房樹(shù)標(biāo)，王永輝，李艷彥，周 然△

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065;2.山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024)

基于NLRP3炎性體信號(hào)通路研究桂枝芍藥知母湯對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞炎性信號(hào)表達(dá)的影響*

房樹(shù)標(biāo)1，2，王永輝2，李艷彥2，周 然2△

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065;2.山西中醫(yī)學(xué)院，太原 030024)

目的:基于NLRP3炎性體(NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 inflammasome)信號(hào)通路觀察桂枝芍藥知母湯(GD)對(duì)尿酸鈉誘導(dǎo)的大鼠巨噬細(xì)胞炎性信號(hào)表達(dá)的影響，以期探明其抗炎作用機(jī)制。方法:大鼠30只按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組各6只，GD高、中、低劑量組(4、8、16 g·kg－1)、秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組(3×10－4g·kg－1)均灌胃給藥，正常組給予等容積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d，最后1次灌胃1 h后所有大鼠乙醚麻醉取血清備用。SD雄性大鼠20只，參照文獻(xiàn)方法提取分離大鼠巨噬細(xì)胞接種培養(yǎng)12 h。細(xì)胞試驗(yàn)分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(不加受體抑制劑，加NALP3受體抑制劑)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均含6個(gè)組，正常對(duì)照組加入正常大鼠血清，模型對(duì)照組、高、中、低劑量組、秋水仙堿組全部滴加200 μg·L－1的尿酸鈉混懸液造模，同時(shí)滴加含藥血清置于 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 2 h取出。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定炎性因子白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)、白介素-6 (interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-a，TNF-α)的表達(dá)，DNA-蛋白質(zhì)互作ELISA(DPI-ELISA)方法檢測(cè)核因子－KB(nuclear factor-kappa B，NF-KB)活性;Western免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、半胱天冬酶-12(Csapase-12)信號(hào)銜接蛋白表達(dá)水平;逆轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription-PCR，RTPCR)觀測(cè)NLRP3炎性體mRNA的表達(dá)。結(jié)果:細(xì)胞造模12 h后與正常組比較，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、NFKB、ASC、NALP3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，Csapase-12表達(dá)水平明顯降低;與模型組比較，給藥各組 IL-1β、IL-6、TNF-α、NALP3 mRNA及GD中、高劑量組NF-KB、ASC表達(dá)均明顯降低，GD高劑量組Csapase-12表達(dá)明顯升高，而秋水仙堿組Csapase-12表達(dá)無(wú)明顯增加。結(jié)論:GD抗炎作用機(jī)制可能與降低巨噬細(xì)胞NLRP3、ASC表達(dá)、抑制IL-1β分化成熟及NF-KB活化、降低NLRP3炎性體信號(hào)通路炎性因子表達(dá)有關(guān)。與秋水仙堿不同的是，GD能夠增加Capase-12表達(dá)，負(fù)反饋抑制NLRP3炎性體信號(hào)通路炎性因子表達(dá)，提示GD治療GA新的抗炎機(jī)制。在加入NALP3受體抑制劑下，GD仍能降低模型大鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α、NF-KB表達(dá)，提示GD可以通過(guò)另外信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

桂枝芍藥知母湯;巨噬細(xì)胞;NLRP3炎性體;信號(hào)通路

近年來(lái)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis GA)在我國(guó)的發(fā)病率明顯升高，嚴(yán)重影響著人們的工作及身心健康。治療GA常規(guī)用藥非甾類抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素有嚴(yán)格的禁忌癥和明顯的毒副作用。因此，從中醫(yī)學(xué)中發(fā)掘療效確切、副作用少的GA治療方藥具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。桂枝芍藥知母湯(GD)出自《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、滋陰清熱之功效。主治風(fēng)寒濕痹日久，漸次化熱傷陰之風(fēng)濕歷節(jié)，非常切合GA的病因病機(jī)，在臨床治療GA取得很好的療效。研究［1-2］發(fā)現(xiàn)，桂枝芍藥知母湯(GD)具有較好抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，能有效控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本課題組擬以尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞為模型，觀察GD對(duì)模型大鼠巨噬細(xì)胞 NALP3炎性體 mRNA以及炎性因子TNF-α、IL-1β等表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探明 GD的藥效作用機(jī)制，為GD治療GA的臨床應(yīng)用及新藥開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品

