周 清， 王燕萍， 劉小鶯， 劉曉紅， 潘曉東， 陳 洲， 劉禮斌,2,6△

(1. 福建省內(nèi)分泌研究所， 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科， 3. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科， 4. 福建省老年醫(yī)學(xué)研究所， 5. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 6. 福建醫(yī)科大學(xué)老年健康科學(xué)研究院， 福州 350001)

Exendin-4對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響*

周 清1， 王燕萍2,3， 劉小鶯1， 劉曉紅1， 潘曉東4， 陳 洲5， 劉禮斌1,2,6△

(1. 福建省內(nèi)分泌研究所， 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科， 3. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科， 4. 福建省老年醫(yī)學(xué)研究所， 5. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 6. 福建醫(yī)科大學(xué)老年健康科學(xué)研究院， 福州 350001)

目的：探討腸促胰島素類(lèi)似物(Ex-4)對(duì)甲基乙二醛(MG)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及其機(jī)制。方法：傳代培養(yǎng)PC12細(xì)胞，不同濃度MG(0、0.25、0.50、0.75、1.0、2.0 mmol/l)處理PC12細(xì)胞12～48 h，或用不同濃度Ex-4(25、50、100、200 nmol/L)預(yù)處理24 h后加用MG(0.75 mmol/L)干預(yù)24 h后，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；熒光探針?lè)z測(cè)活性氧(ROS)含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活力。Ex-4(100 nmol/L)預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h加用MG(0.75 mmol/L)干預(yù)1 h后，Western blot檢測(cè)蛋白P-IκB-α、IκB-α表達(dá)情況。結(jié)果：隨著MG濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞存活率逐漸降低；加用不同濃度Ex-4預(yù)處理后，PC12細(xì)胞存活率較單獨(dú)MG處理組逐漸升高。100 nmol/L的Ex-4預(yù)處理PC12細(xì)胞后，ROS表達(dá)量較MG單獨(dú)處理組下降65.30%(P<0.01)； NAC預(yù)處理組(陽(yáng)性對(duì)照)ROS表達(dá)量下降107.40%(P<0.01)；Ex-4預(yù)處理組SOD活力增加5.30 U/mg prot(P<0.01)；NAC預(yù)處理組SOD活力增加8.53 U/mg prot(P<0.01)。Ex-4預(yù)處理組P-IκB-α/IκB-α表達(dá)比例下降25.50%(P<0.01)； NAC預(yù)處理組P-IκB-α/IκB-α表達(dá)比例下降35.14%(P<0.01)。結(jié)論：Ex-4濃度依賴(lài)性地增加MG誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的存活率。Ex-4能夠減輕MG誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激，其機(jī)制可能涉及抑制蛋白IκB-α的活化。

PC12細(xì)胞；甲基乙二醛；氧化應(yīng)激；Exendin-4；N-乙酰半胱氨酸

糖尿病患者發(fā)生神經(jīng)退行性疾病，如血管性癡呆和阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的危險(xiǎn)性明顯增加，其重要原因之一就是糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)生成增加。甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)是一種糖代謝的中間產(chǎn)物，作為AGEs的重要前體物質(zhì)在糖尿病患者血漿中明顯增加[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]MG的活性和細(xì)胞毒性比高糖更強(qiáng)，MG誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的起始和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Heimfarth等[3]研究顯示MG能夠通過(guò)MEK/ERK信號(hào)通路活化氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠大腦皮層及海馬細(xì)胞凋亡。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種腸促胰島素活性因子，通過(guò)與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合發(fā)揮作用。研究表明GLP-1R不僅分布于胰腺、胰島、胃、腸等組織也廣泛分布于正常生理狀態(tài)下的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中如海馬、小腦、大腦皮層等。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1能夠改善AD模型小鼠的認(rèn)知與記憶、減少淀粉樣斑塊沉積、減輕炎癥反應(yīng)，增加海馬和皮層的突觸數(shù)量[4]。GLP-1在海馬神經(jīng)元中的過(guò)表達(dá)能夠改善GLP-1受體敲除小鼠的記憶障礙[5]。目前，針對(duì)GLP-1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用研究不多，且多集中于GLP-1能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)等過(guò)程，但涉及氧化應(yīng)激過(guò)程及其機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。腸促胰島素類(lèi)似物(Exendin-4，Ex-4)作為GLP-1受體激動(dòng)劑，有研究顯示腸促胰島素類(lèi)似物(Ex-4)能夠改善低氧誘導(dǎo)的鼠海馬及皮層神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，改善外傷性腦損傷誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[6，7]；假設(shè)在神經(jīng)細(xì)胞中，Ex-4也可通過(guò)影響氧化應(yīng)激而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞株P(guān)C12 細(xì)胞作為研究對(duì)象，以氧化應(yīng)激的抑制劑NAC作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察GLP-1受體激動(dòng)劑Ex-4對(duì)MG介導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及其機(jī)制，以期為GLP-1類(lèi)似物的神經(jīng)保護(hù)作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，HyClone 公司)；Ex-4、甲基乙二醛(methylglyoxal)、噻唑藍(lán)(MTT)、N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，美國(guó)Sigma公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)； Ikbα多克隆一抗、P-Ikbα多克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling公司)；

