魏林郁， 盧 娜， 孟 莉， 李新娟， 李 璐， 李超， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學與神經生物學研究室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

人P2X7真核表達載體的構建及穩(wěn)定轉染細胞株的建立*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學與神經生物學研究室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的：構建人P2X7基因的真核表達載體，并通過轉染獲得穩(wěn)定表達P2X7分子的HEK293細胞株。方法：以人腦組織P2X7cDNA為模板擴增出P2X7基因，插入到真核表達載體pEGFP-N1中，構建重組質粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect試劑盒將重組質粒轉染HEK293細胞，通過G418輔助熒光篩選建立穩(wěn)定表達P2X7-EGFP細胞株。經流式細胞儀、Western blot和激光共聚焦顯微鏡檢測，了解人P2X7在HEK293細胞中的表達水平及細胞內定位。結果：重組質粒pEGFP-N1/P2X7構建正確，建立了穩(wěn)定表達人P2X7的HEK293細胞系。Western blot和流式細胞儀檢測證實，P2X7在HEK293細胞系中成功表達，激光共聚焦顯微鏡檢測顯示P2X7-EGFP定位在細胞膜上。結論：重組載體pEGFP-N1/P2X7構建成功并建立了穩(wěn)定表達人P2X7的HEK293細胞系，為進一步研究P2X7離子通道結構和功能奠定基礎。

P2X7基因；真核表達載體；轉染；HEK293細胞

P2X7受體(P2X7 receptor，P2X7R)，是P2X家族新近發(fā)現(xiàn)的一種受體亞型[1]。與其它P2X受體亞型一樣，P2X7受體具有離子通道的功能，激動劑短時間(毫秒級)與其結合，可以引起非選擇性陽離子通道打開,允許Na+、Ca2+、K+等陽離子通過。同時P2X7受體又區(qū)別于其它P2X受體亞型，當激動劑長時間(秒級)作用時，它就可以在細胞膜上形成“孔道”，允許900 Da以下分子穿過細胞膜進入胞內，這表明P2X7受體可能具有不同于離子通道的特殊功能[2,3]。Cotrina等研究發(fā)現(xiàn)[4]，P2X7受體與ATP的親和力低于其它P2X受體亞型，僅當ATP濃度高于100 μmol/L時才被激活。而且一旦激活，就可通過細胞內的多種信號轉導機制，參與機體氧化應激、炎癥反應、遞質釋放和細胞增殖與凋亡等病理過程[5,6]。但是，目前P2X7受體的結構、生物學特征及作用機制研究并沒有明確的定論。鑒此，對P2X7受體的功能研究日益引起重視。而其難點在于P2X7受體在已知在體細胞中的并非單獨表達(如小膠質細胞、巨噬細胞等)，一般與其它多種P2X亞型共表達，并且不同P2X受體亞型彼此之間有著密切的拮抗或協(xié)同效應，又都以ATP作為同一配體，因此難以在原代細胞中單獨研究P2X7受體的結構、信號轉導與調控機理。

因此本研究構建了pEGFP-N1/P2X7真核表達載體，轉染人胚腎細胞(HEK293),觀察人P2X7的蛋白表達及在細胞內定位，建立穩(wěn)定表達的HEK293細胞株，旨在體外單獨研究P2X7離子通道結構與功能，為進一步探討P2X7受體相關疾病發(fā)病機理、治療靶點及藥物研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦組織P2X7全長cDNA(Open Biosystems，美國)；感受態(tài)細菌E.coil DH5a(北京天根生化科技有限公司)；質粒pEGFP-N1(上海吉凱基因化學技術有限公司)； HEK293細胞由本實驗室保存。