桂枝芍藥知母湯煎劑組成:桂枝12 g，白芍9 g，甘草6 g，麻黃6 g，生姜15 g，白術(shù)15 g，知母12 g，防風(fēng)12 g，炮附子12 g。藥材購(gòu)自湖北金藥堂大藥房有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳科力教授鑒定，均符合2010版藥典要求。原方參照傳統(tǒng)水煮工藝加工成煎劑，濃縮成濃度為1.25～1.30(80℃)的浸膏約40 ml，相當(dāng)于含生藥2 g·mL－1，給藥前可根據(jù)需要適當(dāng)稀釋。秋水仙堿由西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)(批號(hào)140706)。

1.2 動(dòng)物

健康雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(合格證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005)，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.3 試劑

尿酸鈉(MSU)(上海谷研生物科技有限公司，批號(hào)6519R416)，取MSU 0.1 g研成細(xì)粉，加生理鹽水適量研磨，并稀釋至500.0 ml，配制成濃度為200 mg·L－1的尿酸鈉混懸液;細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào) P0027);基于dsDNA修飾微孔板類 ELISA試劑盒(Abnova，96T，批號(hào)0465441);細(xì)胞RIPA裂解液(P1003B，碧云天生物技術(shù)有限公司);cooktail蛋白酶抑制劑(ROCHE，批 號(hào) 04693132001);異 甘 草 素Isoliquiritigenin(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)10082);DMEM培養(yǎng)基(低糖)500ML(HyClone，批號(hào)NZL1272);胎牛血清100ML(浙江天杭生物科技股份有限公司，四季青，批號(hào)150119);0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液;瑞氏-吉姆薩染色液(百奧斯生物科技有限公司);大鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液 KIT200ML(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號(hào)LTS1083);磷酸緩沖鹽溶液(Pbs，自配)，二抗試劑盒(Dako REALTM EnVision TM Detection System，Peroxidase/DAB+，Rabbit/MouseCode K5007);正常山羊血清(武漢博士德，批號(hào)AR1009);兔抗大鼠ASC、Csapase-1亞型抗體(一抗:武漢博士德生物工程有限公司)、羊抗兔酶標(biāo)抗體(二抗，武漢科瑞生物技術(shù)有限公司);大鼠 beta-actin抗體(天津三箭，批號(hào)KM9001);化學(xué)發(fā)光試劑ECL(碧云天生物有限公司，批號(hào) P0018);BCA蛋白定量試劑盒(艾德來(lái)，批號(hào)PP0102);PageRuler prestained protein ladder (Thermo，批號(hào) 26616);硝酸纖維素膜(PVDF膜) (Millipore，IPVH00010);曝光膠片(Kodak，XBT-1);顯影定影液(Kodak，批號(hào)6610190);其他ELISA檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于武漢博士德);焦碳酸二乙酯 DEPC (美國(guó)Amresco，E174);TRIzol?試劑(Invitrogen，批號(hào)15596026);逆轉(zhuǎn)錄酶 (fermentas，批號(hào)EP0442);引物dNTP(fermentas，批號(hào)R0191);RNA酶抑制劑(fermentas，E00381);快速定量PCR試劑盒(KAPA，KK4605);TBS、檸檬酸、鹽酸酒精等試劑(湖北百奧斯生物科技有限公司配制)。

1.4 儀器

RT6100酶標(biāo)儀(美國(guó)雷杜)，PRO200勻漿器(美國(guó))，低溫高速離心機(jī)(美國(guó) Beckman Coulter公司);迷你電泳槽 DYZC-24DN(北京六一);超凈工作臺(tái)(YJ-875型，蘇州凈化設(shè)備廠);二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-15A型，日本三洋公司);倒置顯微鏡(CX-31型，日本奧林巴斯公司);電子分析天平(HR-120型，德國(guó)塞多利斯公司);細(xì)胞培養(yǎng)板(40106，Cyagen Biosciences Inc);低速臺(tái)式離心機(jī)(TDL-50B型，上海安亭科學(xué)儀器廠);電泳儀(041BR126007型，BIO-RAO);低溫離心機(jī)(Til-16G型 上海安亭科學(xué)儀器廠);Real time-PCR儀(ABI stepone plus)。