1.2 細(xì)胞

高分化大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12 cells)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%匯合度生長(zhǎng)時(shí)，按1∶3～1∶4比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。以5×105cells/ml密度接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù)

實(shí)驗(yàn)一: 不同濃度MG(0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0 mmol/L)處理PC12細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h后，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。根據(jù)本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.75 mmol/L MG作用24 h作為后續(xù)試驗(yàn)的干預(yù)條件。

實(shí)驗(yàn)二： Ex-4預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后加0.75 mmol/L MG作用24 h； Ex-4組：100 nmol/L Ex-4與細(xì)胞共孵育24 h；以MG+NAC為陽(yáng)性對(duì)照組：NAC預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后加0.75 mmol/L MG作用24 h；熒光探針?lè)z測(cè)ROS含量，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活力。

實(shí)驗(yàn)三：根據(jù)文獻(xiàn)MG活化IκB-α的最佳時(shí)間為1 h，以Ex-4預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后加0.75 mmol/L MG作用1 h； Ex-4組：100 nmol/L Ex-4與細(xì)胞共孵育1 h；以MG+NAC為陽(yáng)性對(duì)照組：NAC預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后加0.75 mmol/L MG作用1 h；Western blot檢測(cè)IκB-α、P-IκB-α蛋白表達(dá)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將PC12細(xì)胞以3×103cells/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，分組干預(yù)。對(duì)照組用含4%FBS的DMEM培養(yǎng)基處理，實(shí)驗(yàn)組用含4%FBS的DMEM培養(yǎng)基加不同濃度甲基乙二醛(0.25、0.5、0.75、1.0、2.0 mmol/L)分別干預(yù)12、24、36、48 h，或用不同濃度Ex-4(25、50、100、200 nmol/L)預(yù)處理24 h后加用甲基乙二醛(0.75 mmol/l)干預(yù)24 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每孔加入5 g/L MTT溶液10 μl，37℃孵育4 h，吸棄上清后，加200 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩溶解10 min，酶標(biāo)儀單波490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化

將PC12細(xì)胞以5×105cells/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，以實(shí)驗(yàn)分組一處理細(xì)胞，按ROS測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作，于熒光酶標(biāo)儀下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.7 黃嘌呤氧化酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD變化

將PC12細(xì)胞以5×105cells/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，以實(shí)驗(yàn)分組一處理細(xì)胞，按SOD測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀下檢測(cè)OD值，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)SOD活力。

1.8 Western blot 檢測(cè) IκB-α、P-IκB-α 蛋白表達(dá)變化

將PC12細(xì)胞以5×105cells/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，以實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞后，用細(xì)胞裂解緩沖液(RIPA、按1∶100的比例加入磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、按1∶200的比例加入PMSF，混勻)300 μl冰上裂解細(xì)胞，4℃14 000 r/min離心15 min后吸上清液，采用BCA蛋白定量后用RIPA將各孔蛋白調(diào)至等體積、等濃度，最后加入等體積的5×上樣緩沖液，混勻，配制成3～4 mg/ml濃度的樣本。98℃變性5 min后取樣品40 μg以10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離蛋白,分離的蛋白用半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到NC膜上，室溫封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的兔多克隆一抗稀釋液4℃孵育過(guò)夜(針對(duì)IκB-α、P-IκB-α蛋白)，用1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗室溫?fù)u育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，X射線底片曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 甲基乙二醛對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