1.2 儀器和試劑

胎牛血清(Hyclone，美國)；DMEM高糖培養(yǎng)基(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司)；X-fect轉染試劑盒(Clontech，美國)；限制性內切酶DpnI(TaKaRa，日本)；質粒提取試劑盒(OMEGA，美國)；G418(Sigma，美國)；兔源P2X7多克隆抗體(Alomone，以色列)； SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒、Tubulin兔抗大鼠多克隆一抗、AP標記羊抗兔IgG二抗(上海碧云天生物技術有限公司)；PCR反應引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；倒置熒光顯微鏡(ZEISS，德國)；PCR儀(Bio-Rad，美國)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus/FV1000，日本)；流式細胞儀(BeckMan/FC500，美國)。

1.3 目的基因P2X7和質粒pEGFP-N1的擴增

采用魏林郁等[7]快速克隆方法，以人腦組織P2X7 cDNA為模板，利用PCR擴增人P2X7目的基因。引物如下：P2X7上游引物：5’-TCCGCTCGAGATGCCGGCCTGCTGCAGCTGCAGTGATG-3’；P2X7下游引物：5’-ATGGGGTACCGTGTAAGGACTCTTGAAGC CACTG-3’；同時，利用PCR以質粒pEGFP-N1為模板反向擴增，引物如下：pEGFP-N1上游引物：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’； pEGFP-N1下游引物: 5’-GCTAGCGGATCTGACGGTTCAC-3’。 PCR反應體系(50 μl)如下： Phusion(5 x)擴增緩沖液 10 μl, dNTP(2.5 mmol/L)6 μl，上、下游引物(5 μmol/L)各1 μl，DNA模板(10 ng/μl)1 μl, Phusion DNA聚合酶 0.5 μl，加入滅菌水至50 μl，離心混勻。按照下述條件進行PCR反應：(1)98℃ 2 min，(2)98℃ 20 s，(3)55℃ 20 s，(4)72℃ 90 s，共進行25個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min后冷卻至4℃。PCR反應完成后進行1%瓊脂糖電泳，分別檢測人P2X7和pEGFP-N1載體的PCR擴增產物。

1.4 重組質粒pEGP-N1/P2X7的構建和鑒定

檢測正確的P2X7和pEGFP-N1 PCR擴增產物中直接加入DpnI 1 μl，37℃消化3 h，按照美國Clontech 公司X-fect轉染試劑盒說明書進行轉化實驗。轉化實驗步驟如下： DpnI消化后的pEGFP-N1 和P2X7擴增產物各取5 μl混合，室溫靜止30 min，100 μl DH5a感受態(tài)細胞與2 μl混合產物混合后冰浴30 min，再進行42℃熱激60 s，0℃冰浴60 s，加入到LB液體培養(yǎng)基(無抗生素)、37℃ 恢復1 h，再均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基(100 μg/ml氨芐霉素)、37℃ 過夜培養(yǎng)16 h。第2天在LB固體培養(yǎng)基上隨機挑取8個單克隆菌落，置于5 ml LB液體培養(yǎng)基(50 μg/ml氨芐霉素)、37℃搖床上過夜培養(yǎng)。第3天進行菌液PCR鑒定P2X7陽性克隆。按照下列參數(shù)進行菌液PCR反應：(1)94℃ 5 min，(2)94℃ 30 s，(3)55℃ 30 s，(4)72℃ 2 min，共20個循環(huán)，最后72℃再延伸10 min并冷卻至4℃(上游引物：5’-TACATCGGCTCAACCCTCT-3’，下游引物5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG -3’)，PCR產物進行1%瓊脂糖電泳。選取擴增出約881 bp P2X7條帶的菌液，按照OMEGA公司質粒提取試劑盒說明書進行質粒抽提，同時將同一陽性克隆菌液送至北京英俊公司測序。