2 方法

2.1 含藥血清制備

取健康雄性SD大鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、桂枝芍藥知母湯高、中、低劑量組、秋水仙堿對(duì)照組(均用正常大鼠給藥)5組。各組灌胃給予相應(yīng)藥物溶液，正常對(duì)照組灌胃給予純水，桂枝芍藥知母湯低、中、高劑量組用藥劑量(相當(dāng)生藥)分別為4、8、16 g·kg－1，秋水仙堿對(duì)照組用藥劑量為3×10－4g·kg－1，連續(xù)給藥7 d。各組試驗(yàn)動(dòng)物最后1次灌胃1 h后乙醚麻醉，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h以上，1500 r·min－1，離心15 min后取血清，56℃，30 min滅活、分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大鼠巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng)及給藥

健康SD雄性大鼠20只，參照文獻(xiàn)［3］方法提取分離大鼠巨噬細(xì)胞，孵育12 h后換液以去掉少數(shù)未貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞消化后均勻分組接種在6孔板(用于免疫印跡 Westblot和 RT-PCR檢測(cè))和24孔板(用于ELISA檢測(cè))內(nèi)，細(xì)胞濃度分別為1.2×106·mL－1和1.0×105·mL－1。細(xì)胞試驗(yàn)分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(不加受體抑制劑，全部加10 μl NALP3受體抑制劑-異甘草素10 μg·mL－1)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均含6個(gè)組(正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、秋水仙堿組)，每組平行4孔，除正常對(duì)照組加入正常大鼠血清外，其余組全部滴加200 mg· L－1的尿酸鈉混懸液造模，同時(shí)滴加含藥血清及細(xì)胞培養(yǎng)液，置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃、濕度100%、體積分?jǐn)?shù)5%CO2)孵育2 h后取出培養(yǎng)板備測(cè)。

2.3 巨噬細(xì)胞 IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB活性表達(dá)

各組細(xì)胞取上清液，按ELISA法檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α;用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞核蛋白，參照DPI-ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè) NF-KB活性。

2.4 巨噬細(xì)胞中ASC、Csapase-12蛋白表達(dá)

取適量裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)按1 ml裂解液中加10 ul蛋白酶 cocktail。各組細(xì)胞倒掉培養(yǎng)液，加入4℃預(yù)冷的 PBS，平放輕輕搖動(dòng)洗滌細(xì)胞，然后棄去PBS洗滌2次。將培養(yǎng)皿置于冰上，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞RIPA裂解液150 μL，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。冰上孵育15 min，中間搖動(dòng)培養(yǎng)皿3次，移液管吸取溶解產(chǎn)物至預(yù)冷的微量離心管內(nèi)，4℃、12000 r·min－1離心5 min。小心吸取上清液至冷凍管，移入－20℃低溫冰箱中保存，用于免疫印跡 Westblot檢測(cè)。顯色條帶以 Quantity One 4.62版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)定各組IOD。

2.5 巨噬細(xì)胞中NALP3 mRNA的表達(dá)

參照文獻(xiàn)方法提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè) RNA純度及完整性，制備c DNA，－20℃保存。

表1顯示，RT-PCR反應(yīng):引物由 primer5.0軟件設(shè)計(jì)，并由英俊公司合成。引物的配制:將引物瞬時(shí)離心，粉末沉到管底。按照說(shuō)明書(shū)加入去離子水加蓋混勻，配成100 uM/L的貯存液;另取EP管，將上、下游引物稀釋為10.0 uM/L終濃度的工作液; cDNA的配置:將cDNA從冰箱中取出，加入適量的去離子水稀釋至合適的濃度;反應(yīng)條件:95℃ 3min，95℃ 3 s，目的基因退火溫度30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃30 s，72℃ 10 min，4℃ 保存，結(jié)果處理采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

表2 反應(yīng)體系

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用LDS單因素方差分析，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況觀察

鑒于細(xì)胞受體及信號(hào)銜接蛋白表達(dá)在炎性因子表達(dá)之前，故采用炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6、NFKB的表達(dá)值作為細(xì)胞造模指標(biāo)。預(yù)先配制 500、300、200、100、50 mg·L－1濃度的尿酸鈉混懸液，分別取2、4、8、12、24 h 5個(gè)時(shí)間段摸索尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞造模。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，200 mg·L－1的尿酸鈉酸混懸液造模2 h后，除空白組外其余5組細(xì)胞均出現(xiàn)IL-1β、TNF-α、IL-6、NF-KB表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞造模成功。

3.2 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞 IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB表達(dá)的影響

表3、4顯示，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組與正常組比較，模型組大鼠巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，給藥各組IL-1β、IL-6、TNF-α及GD高、中劑量組NF-KB表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，NALP3受體抑制劑明顯減少了各組巨噬細(xì)胞 IL-1β的表達(dá)，但對(duì) TNF-α、NFKB活性無(wú)明顯影響。