不同濃度MG(0、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0 mmol/L)處理PC12細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h后，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。發(fā)現(xiàn)隨著MG作用濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，PC12細(xì)胞的存活率逐漸下降。MG抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出一定的量效和時(shí)效關(guān)系(表1)。根據(jù)本部分試驗(yàn)結(jié)果，選擇0.75 mmol/L MG作用24 h作為后續(xù)試驗(yàn)的干預(yù)條件。

Tab. 1 Cell viability of PC12 cells after exposure to methylglyoxal (MG)(0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mmol/l) for 12 h、24 h、36 h、48 h(%，±s，n=5)

Group12h24h36h48hMG(0．25)96．25±4．8399．36±3．4998．37±4．0886．26±3．68??MG(0．5)96．41±4．2995．63±4．5270．84±4．56??71．18±2．95??MG(0．75)95．63±4．3468．82±4．08??64．08±3．13??43．58±1．46??MG(1．0)86．11±2．64??49．21±3．18??46．13±2．64??23．91±2．31??MG(2．0)48．41±1．79??46．29±3．63??16．84±0．95??11．64±0．61??

**P<0.01vscontrol

2.2 Exendin-4對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的影響

不同濃度Ex-4(25, 50, 100, 200 nmol/L)預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后，再用MG ( 0.75 mmol/L )干預(yù)24 h，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。發(fā)現(xiàn)MG作用于PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為70.09%±3.70%，較對(duì)照組下降29.91% (P<0.01)，加用不同濃度Ex-4預(yù)處理PC12細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞存活率較單獨(dú)MG處理組均有增高(P<0.05)，其中Ex-4(25 nmol/L)預(yù)處理組細(xì)胞存活率為76.68%±2.51%，Ex-4(50 nmol/L)預(yù)處理組細(xì)胞存活率為78.70%±2.31%，Ex-4(100 nmol/L)預(yù)處理組細(xì)胞存活率為82.89%±2.38%，Ex-4(200 nmol/L)預(yù)處理組細(xì)胞存活率為82.23%±1.52%，說(shuō)明隨著Ex-4作用濃度的增加，PC12細(xì)胞存活率也逐漸增加。而最大濃度的Ex-4(200 nmol/L)單獨(dú)處理細(xì)胞存活率為95.08%±2.68%，與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Ex-4單獨(dú)處理不會(huì)影響PC12細(xì)胞存活率。根據(jù)本部分試驗(yàn)結(jié)果，100 nmol/L和200 nmol/L的Ex-4預(yù)處理后，PC12細(xì)胞凋亡率減少較明顯，參照既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)資料，我們最終選擇100 nmol/L Ex-4進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 Exendin-4對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的影響

本實(shí)驗(yàn)以NAC作為陽(yáng)性對(duì)照，參照文獻(xiàn)資料選擇NAC作用濃度為10 mmol/L，作用時(shí)間為24 h，以實(shí)驗(yàn)分組一處理細(xì)胞。熒光探針?lè)z測(cè)ROS平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，MG單獨(dú)干預(yù)組ROS含量明顯增高，與MG單獨(dú)處理組相比，MG+Ex-4處理組的ROS含量下降65.30(P<0.01),MG+NAC處理組的ROS含量下降107.40 (P<0.01)。說(shuō)明MG能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生ROS增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，而Ex-4能夠抑制MG誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生ROS，具有抗氧化作用(表2)。

2.4 Exendin-4對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中超氧化物歧化酶SOD產(chǎn)生的影響

為了研究Ex-4增加MG介導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率與超氧化物歧化酶SOD的關(guān)系，以實(shí)驗(yàn)分組一處理細(xì)胞。黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MG單獨(dú)干預(yù)組SOD活力明顯下降，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性下降。與MG單獨(dú)處理組相比，MG+Ex-4處理組的SOD活力增加5.30(U/mg prot)(P<0.01)，MG+NAC處理組的SOD活力增加8.53(U/mg prot)(P<0.01，表2)。說(shuō)明MG能夠削弱細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平，而Ex-4能夠增加細(xì)胞內(nèi)的抗氧化水平，具有抗氧化作用。

