李明波，宋忠旭，董斌科，孫華，雷斌，郭銳，梅書棋

（湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430209）

豬流行性腹瀉的流行特點、診斷和防控技術

李明波，宋忠旭，董斌科，孫華，雷斌，郭銳，梅書棋

（湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430209）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種豬的高度接觸性傳染病，感染豬以急性腸炎、水樣腹瀉、嘔吐為主要特征。20世紀80年代我國首次報道并鑒定豬流行性腹瀉病毒，隨后該病毒成為引起豬病毒性腹瀉的常見病毒。2010年底，由PEDV變異毒株引起的PED大規(guī)模暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經濟損失。文章主要針對當前PED在我國的流行情況、診斷技術、疫苗和防控策略等方面進行闡述，以期給該病的防控提供借鑒和參考。

豬流行性腹瀉；流行情況；診斷技術；防控

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的豬的腸道傳染病，不同年齡階段的豬都可感染，本病對初生仔豬的危害最大，5日齡以內的仔豬，由于腹瀉和嘔吐而造成的嚴重脫水，發(fā)病率和死亡率可達100%。自2010年以來，我國10多個省市和地區(qū)大范圍暴發(fā)了豬流行性腹瀉，導致大量的新生仔豬死亡，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失。經大量的病原學和流行病學研究證實，引起此次腹瀉的病原主要為PEDV變異毒株[1-2]。

1 PED的流行情況

PED于1971年首次在歐洲發(fā)現，1976年在比利時分離得到第一株病毒，命名為冠狀樣病毒CV777株[3]。1992年以后在韓國和日本暴發(fā)，PEDV陽性檢出率為50.4%（1 258例）[4]。在中國，PEDV于1982年首次被分離，自20世紀90年代以來，PED在中國26個主要城市和地區(qū)養(yǎng)豬場連續(xù)暴發(fā)，造成全國養(yǎng)豬業(yè)巨大的經濟損失。

2010年10月，中國南方部分地區(qū)開始大規(guī)模暴發(fā)PED疫情，短期內疫情迅速擴散至全國，即使在疫苗免疫過的豬場，哺乳仔豬也未能獲得保護，患病仔豬主要表現為黃色水樣腹瀉、消瘦和脫水死亡，隨后經過病毒全基因組測序證實導致本次PED大規(guī)模暴發(fā)的病原為PEDV變異毒株[5-6]；楊漢春等也于2011年在我國部分地區(qū)15個豬場采集腹瀉仔豬的臨床樣本234份，得出PEDV陽性率為82.1%，TGEV陽性率為5.6%，該研究表明豬流行性腹瀉病毒是引起仔豬腹瀉的最主要病原，以纖突蛋白編碼基因（S基因）出現缺失、插入和突變?yōu)樘卣鞯淖儺惗局旰蛡鹘y(tǒng)CV777毒株共存，而傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和輪狀病毒（ARV）在不同地區(qū)的感染水平有所差異。2013年PEDV變異毒株首次在美國流行，并蔓延到加拿大和墨西哥，現在PEDV已經在歐洲、亞洲、美洲等多個國家廣泛流行。

2 中國流行PEDV的分子特征

PEDV與TGEV同屬冠狀病毒，屬有囊膜單股正鏈RNA病毒，長約28 kb，全基因組包括5'非編碼區(qū)（UTR），3'UTR，至少7個開放閱讀框（ORF），編碼4個結構蛋白（S、E、M、N）和3個非結構蛋白（復制酶la和lb，以及ORF3），基因組上的順序為5'-復制酶（la/lb）-S-ORF3-E-M-N-3'[7]。在PEDV基因遺傳進化分析中，尤其以S蛋白、N蛋白、M蛋白和ORF3研究得最多。