表3 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB表達(dá)的影響(±s)

表3 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB表達(dá)的影響(±s)

注:與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05，(表4～6同)

組別/不加受體抑制劑 鼠數(shù) 劑量/g·kg－1活性正 常 對(duì) 照 組 10 — 126.27±1.762) 0.97±0.042) 358.23±43.482) 0.258±0.0052)IL-1β /ng·L－1IL-6 /μg·L－1TNF-α /ng·L－1 NF-KB模 型 對(duì) 照 組 10 — 356.98±2.151) 1.84±0.031) 625.81±21.031) 0.314±0.0051)GD 低 劑 量 組 10 4 333.00±3.65 1.79±0.08 487.53±32.832) 0.303±0.003 GD 中 劑 量 組 10 8 281.30±3.412) 1.73±0.14 454.89±35.082) 0.295±0.001 GD 高 劑 量 組 10 16 270.62±1.572) 1.58±0.062) 452.47±20.302) 0.286±0.0052)秋 水 仙 堿 組 10 3×10－4 262.78±3.712) 1.71±0.012) 394.81±30.152) 0.278±0.0032)

表4 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB表達(dá)的影響(±s)

表4 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-KB表達(dá)的影響(±s)

組別/加NALP3抑制劑 鼠數(shù) 劑量/g·kg－1活性正 常 對(duì) 照 組 10 — 115.83± 1.602) 0.95±0.072) 386.14±39.712) 0.261±0.0022)IL-1β /ng·L－1IL-6 /μg·L－1TNF-α /ng·L－1 NF-KB模 型 對(duì) 照 組 10 — 249.22± 7.421) 1.84±0.021) 587.47±27.631) 0.308±0.0041)GD 低 劑 量 組 10 4 191.02± 2.752) 1.73±0.07 512.86±33.452) 0.300±0.002 GD 中 劑 量 組 10 8 186.06± 1.982) 1.54±0.072) 498.94±26.352) 0.296±0.0052)GD 高 劑 量 組 10 16 160.83±10.742) 1.40±0.102) 511.23±20.622) 0.287±0.0042)2)秋 水 仙 堿 組 10 3×10－4 154.72±13.112) 1.84±0.09 455.36±19.312) 0.280±0.0012)2)

3.3 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中 ASC、Csapase-12蛋白表達(dá)的影響

圖1表5顯示，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組與正常組比較，模型組大鼠巨噬細(xì)胞中 ASC表達(dá)水平明顯升高，Csapase-12表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。與模型組比較，秋水仙堿組及GD高、中劑量組ASC表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，GD高劑量組Csapase-12表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而秋水仙堿組 Csapase-12表達(dá)無(wú)明顯增加(P＞0.05)。

圖1 大鼠巨噬細(xì)胞中ASC、Csapase-12蛋白Westblot電泳條帶

表5 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中ASC、Csapase-12蛋白表達(dá)的影響(±s)

表5 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中ASC、Csapase-12蛋白表達(dá)的影響(±s)

組ASC/β-actin Csapase-12/β受體抑制劑正 常 對(duì) 照 組 10 — 0.71±0.062) 0.62±0.112) 1.56±0.152) 1.53±0.032)別 鼠數(shù) 劑量/g·kg－1-actin不加受體抑制劑 加NALP3受體抑制劑 不加受體抑制劑 加NALP3模 型 對(duì) 照 組 10 — 1.15±0.121) 1.05±0.131) 1.21±0.071) 1.03±0.071)GD 低 劑 量 組 10 4 1.03±0.04 0.81±0.022) 1.05±0.04 0.65±0.08 GD 中 劑 量 組 10 8 0.85±0.032) 0.51±0.052) 1.38±0.122) 1.05±0.13 GD 高 劑 量 組 10 16 0.71±0.052) 0.46±0.042) 1.41±0.132) 1.24±0.162)秋 水 仙 堿 組 10 3×10－4 0.62±0.062) 0.38±0.032) 0.63±0.04 0.38±0.182)

3.4 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中巨噬細(xì)胞中NALP3 mRNA表達(dá)的影響

表6顯示，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組與正常組比較，模型組大鼠巨噬細(xì)胞中NALP3 mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，給藥各組NALP3 mRNA的表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，NALP3受體抑制劑明顯抑制各組巨噬細(xì)胞的NALP3 mRNA表達(dá)。