1.5 建立穩(wěn)定表達pEGFP-N1/P2X7的HEK293細胞株

將HEK293細胞接種于6孔板中，正常DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度為50%～60%時，按照美國Clontech 公司的X-fect轉染試劑說明書將重組質粒pEGFP-N1/P2X7轉染HEK293細胞。轉染后4 h更換培養(yǎng)基，轉染后48 h利用倒置熒光顯微鏡檢測P2X7-eGFP綠色熒光蛋白表達，轉染后72 h胰酶消化，離心收集細胞，PBS重懸并稀釋，300目濾膜過濾后進行流式細胞儀初步篩選帶綠色熒光的HKE293細胞，激發(fā)光波長488 nm激發(fā)。篩選后的細胞種入培養(yǎng)皿中，600 mg/L G418壓力篩選培養(yǎng)2周。2周后胰酶消化，收集細胞稀釋后種入96孔板，每孔100 μl培養(yǎng)基且每孔1個細胞，G418繼續(xù)壓力篩選3周，再用倒置熒光顯微鏡鑒定并獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白P2X7-eGFP的單克隆細胞并擴大培養(yǎng)。

1.6 激光共聚焦鑒定綠色熒光蛋白P2X7-eGFP的表達

穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白P2X7-eGFP的HEK293細胞接種于活細胞成像培養(yǎng)皿中，48 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察，使用層掃描分別對野生型及穩(wěn)定轉染的HEK293細胞進行綠色熒光定位。

1.7 流式細胞儀鑒定表達綠色熒光蛋白的HEK293細胞

選取帶綠色熒光的單克隆細胞擴大培養(yǎng)后，取第3代細胞種在培養(yǎng)皿中，用含G418(200 μg/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，胰酶消化，離心收集細胞并置于1 ml PBS中，300目濾膜過濾后進行流式細胞儀檢測，收集10 000個細胞，激發(fā)光波長488 nm，計算綠色熒光陽性的HEK293細胞百分比，以未轉染野生型HEK293細胞為陰性對照組。

1.8 Western blot檢測穩(wěn)定轉染HEK293細胞中P2X7-eGFP表達

將篩選出的穩(wěn)定表達綠色熒光P2X7-eGFP的HEK293細胞擴大培養(yǎng)，收集細胞后用RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清液，BCA法測定上清液蛋白濃度。取含40 μg細胞蛋白的上清液，蛋白煮沸變性，進行10%的SDS-PAGE分離并轉到硝酸纖維素膜上。室溫下將硝酸纖維素膜用3% BSA/TBST溶液封閉1 h，漂洗后加入含有兔源性抗P2X7抗體的TBST溶液(1∶1 000)中4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入含有堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗兔IgG的TBST溶液(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST洗滌3次，用BCIP/NBT顯色法顯色。Tubulin為內參蛋白，未轉染野生型HEK293細胞株設為陰性對照組。

2 結果

2.1 PCR擴增目的基因P2X7和pEGFP-N1

以真核pEGFP-N1載體和人腦P2X7 cDNA為模板，利用PCR反應擴增pEGFP-N1和P2X7，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于4.7 kb 和1.8 kb處可見1條DNA片段，分別與pEGFP-N1和P2X7的基因長度相符(圖1)。

2.2 重組質粒pEGFP-N1/P2X7的鑒定

PCR擴增產物P2X7和pEGFP-N 1∶1混合，DpnI消化過夜，經轉化實驗和含氨芐霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)，隨機挑選8個單克隆菌落進行菌液PCR反應，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，有7個泳道可見1條DNA條帶(881 pb)(圖2)。

Fig. 1 Identification of PCR-amplified P2X7 and pEGFP-N1 fragments a: PCR-amplified pEGFP-N1 fragments; b: PCR-amplified P2X7 fragment; Lane 1: P2X7 fragment； Lane 2： DNA marker

Fig. 2 Identification of recombinant plasmid pEGFP-N1/P2X7 Lane 1: DNA marker; Lane 2 to 9: Eight clones selected randomly from the agar plate

