胡愛民，晏 玲，張利芳，趙 靜，張顯林，萬巧巧

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014)

糖腎煎對早期2型糖尿病腎病大鼠8-異前列腺素2α的影響*

胡愛民，晏 玲，張利芳，趙 靜，張顯林，萬巧巧

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014)

目的:探討8-異前列腺素2α(8-iso-PGF2α)與早期2型糖尿病腎病(DN)相關(guān)性及中藥糖腎煎對其影響。方法:采用單腎切除+高脂飼料+小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，結(jié)合行為干預建立早期(氣陰兩虛型)2型糖尿病腎病病證結(jié)合大鼠模型，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、糖腎煎組(C組)、貝那普利組(D組)。干預16周，觀察各組大鼠一般狀況和空腹血糖(FBG)、負荷后血糖(P2hBG)、空腹胰島素(FINS)、負荷后胰島素(P2hINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白(24h-UAlb)、尿β2微球蛋白(U-β2MG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr)、血漿及尿液8-iso-PGF2α、腎小球體積(GV)及基底膜厚度(GBM)。結(jié)果:與 A組比較，B組大鼠一般狀況差，F(xiàn)BG、P2hBG、FINS、P2hINS、HOMA-IR、24h-UAlb、U-β2MG、血、尿8-iso-PGF2α水平指標均有明顯上升、GV增大及GBM增厚;與B組比較，C組一般狀況明顯改善，各指標均有改善且GV增大減輕、GBM增厚減輕;與D組比較，C組一般狀況改善較明顯，HOMA-IR改善更明顯，余指標無明顯差異。結(jié)論:8-iso-PGF2α與早期(氣陰兩虛型)2型糖尿病腎病有相關(guān)性，糖腎煎對其有改善、保護腎臟的作用。

8異前列腺素2α;2型糖尿病腎病;糖腎煎

1 材料與方法

1.1 動物及飼料

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量100～120g，購自湖北省疾病控制中心實驗動物中心。高脂飼料由基礎飼料、豬油、膽固醇粉、膽酸鈉粉按 87.5%、10%、2%、0.5%比例混合而成。

1.2 藥物及試劑

益氣養(yǎng)陰中藥復方糖腎煎由生黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七等中藥組成，用水煮醇提法制備成浸膏，用生理鹽水稀釋成生藥濃度為2.5 g/ml溶液。貝那普利由諾華制藥公司提供，用生理鹽水稀釋成濃度為2.0mg/ ml溶液。STZ產(chǎn)自美國Sigma公司，以0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液(pH=4.4)配成2.0%STZ溶液。強生穩(wěn)豪倍優(yōu)血糖儀，由強生(中國)醫(yī)療器械有限公司提供;血糖試劑盒購自南京建成生物工程研究所;INS、β2MG試劑盒購自深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程股份有限公司;BUN、Cr試劑盒購自北京恩濟和生物有限公司;UAlb試劑盒購自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;8-iso-PGF2a試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

1.3 分組及處理

采用單腎切除+高脂飼料+小劑量(STZ)腹腔注射，結(jié)合行為干預喂養(yǎng)方式，建立早期(氣陰兩虛型)DN大鼠模型［2］。SPF級 Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)10 d，采用隨機數(shù)字表法分為模型制備組和假手術(shù)組(A組)，模型制備組以1%戊巴比妥鈉30mg/ kg腹腔注射麻醉，切除左腎，縫合切口，青霉素抗感染共1周。A組大鼠僅暴露左腎后即縫合。模型制備組給予高脂飼料，A組給予基礎飼料，均自由飲水，喂養(yǎng)2周。模型制備組腹腔注射STZ 30 mg/kg，A組注射等量0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。72 h后行OGTT試驗，剪尾取血，化學法檢測血糖，以FBG≥5.6 mmol/L、P2hBG≥7.8 mmol/L為造模初步成功，再用隨機數(shù)字表法分為B組、C組、D組。C組用糖腎煎、D組用貝那普利分別以10 g/kg·d、10 mg/kg·d灌胃，每日1次，連續(xù)16周;A組和 B組灌等體積飲用水。期間B組、C組和D組結(jié)合饑飽失常(單日禁食，自由飲水;雙日不限量給予高糖高脂飼料，自由飲水)、過度疲勞(每天于 43±0.5℃、水深35 cm的恒溫水槽中游泳，當大鼠出現(xiàn)自然下沉時從水槽取出，每日1次)、驚嚇(貓叫聲驚嚇鼠、棍棒敲擊鼠籠，每日1次)的方式行為干預，同時實施4周。實驗結(jié)束前1周采用金屬代謝籠收集24 h尿標本。實驗結(jié)束前1 d行OGTT及胰島素釋放試驗。實驗結(jié)束，觀察各組大鼠一般狀況，禁食12～14 h稱重，以戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血分離血清備用。取右腎并稱重，取部分腎組織分別固定于4%多聚甲醛溶液(光鏡標本)和2.5%戊二醛溶液(電鏡標本)備用。取部分腎皮質(zhì)稱重，在冰浴條件下制成勻漿氯化鈉液，離心取上清液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測方法