4 討論

“NLRP3炎性體信號(hào)通路”中 NLRP3是 NOD樣受體之一NLRP蛋白家族中的一個(gè)典型代表，是固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體的一類重要感受器，廣泛參與對(duì)病原相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的識(shí)別，同時(shí)也可以感知內(nèi)源性損傷相關(guān)的分子模式(damage associatedmolecular patterns，DAMPs)，引起相應(yīng)的炎癥反應(yīng)［4］。當(dāng)NLRP3識(shí)別的配體直接或間接地結(jié)合于亮氨酸重復(fù)序列 (leucine-richrepeat，LRR)時(shí)，NLRP3被活化且構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域 (nucleotide binding oligomerization domain，NOD)，亦稱NACHT結(jié)構(gòu)域，并通過(guò) ATP聚合形成高度有序的 NLRP3蛋白寡聚體。隨后通過(guò)其效應(yīng)結(jié)構(gòu)域 PYD募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC和帶有半胱天冬酶活化募集結(jié)構(gòu)域(caspase activiting andrecruitment domain，CARD)的 caspase-1，形成復(fù)雜的復(fù)合物即 NLRP3炎性體［5］。ASC的CARD與caspase-1的 CARD區(qū)相互作用?；罨腸aspase-1也稱白細(xì)胞介素 IL-1β轉(zhuǎn)化酶，可以誘導(dǎo)激活I(lǐng)L-1β前體，并將 IL-1β的前體在天冬氨酸裂解，形成活化的成熟lL-1β分泌到細(xì)胞外，產(chǎn)生各種免疫反應(yīng)［6］。

表6 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中NALP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量影響(±s)

表6 GD含藥血清對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞中NALP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量影響(±s)

組NALP3 IOD/加NALP3受體抑制劑正 常 對(duì) 照 組 10 — 1.03±0.042) 1.09 ±0.052)別 鼠數(shù) 劑量/g·kg－1NALP3 IOD/不加受體抑制劑模 型 對(duì) 照 組 10 — 3.88±0.311) 1.81 ±0.111)GD低劑量組 10 4 2.81±0.282) 1.42 ±0.142)GD中劑量組 10 8 2.36±0.212) 1.06 ±0.082)GD高劑量組 10 16 1.37±0.122) 0.77 ±0.032)秋 水 仙 堿 組 10 3×10－4 1.05±0.012) 0.73 ±0.022)

MSU晶體是痛風(fēng)的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素，同時(shí)也是NLRP3炎性小體的激動(dòng)劑。尿酸鹽晶體被巨噬細(xì)胞吞噬后可能通過(guò)促進(jìn)鉀離子外流［7］和誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生大量活性氧ROS［8-9］，使NLRP3炎性體活化，激活Caspase-1，分解無(wú)活性的 IL-1前體(pro-IL-1β)，分泌和釋放成熟的 IL-1β［10-11］，活化的 IL-1β被靶細(xì)胞(如滑膜細(xì)胞)上的 IL-1受體結(jié)合，激活炎癥轉(zhuǎn)錄因子(如 NF-κB)，生成大量炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-6［12］等，進(jìn)一步加重其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［13］。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中先用大鼠含尿酸鈉血清造模干預(yù)巨噬細(xì)胞，分別取30 min及1、2、4、8、12 h共6個(gè)時(shí)間段摸索尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞造模。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模12 h后細(xì)胞IL-1β表達(dá)均無(wú)明顯升高，表明含尿酸鈉血清誘導(dǎo)大鼠巨噬細(xì)胞造模不成功。考慮痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是沉積到關(guān)節(jié)中的尿酸鈉結(jié)晶刺激引發(fā)的炎癥反應(yīng)，參閱文獻(xiàn)［14］細(xì)胞造模給藥方法，采用尿酸鈉溶液直接干預(yù)細(xì)胞造模成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GD能夠顯著降低模型大鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3 mRNA、ASC蛋白表達(dá)及炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)，從一定程度揭示GD抗炎機(jī)制可能與降低NLRP3炎性體、ASC表達(dá)、增加Capase-12表達(dá)、抑制 IL-1β分化成熟及 NF-KB活化、降低NLRP3炎性體信號(hào)通路炎性因子表達(dá)有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與秋水仙堿不同的是 GD各劑量組能夠增加模型大鼠巨噬細(xì)胞中 Capase-12的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［15］，Capase-12 蛋白是具有與Capase-1高度相似的CARD結(jié)構(gòu)域，能夠干擾ASC的CARD與 caspase-1的 CARD區(qū)相互作用，抑制NLRP3炎性體活化，進(jìn)而抑制炎性因子IL-1β表達(dá)，提示GD新的抗炎機(jī)制。