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察P2X7-eGFP融合蛋白的細胞定位

P2X7是一種定位在細胞膜上非選擇性陽離子通道，P2X7與增強型綠色熒光蛋白EGFP融合后，激光共聚焦顯微鏡觀察P2X7-eGFP在穩(wěn)定轉染HEK293細胞中的定位。結果顯示，野生型HEK293細胞無綠色熒光(圖3b)；而穩(wěn)定轉染的HEK293細胞膜上顯示綠色熒光 (圖3d)。

Fig. 3 Localization of P2X7-eGFP in HEK293 cells by confocal microscopy a: Intact HEK293 cells in bright-light; b: Intact HEK293 cells in fluorescent field; c: Stably transfected HEK293 cells with P2X7-eGFP in bright-light field; d: Stably transfected HEK293 cells with P2X7-eGFP in fluorescent field

2.4 流式細胞術檢測帶綠色熒光蛋白P2X7-eGFP的陽性HEK293細胞數(shù)

流式細胞儀檢測穩(wěn)定轉染HEK293細胞中GFP 報告基因陽性的細胞數(shù)。結果顯示在收集10 000個細胞中，穩(wěn)定轉染pEGFP-N1//P2X7的HEK293細胞中綠色熒光陽性的細胞數(shù)占88%，而野生型HEK293細胞中綠色熒光陽性的細胞數(shù)占1.46%(圖4)。

Fig. 4 Detection of positive HEK293 cells stably expressed green fluorescence P2X7-eGFP by flow cytometry a: Flow cytometry assay of HEK293 control cells; b: Flow cytometry assay of stable expression of P2X7-eGFP in HEK293 cells

2.5 Western blot 檢測P2X7-eGFP蛋白的表達

用多克隆兔抗大鼠P2X7一抗檢測結果顯示，穩(wěn)定表達P2X7-eGFP的HEK293細胞株樣品在對應泳道約96 kDa(P2X7-eGFP)處可見明顯的免疫雜交條帶，而未轉染的HEK293細胞樣品在對應泳道未見目的條帶(圖5)。

Fig. 5 Western blot analysis of over-expressed human P2X7 receptor in HEK 293 cells Lane1 and 2: Lysate of HEK293 cells transfected with pEGTA-N1/P2X7; Lane 3 and 4: Lysate of wild type HEK293 cells

3 討論

P2X7受體是P2X受體家族中獨特的一員，含有595個氨基酸，相對分子量70 000～75 000。由氨基端、羧基端、兩個跨膜域(M1、M2)和一個胞外環(huán)狀結構組成。與P2X受體其它亞型相比，P2X7受體只有35%～40%的同源性，其羧基端(239 AA)遠長于其它P2X家族成員(27～129 AA)，羧基端會影響P2X7特有的膜“孔道”形成。ATP是P2X7受體唯一的天然激動劑。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)理想的選擇性P2X7受體激動劑和拮抗劑。當?shù)蜐舛華TP短暫刺激P2X7受體時，引起非選擇性內向陽離子流，對K+、Na+、Ca2+通透，幾乎無失活。由于胞外酶及時分解，ATP只引起一般的生理作用；但當機體受到應激、炎癥、細胞損傷等病理情況下，ATP持續(xù)、大量積聚在細胞間隙，使得較高濃度ATP長時間、反復激活P2X7受體，受體構象改變，形成數(shù)目大于3的多聚體，進而形成胞膜上的“孔道”，此時細胞膜通透性增高，包括較大分子量的有機分子在內的各種陽離子均可通過，而胞內肽類物質流出造成胞內膠體滲透壓過低，誘導細胞發(fā)生一系列生理功能變化：如引起核染色質的縮聚、DNA降解，巨噬細胞融合、溶解，最終導致細胞凋亡或壞死[8,9]。所以，疾病狀態(tài)下P2X7受體數(shù)目增加和活性增強，進而參與多種疾病的發(fā)生過程，已成為潛在疾病防治的靶點。