2.5 Exendin-4對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中炎癥蛋白IκB-α、P-IκB-α表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步研究Ex-4減輕MG誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激與IκB-α蛋白的關(guān)系，考慮到IκB-α作為信號(hào)通路中的早期表達(dá)蛋白，易被活化降解，參照文獻(xiàn)資料選擇檢測(cè)IκB-α蛋白表達(dá)的時(shí)間為1 h，以實(shí)驗(yàn)分組二處理細(xì)胞，Western blot檢測(cè)炎癥蛋白P-IκB-α/IκB-α的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，MG單獨(dú)干預(yù)組P-IκB-α/IκB-α比例明顯增高，說(shuō)明激活了IκB-α蛋白。與MG單獨(dú)處理組相比，MG+Ex-4處理組的P-IκB-α/ IκB-α比例下降25.50% (P<0.01)，MG+NAC處理組的P-IκB-α/ IκB-α比例下降35.14% (P<0.01)。說(shuō)明MG激活炎癥蛋白IκB-α，而Ex-4能夠抑制MG誘導(dǎo)的炎癥蛋白IκB-α的活化(圖1，表2)。

Fig. 1 Expression of P-IκB-α、IκB-α protein in each group detected by Western blot

GroupFluorescencedensity(AU)SODactivity(U/mgprot)P?IκB?α/IκB?α(%)Control112．94±8．4332．02±1．6642．43±0．99MG205．76±11．88??19．80±1．59??77．72±2．89??MG+Ex?4140．47±4．95##25．09±1．51##52．22±1．48##MG+NAC98．37±3．94##28．32±1．61##43．17±0．84##Ex?448．28±0．69##31．65±1．13##21．58±0．63##

ROS: Reactive oxygen speies; SOD: Superoxide dismutase; MG: Methylglyoxal; Ex-4: Exendin-4; NAC: n-acetyl-l-cysteine

**P<0.01vscontrol;?##P<0.01vsMG

3 討論

體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致多種糖尿病并發(fā)癥，糖尿病相關(guān)神經(jīng)退行性疾病作為糖尿病并發(fā)癥之一，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，眾多相關(guān)理論中，氧化應(yīng)激增強(qiáng)作為其主要發(fā)病機(jī)制之一。由于糖尿病患者體內(nèi)MG合成增加、代謝減少導(dǎo)致MG含量明顯升高且MG對(duì)細(xì)胞的毒性作用強(qiáng)于高糖，因此近年MG成為研究熱點(diǎn)。Michiru[8]等研究發(fā)現(xiàn)MG通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)通路并劑量依賴(lài)的降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平導(dǎo)致施旺細(xì)胞凋亡，而這一作用能夠被抗氧化劑NAC逆轉(zhuǎn)。這說(shuō)明MG能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)MG能夠抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，且這種抑制作用呈現(xiàn)出一定的量效和時(shí)效關(guān)系，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激相關(guān)。

近來(lái)很多研究表明GLP-1對(duì)中樞及周?chē)窠?jīng)具有保護(hù)作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的分化[9]。Meng Li[10]等闡明GLP-1類(lèi)似物利那魯肽通過(guò)MEK-ERK/CREB信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)。Liu等[11]闡明Ex-4通過(guò)激活GLP-1R信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)濃度改善周?chē)窠?jīng)Na+-K+-ATP酶可逆性缺陷導(dǎo)致的代謝紊亂、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Ex-4還可維持細(xì)胞內(nèi)的鈣平衡，下調(diào)TP53(tumor protein 53，TP53)和Bax(Bcl-2 associated X protein，Bax)基因表達(dá)，保護(hù)Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[12]。Paula[13]等研究發(fā)現(xiàn)GLP-1類(lèi)似物能夠改善AD模型APP/PS1 小鼠的記憶障礙、抑制突觸可塑性的退化和突觸的減少以及減少海馬區(qū)的β-淀粉的沉積。但針對(duì)GLP-1通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)Ex-4作為GLP-1受體激動(dòng)劑，對(duì)MG誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性有一定的保護(hù)作用，能夠減輕MG誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