FBG、P2hBG用葡萄糖氧化酶法;INS采用化學發(fā)光法;24 h-UAlb用免疫透射比濁法，U-β2MG用化學發(fā)光法;BUN用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法;Cr用酶法;8-iso-PGF2a采用酶聯(lián)免疫吸附法，均嚴格按試劑盒說明書操作。HOMA-IR=(FBG×FINS)/ 22.5。組織標本分別常規(guī)固定、脫水、包埋、切片，光鏡采用HE染色，電鏡采用鈾鉛雙染色。光鏡400倍攝片，運用Image pro-plus 6.0采用逐點描繪區(qū)域法，用鼠標沿腎小球毛細血管叢逐點描畫出整個腎小球輪廓，測量腎小球面積(Area)。按公式 GV= Area1.5×0.75+0.21計算，每例隨機選10～12個完整腎小球測量，取其平均值。電鏡2500倍攝片，運用Image pro-plus 6.0軟件分析GBM，每組片子選3張具有完整組織的照片，每張照片測3個GBM厚度，并計算其平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料方差齊采用t檢驗，方差不齊采用t＇檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、FBG、P2hBG、FINS、P2hINS及HOMA-IR結(jié)果比較(表1)

2.2 各組大鼠 24h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat、腎重/體質(zhì)量結(jié)果比較(表2)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、FBG、P2hBG、HOMA-IR比較

表2 各組大鼠24h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat及腎重/體質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠血清及尿液8-iso-PGF2a比較(表3)

2.4 各組大鼠腎小球體積及基底膜厚度(表4)

表3 各組大鼠血清及尿液8-iso-PGF2a比較

表4 各組大鼠腎組織腎小球體積及基底膜厚度比較

2.5 各組大鼠鏡下組織病理變化(圖1、2)

圖1 各組大鼠腎組織光鏡下病理變化(HE染色400×)

2.6 各組大鼠一般狀況

A組大鼠飲食、尿量正常，大便黑褐色顆粒狀，肌肉豐滿，毛發(fā)潔白順滑，精神飽滿，雙目有神，反應靈敏，舌淡紅潤澤;B組大鼠氣陰兩虛表現(xiàn)明顯，飲食、尿量增多、消瘦，拉尾排便、排尿，倦怠懶動、喜蜷臥或成堆趴臥，少數(shù)急躁易怒、易驚恐斗毆、毛色暗黃無光澤、舌胖大少津等;C組大鼠上述狀況均有明顯改善;D組大鼠上述狀況有一定程度改善。

圖2 各組大鼠基底膜透射電鏡下病理變化(鈾鉛雙染色2500×)

3 討論

Brownlee提出糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機制學說，即經(jīng)典的多元醇途徑、糖基化終末產(chǎn)物(AGES)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑和氨基己糖途徑，均是高糖環(huán)境下線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多的結(jié)果，即高糖損傷的共同基礎是氧化應激［3］。氧自由基不僅直接損傷腎組織腎細胞膜、腎細胞及線粒體DNA等，而且氧自由基作為信號分子激活細胞內(nèi)多個信號通路，使腎小球出現(xiàn)高灌注、高濾過及GV肥大、GBM增厚、細胞外基質(zhì)過度沉積、足細胞損傷、蛋白尿形成和腎功能損害。8-iso-PGF2a是自由基攻擊生物膜磷脂中花生四烯酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化后的特異性產(chǎn)物，在氧化應激水平升高情況下大量生成，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［4］，是評價氧化應激理想的生物指標。Decfistofaro［5］和 Hoeldtke［6］等通過檢測糖尿病患者血或尿8-iso-PGF2a得出其含量與患者的病情、胰島素抵抗及預后存在相關(guān)性的結(jié)論。另一方面，Anila Kumar［7］等發(fā)現(xiàn)，在炎癥反應早期，8-iso-PGF2α可通過直接或第二信使系統(tǒng)促使單核細胞黏附于微血管內(nèi)皮細胞，導致內(nèi)皮受損;T.Mueller［8］等發(fā)現(xiàn)，8-isoPGF2α本身又可以刺激血管內(nèi)皮細胞分化DNA的合成和內(nèi)皮素-1的表達，削弱NO保護內(nèi)皮的生物效應，進一步加重內(nèi)皮損傷;牟海英［9］等綜述國內(nèi)外研究成果認為，8-iso-PGF2α是一種強力的血管收縮劑，能選擇收縮腎血管、心臟冠狀動脈、腦血管、視網(wǎng)膜動脈和肺血管等;促進血小板的黏附、聚集和變形并加速凝血，引起成纖維細胞和心肌細胞的增殖和分化。因此，8-iso-PGF2α可能是DN早期微量蛋白尿的原因之一，并與其他因素一起參與腎小球硬化，但其具體作用機制尚有待進一步研究。