研究證實，P2X7受體在已知的細胞中并非單獨表達，一般與其它多種P2X亞型共表達，使得單獨研究P2X7受體的結構和功能變得非常困難。建立了穩(wěn)定表達人P2X7基因的HEK293細胞系。

本研究中，所使用HEK293細胞的胞膜上不存在眾多的離子通道，對轉染的P2X7離子通道干擾小，而且能無限傳代。質粒pEGFP-N1中包含增強型綠色熒光蛋白基因 (enhanced green fluorescence protein，EGFP)，EGFP是水母體內綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GEP)的突變體，其熒光強度比GFP增強100倍；突出的優(yōu)點在于GFP與蛋白偶聯(lián)后可在活細胞或生物體內動態(tài)觀察目前目的蛋白表達、分布及效應[10]。在HEK293細胞中，由于缺少GFP基因，所以將GFP和目的基因相連接得到融合體，利用轉染方法既可以研究目的蛋白的細胞定位，又可以通過熒光強弱反映目的蛋白的含量。并且，GFP與外源基因偶聯(lián)一般不影響外源蛋白的構象和功能，為應用流式細胞篩選或其他方式對瞬轉細胞表達EGFP及目的蛋白的效率提供一個依據(jù)[11]。同時質粒pEGFP-N1具有很強的復制能力，結構上含有高效、功能強大啟動子PCMV和SV40，能滿足宿主細胞分裂時隨細胞質遺傳給新的子代細胞，使得目的基因在增殖的細胞中穩(wěn)定表達。

總之，人P2X7編碼區(qū)全長基因的成功克隆、真核表達載體的構建及穩(wěn)定表達人P2X7基因的HEK293細胞株的建立，將為體外單獨研究P2X7離子通道的結構和功能提供細胞模型，也為進一步深入研究P2X7受體相關疾病診斷與治療、研究新的藥物等提供新的途徑。

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Construction of eukaryotic expressing vector of human P2X7 and establishment of stable transfectant cell line

WEI Lin-yu， LU Na， MENG Li， LI Xin-juan， LI Lu， LI Chao-kun， LI Dong-liang△

(Department of Physiology and Neurobiology, Xinxiang Medical University， Xinxiang 453003, China)

Objective: To construct eukaryotic expression vector of human P2X7 gene and transfect HEK293 cells so as to establish stable HEK293 cell line. Methods: P2X7 gene was amplified by polymerase chain reaction from the human brain P2X7 cDNA and inserted into a vector pEGFP-N1 to construct a recombinant plasmid called pEGFP-N1/P2X7. The correct recombinant plasmid was transfected into HEK293 cells by X-fect transfection reagent. The cell line stably expressing EGFP tagged-P2X7 gene were established by screening with G418 and fluorescence microscope. The expression levels and localization of human P2X7 in HEK293 cells was identified by flow cytometry, Western blot and laser scanning confocal microscope. Results: The recombinant plasmid pEGFP-N1/P2X7 was constructed correctly and the stable HEK293 cell line expressing EGFP tagged-P2X7 fusion protein was established. Both Western blot and flow cytometry revealed the higher expression of human P2X7 in the stably transfected HEK293 cells. Under the laser scanning confocal microscope the EGFP tagged-P2X7 fusion protein was located on the membrane of HEK293 cells. Conclusion: The eukaryotic expressing vector of pEGFP-N1/P2X7 is successfully constructed and the HEK293 cell line stably expressing P2X7-EGFP fusion protein is established which have provided solid experimental foundation for further studies on the structure and function of P2X7 ionic channel.

P2X7 gene； eukaryotic expressing vector； transfection； HEK293 cell

國家自然科學基金(81271376)；河南省教育廳科學技術重點研究項目(14A310019，14A310009，16A310011)；河南省基礎與前沿技術研究計劃資助項目(112300410164)

2016-02-29

2016-05-30

Q78

A

1000-6834(2016)05-471-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.022

△【通訊作者】Tel: 0373-3029104； E-mail: xyldl8@126.com