì)細(xì)胞膜內(nèi)化病毒糖蛋白然后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體的過程中實(shí)現(xiàn)的，gM的抑制效應(yīng)可能會促進(jìn)病毒高效地在細(xì)胞間進(jìn)行擴(kuò)散。gM蛋白對融合的抑制作用在皰疹病毒中是保守的。gH對病毒侵入細(xì)胞以及被感染細(xì)胞與鄰近細(xì)胞之間的融合是必需的[36]，gL可能與gH相互作用。PRV gH糖蛋白是第2個(gè)最保守的糖蛋白，作用類似gB糖蛋白，參與病毒的復(fù)制過程，在病毒進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞融合過程中起作用。

在皰疹病毒中首先發(fā)現(xiàn)與毒力有關(guān)的基因是編碼胸苷激酶（TK）的基因，TK基因?qū)RV的毒力影響最大[37]。TK和gE對PRV毒力的表達(dá)都具有決定性的作用。PRV TK能催化脫氧胸苷的磷酸化成為dTTP，dTTP為DNA的組成成分，從而促進(jìn)dCTP、dGTP、dATP等物質(zhì)的合成，對于確定毒力有重要作用。TK在神經(jīng)細(xì)胞等非裂解細(xì)胞中維持著病毒增殖，也有可能激活潛伏感染狀態(tài)的病毒粒子，TK-的突變病毒株幾乎可以使病毒完全喪失毒力[38]。TK基因缺失后的病毒同野毒株在培養(yǎng)細(xì)胞上增殖良好，但經(jīng)檢測其毒力和潛伏感染的能力會大幅降低，即TK屬于PRV病毒的非必需基因，但卻能保證病毒正常的生長繁殖。所以，現(xiàn)階段幾乎所有的基因工程疫苗均存在TK基因的缺失。第1代基因缺失疫苗便是PRV毒力基因TK而制得的疫苗。經(jīng)過各種動物試驗(yàn)證明TK缺失疫苗對豬有很高安全性，并能使免疫豬產(chǎn)生強(qiáng)免疫力以抵抗PRV強(qiáng)毒的致死攻擊。需要指出的是，TK基因缺失疫苗[39]與gE缺失疫苗的共同作用在于都能很好地區(qū)分免疫接種豬與自然感染豬。但是，由于TK基因?qū)儆诿傅鞍谆?，在體內(nèi)不能產(chǎn)生其相應(yīng)的抗體，因此僅缺失TK基因需采用PCR的方法區(qū)別免疫接種豬與自然感染豬[40]，而缺失gE基因則可以通過血清學(xué)檢測來加以區(qū)別。在第1代基因缺失疫苗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析，研究出了第2代基因缺失疫苗，即除了缺失一個(gè)TK基因，還缺失了一個(gè)在非編碼區(qū)的必需糖蛋白基因，或在此編碼區(qū)插入一個(gè)報(bào)告基因，這樣突變株就不能產(chǎn)生被缺失的糖蛋白，免疫動物也就不能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，此時(shí)便可通過血清學(xué)方法區(qū)別免疫接種豬與野毒感染豬，這也是第2代基因缺失疫苗的最顯著的特點(diǎn)。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的郭萬柱等[41]構(gòu)建了PRV閩A TK-/gC-、TK-/gE-等毒株。經(jīng)增殖能力、安全性、毒力穩(wěn)定性和免疫原性等測定結(jié)果表明，這些疫苗株具有較好的安全性、遺傳穩(wěn)定性和免疫原性。這些疫苗目前在全國范圍內(nèi)都被廣泛使用，并達(dá)到很好效果。經(jīng)證實(shí)，gD-/gE-/TK-PRV接種動物體內(nèi)不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生插入外源基因表達(dá)蛋白質(zhì)的抗體，而且可以抵抗PRV強(qiáng)毒的攻擊。

4 PRV毒力返強(qiáng)

目前已使用多種疫苗防止PR，如國內(nèi)的HB98、SA215和國外的Bartha-K61、Bucharest等，并且采用gE-ELISA檢測方法，給此病的防控提供了非常好的條件。但疫苗經(jīng)過一段時(shí)間的大規(guī)模使用后，自2011年起，很多疫苗出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象，很多規(guī)?；拿庖哓i場都逐漸出現(xiàn)母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等疑似偽狂犬病的臨床癥狀。2012年以來，在我國河北、河南、廣東及福建等多個(gè)省份的豬偽狂犬病基因缺失疫苗免疫豬場的發(fā)病率和病死率明顯上升，且出現(xiàn)了新的發(fā)病特征，其存在毒力返強(qiáng)的情況，由于更加難以控制，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)調(diào)查可以發(fā)現(xiàn)，這些疫病暴發(fā)為多基因亞型的豬偽狂犬病流行。哈爾濱獸醫(yī)研究所課題組檢測為PRV感染，并分離到一株變異毒株HeN1株[42]。通過綿羊和小鼠致病性試驗(yàn)表明HeN1株毒力明顯強(qiáng)于經(jīng)典強(qiáng)毒株，且通過gE基因測序分析表明為新流行的變異毒株。