NALP3受體抑制劑明顯減少各組巨噬細(xì)胞IL-1β的表達(dá)，但對(duì)TNF-α、NF-KB無(wú)明顯影響，而GD卻能降低模型大鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α、NF-KB表達(dá)，提示GD可以通過(guò)另外信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

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Research on The Effect of Guizhishaoyaozhimu Decoction on The Expression of Inflammatory Signal in Macrophage Induced with Monosodium Urate Crystals Based on NLRP3 Inflammasomes Signaling Pathway

FANG Shu-biao1，2，Wang Yong-hui2，LI Yan-yan2，ZHOU ran2△
(1.Basic Medicine College of Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China; 2.Shanxi University of Traditional Chinese Medicin，Taiyuan 030024，China)

Objective:To study the effect of Guizhishaoyaozhimu Decoction(GD)on the expression of inflammatory signal in macrophage induced with monosodium urate crystals based on NLRP3 inflammasomes signaling pathway and explore the anti inflammation mechanism.Methods:30 male SD rats were randomly divided into 5 groups with 6 rats each group according to weight.The high，medium，low dose group of GD(4，8，16 g mg·kg－1)and colchicine group(3× 10－4g·kg－1)were treated with medicine by gastric administration，the normal group were given equal volume of distilled water.Medicine or distilled water was given once daily for inhibitor seven consecutive days throughout the experiment.One hour after the last gastric administration，all rats were anesthetized with ether，and the serum was collected and incubated for 12 hour.Macrophage were isolated from 30 male SD rats and cultured according to the methods from literatures and randomly divided into 2 experiments(no receptor inhibitors，plus NALP3 receptor inhibitors experiment)with 6 groups each experiment.The normal was added to normal rat serum，the model group，the high，medium and low dose group of GD and colchicine group were added uric acid sodium suspension of 200 μg·L－1to induce into cell model with serum containing medicine.All cells were put into the CO2 cell incubator for 2 hour.The expression of Inflammatory cytokine such as interleukin-1 beta(IL-1)and interleukin-6(IL-6)，tumor necrosis factor alpha(TNF)were detected with Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)，and activity of nuclear factor-KB(nuclear factor kappa B(NF KB)was detected with DNA-protein interaction-ELISA(DPI-ELISA).The expression levels of apoptosis associated protein(ASC)，Capase-12signaling proteins were detected by Western blot.The mRNA expression levels of NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 (NLRP3)inflammasome was detected with reverse transcription-PCR(RT-PCR).Result:Compared with normal group after 12 hours，the expression of IL-1β，IL-6，TNF-α，NF-KB，ASC and NLRP3 inflammasomes in macrophage of the model group significantly increased，whereas Capase-12 significantly decreased.The expression of IL-1β、IL-6、TNF-α、NALP3 mRNA in all drug delivery groups，and NF-KB、ASC in medium and high dose group of GD significantly decreased than the model group，whereas Capase-12 in high dose group of GD increased and there was no significant increase in group of Colchicine.Conclusion:The anti inflammation mechanism of GD is related to decreasing the expression levels of NLRP3 and ASC and increasing the expression of Capase-12，and accordingly inhibiting the maturation of IL-1βand the activation of NFKB，reducing the expression of inflammatory factors in NLRP3 inflammasomes signaling pathway.Different from the colchicine，GD significantly increased the expression of Capase-12 to inhibit the expression of inflammatory factors in NLRP3 inflammasomes signaling pathway in Negative feedback mode that suggested a new anti-inflammatory mechanism of GD.GD can also reduced the expression of NF-KB and TNF-in macrophage In the case of applying NALP3 receptor inhibitor，suggesting that GD can exert anti-inflammatory effect through the other signaling pathways.

Guizhishaoyaozhimu Decoction;macrophage;NLRP3 inflammasomes;signaling pathway

R285.5

:B

:1006-3250(2016)04-0472-05

2015-11-20

山西省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2012081018)

房樹(shù)標(biāo)，主管藥師，醫(yī)學(xué)博士，從事新藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:周 然，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥藥理及實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)研究，Tel:18636117158，E-mail:wyh766188@sina.com。