DN屬于中醫(yī)“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇。早期以氣陰兩虛為主［10］。筆者臨床用經(jīng)驗方“糖腎煎”進行治療取得較好效果，方中黃芪、太子參、山藥健脾益氣，其中黃芪可利水消腫;生地清熱涼血、養(yǎng)陰生津;山茱萸補益肝腎、收斂固澀;茯苓健脾滲濕、利水消腫;丹皮清熱涼血、活血化瘀;三七止血散瘀、補虛消腫;五味子益氣生津、補腎寧心，全方共奏補益脾腎、益氣養(yǎng)陰、活血通絡之功。

本研究中模型組大鼠一般狀況差，糖代謝紊亂，HOMA-IR、24h-UAlb、U-β2MG升高，GV肥大，GBM增厚，腎功能尚正常，符合早期(氣陰兩虛型)2型糖尿病腎病特點。觀察發(fā)現(xiàn)，其血、尿8-iso-PGF2α升高，證實其與早期糖尿病腎病有相關(guān)性。中藥糖腎煎干預后一般狀況好轉(zhuǎn)，各項指標改善，血、尿8-iso-PGF2a下降，DN進程得到改善。因此，我們認為中藥復方糖腎煎對保護腎臟的作用可能是通過改善氧化應激、影響8-iso-PGF2α等途徑實現(xiàn)的。

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The influence of Tangshenjian to Early type 2 Diabetic Nephropathy Rats’8-iso-Prostaglandin 2α

HU Ai-min，YAN Lin，ZHANG Li-fang，ZHAO Jing，ZHANG Xian-lin，WAN Qiao-qiao
(Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medcine Endocrinology，Hubei Wuhan 430014，China)

Objective:To investigate the correlation between 8-iso-prostaglandin 2α(8-iso-PGF2α)and Diabetic nephropathy(DN)rats and medicine Tangshenjian’intervention.Methods:Use a single nephrectomy+high-fat diet+lowdose streptoz-otocin(STZ)intraperitoneal injection，combined with behavior intervention，the establishment of early (QiYin Deficiency)type 2 diabetic nephropathy disease and syndrome rats were randomly divided sham operation group (groupA)，model group(group B)，sugar，Tangshenjian group(group C)，benazepril group(group D).Intervention 16 weeks，Observe the general situation、fasting blood glucose(FBG)，2 hours postprandial blood glucose(P2hBG)，fasting serum insulin(FINS)，afterload serum insulin(P2hINS)，Insulin resistance index(HOMA-IR)，24 h urinary albumin (24h-UAlb)，urinary β2 microglobulin(U-β2MG)，blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，plasma and urinary 8-iso-PGF2α，glomerular volume(GV)and glomerular basement membrane thickness(GBM).Results:①compared with group A，group B rats generally in poor condition，F(xiàn)BG，P2hBG，F(xiàn)INS，P2hINS，HOMA-IR，24h-UAlb，U-β2MG，blood and urine 8-iso-PGF2α level indicators have significantly increased，GV increase large and GBM thicken;②compared with group B，group C significantly improved the general situation，each index has improved and increased mitigation in GV and GBM thickeness;③compared with group D，group C significantly improved the general situation，HOMA-IR improved significantly，the other showed no significant difference.Conclusion:8-iso-PGF2αhas correlation with early(QiYin Deficiency)type 2 diabetic nephropathy，Tangshenjian’kidney protective effects of DN rats is achieved by improving the oxidative stress.

8 iso prostaglandin 2α;type 2 diabetic nephropathy;Tangshenjian

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0348-03

湖北省衛(wèi)生計生委(2013Z-Y36);武漢市2014年“黃鶴英才”(醫(yī)療衛(wèi)生)計劃;武漢市衛(wèi)生局(武衛(wèi)(2009)76號)程。目前中藥對8-iso-PGF2a的影響研究尚少，本研究通過建立DN病證結(jié)合模型，探討8-iso-PGF2a與DN相關(guān)性及糖腎煎對其的影響，現(xiàn)報道如下。

2015-07-04

胡愛民(1963-)，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，從事內(nèi)分泌疾病的中醫(yī)藥臨床與研究。

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一。研究表明，氧化應激是 DN發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機制。8-iso-PGF2α是反映體內(nèi)氧化應激水平的理想指標［1］。也有研究發(fā)現(xiàn)，其本身具有生物學活性，并參與DN發(fā)生發(fā)展過