為了分析PEDV毒株的遺傳背景，研究者通過對PEDV全基因組進行進化樹分析，將PEDV毒株分為G1（經典毒株）和G2（新型毒株）兩個基因型，G1和G2分別含有兩個亞型G1a、G1b和G2a、G2b。G1包括經典毒株、疫苗株及其它細胞適應培養(yǎng)株等，主要以CV777、LZC、SM98為代表的經典株，其它還包括韓國DR13弱毒株和國內早期分離的毒株；G2則均為2010年以后國內分離的PEDV變異毒株和北美新分離的PEDV變異株。李文濤等根據PEDV S基因進行核苷酸同源性分析發(fā)現，PEDV同群間核苷酸相似性從95.1%～100%不等，不同群間相似性從88.7%～96.7%不等[8]。相對于CV777等經典毒株，目前中國主要流行的PEDV毒株已經發(fā)生了較大變異，通過比較PEDV變異毒株與經典毒株的編碼基因發(fā)現，變異病毒的S基因（尤其是S1區(qū)）變化最大，變異株與經典株CV777相比，S1區(qū)域（1～2 217 nt）主要存在3個插入區(qū)域和一個缺失區(qū)域。通過序列分析發(fā)現，PEDV具有遺傳多樣性，同時也證明新型病毒可通過重組機制產生。此外，比較PEDV變異株和經典毒株S1的抗原中和表位發(fā)現，3個重要表位均發(fā)生突變，表明現行使用的經典株的滅活或弱毒疫苗均不能提供很好的保護[9]。

3 PED發(fā)病機理及臨床特征

PEDV通常首先感染養(yǎng)殖場陰性肥育或后備豬，累積的病毒感染懷孕母豬使之帶毒，然后傳至產仔舍，隨后亞臨床感染的母豬最終傳染給哺乳仔豬。根據筆者最近觀察，部分養(yǎng)殖場哺乳仔豬發(fā)生腹瀉時，母豬往往不表現出明顯的腹瀉癥狀，這可能與母豬本身免疫過疫苗或者感染的PEDV毒力有關。

PEDV感染豬體后首先在小腸絨毛上皮細胞增殖，造成線粒體損傷腫脹和營養(yǎng)物質吸收不良，進而引發(fā)上皮細胞損傷脫落，腸絨毛萎縮及吸收面積減小，最終導致滲出性脫水死亡。臨床上表現為新生哺乳仔豬水樣腹瀉、凝乳性嘔吐及脫水，10日齡仔豬感染出現腹瀉2～4天后，死亡率50%～100%。產房呈跳躍式傳播，頭胎和低胎齡母豬所產仔豬發(fā)病率較高，生物安全較差的養(yǎng)殖場哺乳仔豬可能會出現反復感染PEDV的現象；日齡較大的豬發(fā)病1周后可自然康復，死亡率低，但可導致體重下降和飼料利用率下降[10]。

消化道傳播是PED主要的但并不是唯一的傳播途徑。王新平等發(fā)現，PEDV可在呼吸道內復制，經呼吸道分泌物向外排毒后感染易感豬群[11]。除了常規(guī)的糞口途徑傳播，PEDV還可通過感染母豬乳汁等途徑傳播。此外，PEDV的傳播媒介還包括運輸車輛、未經嚴格消毒的生產用具、筒靴、衣物、病毒污染的水源、飼料（血漿蛋白）、燕八哥、蒼蠅等。PEDV潛伏期較短，豬只從接觸病毒到表現出臨床癥狀只需12～24小時，排毒周期一般為3～4周。

Hesse等給4周齡豬口鼻接種PEDV后，研究了病毒的組織定位、排毒方式、攜帶、抗體應答和氣溶膠傳播等發(fā)現，接種后21天大部分豬的糞便拭子和鼻拭子檢測都為陰性，有些豬排毒時間可持續(xù)到接種后的35天；經免疫組化檢測發(fā)現，豬只氣管、肺臟和支氣管淋巴結、脾臟等其它內臟組織均為PEDV陰性。

4 PED的診斷技術

4.1 PEDV病原學診斷

流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的臨床癥狀相似，乳豬均表現嘔吐、水樣腹瀉至脫水酸中毒死亡（糞便腥臭），因此在實驗室對PEDV進行鑒別檢測是非常有必要的。一般采集剛發(fā)病仔豬的糞便和腸道內容物、母豬乳汁進行病原學鑒別診斷，診斷方法主要包括免疫熒光（IF）、免疫組化技術、電鏡觀察、RT-PCR（熒光定量）等。