4.1 PRV基因變異

由于PRV基因組GC含量高達(dá)74.9%[43]，導(dǎo)致基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜使得基因組體外擴(kuò)增極其困難。PRV存在多個(gè)毒力基因，雖然單獨(dú)毒力基因的變化并不能導(dǎo)致其毒力明顯的增加或者減弱，但是廣泛的病毒毒力基因的變異會導(dǎo)致其抗原性發(fā)生明顯變化也可能導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)。姜平[44]曾從病豬組織上分離出ZJ01病毒毒株，并發(fā)現(xiàn)此毒株發(fā)生了基因組的變異，且毒力較原來有所增強(qiáng)。其中基于ZJ01毒株生產(chǎn)的gE/gI基因缺失滅活疫苗能夠有效抵御致死量PR VZ.J01攻擊，同時(shí)gE-ELISA抗體檢驗(yàn)為陰性，用以鑒別野毒感染。

童武等[45]和范克偉等[46]分別對PRV變異毒株JS-2012和Fu-jian-LY進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典PR癥狀相比，變異毒株引起的發(fā)病率和死亡率會顯著升高，發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)為體溫上升達(dá)41℃以上，食欲廢絕，伴有明顯的神經(jīng)癥狀和腹瀉；斷奶前后仔豬主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀：咳嗽、呼吸困難、眼分泌物增多和流鼻涕等，部分豬出現(xiàn)拉稀和嘔吐等情況。PRV毒力不同，感染仔豬后在體內(nèi)的分布也有差異，PRV強(qiáng)毒感染后，病毒在全身均有分布，而中等毒力的毒株及弱毒株感染后病毒只分布于局部中樞神經(jīng)等[47]。

4.1.1 PRV變異毒株基因的變異經(jīng)TK基因氨基酸序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TK基因氨基酸序列與核苷酸序列類似，具有高度保守性，只有少數(shù)位點(diǎn)存在突變，如47位和385位的AG突變，導(dǎo)致了第16位的賴氨酸變?yōu)榱司彼?，同時(shí)129位的絲氨酸也變成了甘氨酸，這是國內(nèi)首次有關(guān)TK基因在該位置發(fā)生氨基酸替換的報(bào)道；此外，215位蘇氨酸和284位丙氨酸均突變?yōu)槔i氨酸的現(xiàn)象也可能是PRV流行株出現(xiàn)的原因[48]。以上結(jié)果的變化會影響TK蛋白主要的功能區(qū)，即ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而造成PRV毒力的變化。

通過基因組主要毒力蛋白和功能區(qū)域的遺傳進(jìn)化和抗原性變化分析來看，在病毒的囊膜糖蛋白中，gB、gC、gD和gE核酸和氨基酸序列的變異較大，存在特征性的插入和缺失，與經(jīng)典毒株的同源性較低。其中，gE基因與其他參考毒株的同源性在97.6%～99.9%，從gE基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上可以看出gE基因在進(jìn)化樹上存在兩個(gè)較大的分支。2012年新分離的毒株與之前的PRV傳統(tǒng)毒株的gE位于兩個(gè)相對獨(dú)立的分支中，與以往的分離株親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)[49]。其次，通過多序列分析表明，在gE的氨基酸序列48與496位上各插入了一個(gè)天門冬氨酸，使所有攻毒仔豬均轉(zhuǎn)為PRV gE抗體陽性[50]，因此無法根據(jù)gE來區(qū)分野毒株與疫苗株的感染。gB變異位點(diǎn)多位于B細(xì)胞表位中，并且gB基因變異較大，存在幾個(gè)特征性部位的變化，如有很多堿基的替換和缺失等，其基因組的變異導(dǎo)致多個(gè)部位的抗原指數(shù)增加，經(jīng)過遺傳演化分析可發(fā)現(xiàn)變異后的gB和其他參考株的gB位于兩個(gè)不同的分支。序列對比發(fā)現(xiàn)，gC基因存在很多點(diǎn)突變，而且還有一段不連續(xù)的堿基插入和高變區(qū)，但是在進(jìn)化樹中顯示gC基因與國內(nèi)的分離株同源性較高，所以gC基因可能和國內(nèi)其他分離株有共同的起源，不過與經(jīng)典毒株相比，也存在多個(gè)部位抗原性增加的現(xiàn)象，而通過序列分析發(fā)現(xiàn)gD基因最特征的變異就是插入了6個(gè)連續(xù)堿基。