目前關(guān)于糖尿病是一種慢性炎癥狀態(tài)已得到證實(shí)，NF-κB作為一種調(diào)控多種基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。IκB-α作為NF-κB最重要的抑制蛋白，在NF-κB的活化過(guò)程中起著分子開(kāi)關(guān)的作用。因此抑制炎癥相關(guān)蛋白IκB-α的活化與降解，進(jìn)而阻止NF-κB的活化成為研究NF-κB作用的重要方法。Wang YH[14]等研究發(fā)現(xiàn)MG通過(guò)AGEs/RAGE/NF-κB信號(hào)通路降低SH-SY5Y細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞內(nèi)ATP生成，抑制線粒體的氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加。Jaetaek[15]等研究指出MG能夠通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、活化NF-κB和caspase-3而誘導(dǎo)視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡，而抗氧化物NAC和NF-κB抑制劑能夠阻斷MG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一種含巰基的化合物，可以有效抑制氧化應(yīng)激。為了進(jìn)一步探討Ex-4減少M(fèi)G誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎癥信號(hào)通路的關(guān)系，本研究使用NAC作為對(duì)照因素，采用Western blot檢測(cè)P-IκB-α、IκB-α蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示用Ex-4預(yù)處理PC12細(xì)胞，與用NAC預(yù)處理細(xì)胞結(jié)果相似，提示Ex-4可能通過(guò)抑制炎癥蛋白IκB-α的表達(dá)減輕MG誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而對(duì)PC12細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

總之, Ex-4能夠增加MG誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的存活率，抑制MG誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用，其機(jī)制可能涉及抑制蛋白IκB-α的活化，然而Ex-4抑制MG誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用其機(jī)制是復(fù)雜的， Ex-4對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)是否涉及其對(duì)氧化應(yīng)激其他信號(hào)通路的影響及各信號(hào)通路之間的串話問(wèn)題等仍需要進(jìn)一步研究。

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Effects of exendin-4 on methylglyoxal-induced oxidative stress in PC12 cells

ZHOU Qing1, WANG Yan-ping2,3, LIU Xiao-ying1, LIU Xiao-hong1, PAN Xiao-dong4, CHEN Zhou5, LIU Li-bin1,2,6△

(1. Fujian Institute of Endocrinology, 2. Department of Endocrinology, Fujian Medical University Union Hospital, 3. Department of Geriatrics, Fujian Medical University Union Hospital, 4. Fujian Institute of Geriatrics, 5. College of Pharmacology, Fujian Medical University, 6. Academy of Science of Elderly Health, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China)

Objective: To study whether Exendin-4(Ex-4)could influence oxidative stress in PC12 cells induced by methylglyoxal and its underlying mechanism. Methods: PC12 cells were cultured with methylglyoxal (0,0.25,0.50,0.75,1.0,2.0 mmol/L ) for 12～48 h, or PC12 cells were pretreated with Ex-4 (25, 50, 100, 200 nmol/L) for 24 h then incubated with methylglyoxal (0.75 mmol/L) for 24 h. MTT assay was used to measure cell viability. Fluorescent probe method was used to detect reactive oxygen species (ROS) expression. Xanthine oxidase method was used to detect superoxide dismutase (SOD) activity. With pretreatment of Exendin-4 (100 nmol/L) for 24 h，the expressions of P-IκBα, Inhibitor of NF-κB-α IκBα were detected by Western blot after PC12 cells were exposed to methylglyoxal (0.75 mmol/L) for 1 h. Results: Following methylglyoxal administration, cell viability was gradually decreased in a dose- and time-dependent manner. Pretreatment with Ex-4 for 24 hours, cell viability were gradually increased compared with methylglyoxal-alone group. Pretreatment with Ex-4 (100 nmol/L) for 24 hours, ROS expression was reduced by 65.30% (P<0.01) compared with methylglyoxal-alone group, ROS expression in NAC-pretreatment group was reduced by 107.40% (P<0.01); SOD activity in the Ex-4 pretreatment group was increased by 5.30 U/mg prot (P<0.01), SOD activity in the NAC pretreatment group was increased by 8.53 U/mg prot (P<0.01); the ratio of P-IκB-α/IκB-α in the Ex-4 pretreatment group was reduced by 25.50% (P<0.01), the ratio of P-IκB-α/IκB-α in the NAC pretreatment group was reduced by 35.14% (P<0.01). Conclusion: This study demonstrates that Ex-4 can increase the viabilities of PC12 cells and protect PC12 cells from oxidative stress induced by methylglyoxal, the mechanism may involve in suppressing the activation of protein IκB-α.

PC12 cells; methylglyoxal; oxidative stress; Exendin-4; NAC

國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科基金(老年醫(yī)學(xué)項(xiàng)目)(2015-GJLN-1-03)；福建省臨床重點(diǎn)專(zhuān)科基金(內(nèi)分泌)(2015)

2015-08-21

2016-05-16

R587.1

A

1000-6834(2016)05-426-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.011

△【通訊作者】Tel： 13365910510； E-mail： libin.liu@hotmail.com