PEDV變異毒株雖然在S基因上變化顯著，但在M基因上還是相對保守，針對M基因的診斷方法依然有效。如張坤等建立了針對PEDV M基因、TGEV N基因、ARV（輪狀病毒）VP7基因的多重RT-PCR檢測方法[12]。近年來，國內外學者基于PEDV S、ORF3、M基因陸續(xù)開展了針對流行性腹瀉變異毒株和經典毒株的鑒別診斷及熒光定量RTPCR診斷技術的研究，為豬急性腸炎病毒的檢測提供了快速、敏感的實驗室診斷方法[13-14]。同時，基于N、M蛋白的單克隆抗體技術ELISA（酶聯免疫吸附試驗）檢測方法也得到了初步應用，但該方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性等方面還需要進一步研究。

4.2 血清學診斷技術

血清學方法是另外一種有效監(jiān)測豬群中PEDV的手段，目前間接免疫熒光試驗（IFA）和中和抗體試驗是常用的血清學方法?；赑EDV S基因的S1部分，Gerber等用建立的S1-ELISA方法對239個場的血清樣品進行檢測，診斷的敏感性為100%，特異性為94%。進一步研究表明，豬只抗PEDV的IgA、IgG抗體含量在人工接種PEDV后3～4周逐漸減少，IgA抗體用于監(jiān)測體液免疫應答的特異性更高，可有效反映PEDV被動免疫保護能力。國內學者丁振江等也建立了基于PEDV S1D蛋白為包被抗原的IgA-ELISA抗體檢測方法，為臨床評價母源黏膜抗體保護力提供了基礎[15]。

5 PED的免疫預防

5.1 PED疫苗

國內最先研制的PED疫苗是組織滅活苗。1995年，馬思奇等研制了商品化的PEDV和TGEV二聯滅活疫苗，該二聯苗能夠有效地預防TGEV和PEDV的感染，經后海穴注射，TGEV和PEDV主動免疫的保護率分別可達100%和92%，被動免疫的保護率可達87.9%和84.2%。1998年，佟有恩等研制了PEDVTGEV弱毒二聯苗，主動免疫與被動免疫的保護率為97.7%和98%。這兩種商品化疫苗使用的PEDV毒株是CV777株，在2010年前，這兩種疫苗為控制PEDV和TGEV的傳播發(fā)揮了重要作用。從2010年至今，我國豬場廣泛采用自家疫苗、商品化疫苗和返飼等方式來控制PED的暴發(fā)，但效果并不理想，主要是缺乏對PEDV變異株的免疫機理和致病性的了解。

1997年以來，日本和韓國先后在Vero細胞上傳代培養(yǎng)開發(fā)了PEDV弱毒疫苗（P5-V和DR13株），試驗表明弱毒疫苗通過口服比肌注效果更好，因為口服疫苗后仔豬的死亡率相對于肌注的要低，并且抗體水平要高得多。2013年，美國研制使用了兩種PEDV滅活疫苗，結果表明該疫苗免疫4周齡的仔豬后可誘導較強的體液免疫。

2015年，中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所研制的TGEV（H弱毒株）、PEDV（CV777弱毒株）和ARV（G5型）三聯活疫苗開始應用于臨床豬場。鑒于目前流行的PEDV變異株與經典毒株存在較大差異，因此有必要針對流行的變異毒株研制新的疫苗。當前中國研究者開始以PEDV變異毒株為基礎，初步研制了滅活和弱毒疫苗，動物試驗結果顯示，兩種疫苗能對PEDV變異毒株提供很好的免疫保護。

新型疫苗方面，我國研究者徐麗麗等開展了PEDV重組減毒的沙門氏菌口服疫苗的研究，Liu等構建了表達PEDV-N基因或S1基因的重組乳酸桿菌，研究表明口服后能有效刺激仔豬腸道產生黏膜免疫應答。這些研究為研制更高效的PEDV口服疫苗奠定了基礎[16]。