4.1.2 PRV變異毒株蛋白的變異核衣殼蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白、外膜蛋白、被膜蛋白和調(diào)控序列區(qū)域都有不同程度的變異[51]。非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的變異主要是指與病毒復(fù)制和包裝相關(guān)的基因，以及與病毒在細(xì)胞間遷移相關(guān)的基因。有些非編碼區(qū)的調(diào)控序列也有較大變異，比如增強(qiáng)子和復(fù)制起點(diǎn)序列。研究發(fā)現(xiàn)很多部位存在較多的堿基替換，主要的結(jié)構(gòu)蛋白和功能區(qū)也發(fā)生了特征性的變化，導(dǎo)致其抗原性和某些毒力因子的強(qiáng)弱也發(fā)生了變化。

所以變異毒株毒力的差異是可能由多個(gè)因素導(dǎo)致的，整體基因組的變異導(dǎo)致其抗原性差異的變化，這些綜合因素導(dǎo)致其毒力增強(qiáng)。對這些變異的功能區(qū)域的分析為我們進(jìn)一步研究其毒力差異的變化提供材料，為以后新型基因工程缺失疫苗的開發(fā)提供依據(jù)。

5 結(jié)論與展望

偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒引起的家畜及野生動物的急性傳染病，其主要特征表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎綜合征。目前為止通過對PRV的研究可知，PRV有11種糖蛋白，其中g(shù)B、gD、gH和gL是附著在細(xì)胞表面的糖蛋白，參與囊膜與細(xì)胞膜的融合過程，是病毒體外感染和復(fù)制的必需糖蛋白。其中g(shù)B是病毒囊膜蛋白的主要組成成分，與細(xì)胞融合有關(guān)。gB、gC、gD均為刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白，是研制PRV亞單位疫苗的首選糖蛋白[52]。而最有效的中和抗體仍是gC和gD蛋白的抗體[53]。TK、gL、gG基因不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但TK和gI的存在對免疫保護(hù)有一定的輔助作用。能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)抗體的糖蛋白還有g(shù)E和gL，它們的缺失均可導(dǎo)致PRV毒力不同程度的降低，但gE和gC同時(shí)缺失將導(dǎo)致毒力極大降低。gC、gE、gG、gI、gM是病毒復(fù)制非必需的糖蛋白，其中g(shù)E是一個(gè)主要的毒力基因之一，對PRV在神經(jīng)元中的傳播起著關(guān)鍵作用，同時(shí)促進(jìn)感染細(xì)胞與鄰近非感染細(xì)胞間融合，介導(dǎo)細(xì)胞間擴(kuò)散。豬偽狂犬病病毒可以缺失與毒力相關(guān)的基因如TK、RR、gE、gL等來降低病毒毒力，也可缺失gG、gC、gD等基因以引入選擇標(biāo)記或阻止感染性病毒的產(chǎn)生，從而致弱豬偽狂犬病病毒，同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性。近期PRV出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象，某些重要的糖蛋白在多個(gè)方面存在一定程度的變異，使某些豬場的免疫豬發(fā)病異常嚴(yán)重，再次引起廣大獸醫(yī)工作者的關(guān)注。

由于PRV毒力受多基因控制，致病機(jī)理復(fù)雜，現(xiàn)已測定的病毒蛋白質(zhì)包括TK和囊膜上的11種糖蛋白，與病毒毒力都存在一定的關(guān)系，尤其是近期PRV流行毒株出現(xiàn)多個(gè)基因的變異點(diǎn)，如堿基的缺失或者插入，都會影響病毒毒力與疫苗的免疫效應(yīng)[54]，所以目前研究PRV的致病機(jī)理以及其變異株的特征顯得十分關(guān)鍵。在進(jìn)一步揭示PRV基因組結(jié)構(gòu)和功能、基因表達(dá)調(diào)控及其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)理的基礎(chǔ)上構(gòu)建新的缺失突變株疫苗和發(fā)展雙價(jià)或多價(jià)載體疫苗將是今后豬偽狂犬病疫苗發(fā)展的主要方向。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展和基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，期望豬偽狂犬病疫苗的研究在不久的將來會有更進(jìn)一步的突破。

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（編輯：郭玉翠）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0121-06

2016-08-16

國家“十二五”國家科技支撐計(jì)劃（No.2013BAD12B04）

冷依伊（1993-），女，四川成都人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯游飩魅静〔≡肿由飳W(xué).E-mail：18283581287@163.com

王?。?968-），男，四川成都人，博士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)的研究工作.E-mail：yaanwangyin@tom.com