5.2 PED的免疫措施

由于PEDV是腸道病毒，黏膜免疫在抵抗PEDV的感染中發(fā)揮著重要作用，因此通過消化道給予疫苗免疫（主動和被動免疫），以此激發(fā)腸道黏膜免疫（尤其是sIgA抗體的產生）應是預防該病的最佳選擇。當前PEDV疫苗和免疫仍然存在一些問題：一是滅活疫苗肌注后只能誘導乳腺產生低滴度的IgG，并且IgG持續(xù)時間短，不能產生有效的黏膜免疫（IgA）抗體和細胞免疫反應，可在活病毒感染或弱毒苗接種后，利用新毒株制備的疫苗重復接種增強其免疫保護效果；二是PEDV在Vero細胞上培養(yǎng)困難，導致弱毒疫苗滴度低，其次弱毒疫苗口服后在豬胃腸道增殖能力下降，產生保護力有限。

鑒于目前PEDV的特點和當前疫苗免疫效果，可以使用低代次的PEDV口服免疫的同時結合變異株的自家疫苗（由有資質的科研院所制備）或滅活疫苗進行聯合免疫種母豬，可以達到較好的免疫效果。

6 PED的臨床控制

6.1 緊急控制措施

豬場發(fā)生PEDV疫情時應及時確診并采取有效措施，一是發(fā)病肥育豬或后備豬棟舍應隔離和封鎖，避免病毒在場內擴散。二是對產前4周以上妊娠母豬可緊急接種疫苗，4周以內母豬轉入單獨產房（消毒干燥），已感染PEDV的產房哺乳母豬及小豬由專人護理，并作隔離處理，停止疫苗注射等工作。三是對10日齡以內豬只實行人工乳喂養(yǎng)和同一產房內未發(fā)生腹瀉健康母豬的寄養(yǎng)，脫水嚴重的仔豬應及時淘汰處理。四是日齡較大仔豬及時轉出產房，進行補液治療，或在料槽中補充口服補液鹽水和蒙脫石散類吸附劑，并對發(fā)病豬舍隔離、徹底消毒干燥及空欄凈化。

6.2 日常預防措施

加強飼養(yǎng)管理，減少環(huán)境應激，提升母乳（初乳）質量和水平。穩(wěn)定控制產房和保溫箱的溫、濕度。免疫控制PCV2、凈化豬場偽狂犬病和豬瘟等疾病。對出生1～3天仔豬可口服微生態(tài)和免疫因子復合制劑。強化隔離和生物安全措施，豬場人員及進出車輛嚴格消毒以及對發(fā)病豬的無害化處理等，選用敏感的消毒劑（如戊二醛噴霧、甲醛熏蒸等），豬舍外部環(huán)境（趕豬通道、上豬臺、糞道等）潑撒生石灰或燒堿消毒。產房消毒后保持干燥至少7天以上再轉入下一批次豬。

7 展望

當前PED仍然是嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。由于PEDV具有高度變異的特性，發(fā)生病毒性腹瀉疫情的豬場可能是多種病原并存，這給PED的診斷、疫苗研制及臨床防控帶來了極大的挑戰(zhàn)。隨著PEDV變異毒株的廣泛流行，關于PEDV的基礎研究在國內外也得到了快速推進，目前我國已解析了60多株PEDV的全基因組及其遺傳特征，并開展了PEDV分子流行病學、病毒的增殖培養(yǎng)特性、感染和致病機理、病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用等方面的研究，將有助于今后PED診斷試劑、新型疫苗和臨床防控技術的研發(fā)，為預防和控制PED的傳播發(fā)揮重大作用。

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（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0089-03

2016-06-28

科技部科技支撐計劃“優(yōu)良種豬高效利用關鍵工程化技術集成與示范”（2014BAD20B01）；農業(yè)部國家生豬產業(yè)技術體系武漢綜合試驗站項目（CARS-36）；十三五創(chuàng)新團隊項目（2016-620-004-001）

李明波（1982-），男，湖北宜都人，助理研究員，碩士，研究方向為豬傳染病的病原學診斷和臨床防控技術. E-mail：lmb409@126.com

梅書棋，研究員，研究方向為豬遺傳育種. E-mail：msqlfe@163.com