郝衛(wèi)軍， 柯瑟章， 劉 霖， 李建華， 羅曉星， 孫玉發(fā)， 曹 劍， 范 利△

(1. 中辦警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處， 北京 100017； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院干部病房， 福建 漳州 363000； 3. 中國人民解放軍總醫(yī)院南樓心內(nèi)科， 北京 100853)

辛伐他汀對糖尿病大鼠阿司匹林抵抗的影響及其機(jī)制*

郝衛(wèi)軍1， 柯瑟章2， 劉 霖3， 李建華3， 羅曉星3， 孫玉發(fā)1， 曹 劍3， 范 利3△

(1. 中辦警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處， 北京 100017； 2. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院干部病房， 福建 漳州 363000； 3. 中國人民解放軍總醫(yī)院南樓心內(nèi)科， 北京 100853)

目的：觀察辛伐他汀對糖尿病大鼠阿司匹林抵抗的作用及機(jī)制。方法：選取雄性8周齡Wistar大鼠96只，隨機(jī)分成糖尿病組和正常組(n=48)。糖尿病組大鼠腹腔一次性注射1%鏈脲佐菌素(STZ) (65 mg/kg，溶于0.l mmol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖液)來誘發(fā)糖尿病模型，正常組大鼠注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。血糖大于16.8 mmol/L且同時具備多飲、多尿、體重減輕的糖尿病癥狀的大鼠認(rèn)為糖尿病造模成功。糖尿病和正常大鼠分別隨機(jī)分為糖尿病對照組(DM)、糖尿病阿司匹林組(DM-ASA)、糖尿病辛伐他汀組(DM-SIM)、糖尿病阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組(DM-ASA+SIM)和正常對照組(NC)、正常阿司匹林組(NC-ASA)、正常辛伐他汀組(NC-SIM)、正常阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組(NC-ASA+SIM)(n=12)。阿司匹林組、辛伐他汀組及阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組分別給予10 mg/kg阿司匹林、2 mg/kg辛伐他汀、10 mg/kg阿司匹林加2 mg/kg辛伐他汀溶于PBS灌胃，對照組給予等量PBS灌胃。連續(xù)灌胃8周后，評價血小板聚集功能和血小板活化指標(biāo)，檢測大鼠血清一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、前列環(huán)素(PGI2)、脂聯(lián)素(APN)、血栓素B2(TXB2)水平和血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平；進(jìn)行大鼠胸主動脈離體血管張力實(shí)驗評價內(nèi)皮功能；檢測大鼠胸主動脈血紅素氧合酶-1(HO-1)、血紅素氧合酶-2(HO-2)、內(nèi)皮型NO合酶(eNOS)、磷酸化-內(nèi)皮型NO合酶(p-eNOS)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)、環(huán)加氧酶-2 (COX-2)等蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組大鼠相比，糖尿病大鼠其血小板活化及聚集值增高，且模型組呈現(xiàn)阿司匹林的反應(yīng)性減低現(xiàn)象(P<0.05)；在糖尿病大鼠，阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀較單用阿司匹林組顯著降低血小板活化及聚集值(P<0.05)，其通過上調(diào)HO-1、eNOS、p-eNOS、Bcl-2等蛋白的表達(dá)水平及升高血清APN水平，下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)水平，通過改善內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)TXA2/PGI2水平、增加NO水平，發(fā)揮其抗血小板作用。結(jié)論：糖尿病大鼠呈現(xiàn)阿司匹林反應(yīng)性減低，辛伐他汀具有潛在的改善血小板對阿司匹林的反應(yīng)性的作用。

辛伐他汀; 糖尿病; 阿司匹林抵抗；大鼠

阿司匹林是防治心腦血管血栓栓塞性疾病抗血小板治療的常用藥，然而近來研究發(fā)現(xiàn)，臨床上服用阿司匹林的患者仍然會發(fā)生血栓事件，即阿司匹林抵抗現(xiàn)象[1]。

研究顯示，阿司匹林抵抗可能與糖尿病有關(guān)[2，3]。與其他心血管危險因素相比，糖尿病患者服用小劑量阿司匹林預(yù)防心血管事件的療效欠佳[4]，其阿司匹林抵抗的發(fā)生率為10%～40%[2]。大多數(shù)糖尿病患者存在血脂紊亂，這可能是糖尿病患者阿司匹林抵抗的發(fā)病機(jī)制之一。近來，有學(xué)者報道他汀類調(diào)脂藥物具有抑制血小板聚集的作用[5]，因此本研究在糖尿病模型上觀察阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀可否具有進(jìn)一步協(xié)同抑制血小板聚集及活化的作用，為阿司匹林抵抗的臨床防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)(美國Sigma公司)；阿司匹林(aspirin)(阿斯利康公司)；辛伐他汀(simvastatin )(杭州默沙東制藥有限公司)；丙二醛檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒、膽紅素檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；NO檢測試劑盒、血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)檢測試劑盒、APN檢測試劑盒、6-Keto-PGF1a檢測試劑盒、ET-1檢測試劑盒(美國Rapidbio公司)；CD62P抗體(美國BD公司)；血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體、HO-2抗體、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體、p-eNOS抗體、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、β-actin單克隆抗體(英國Abcam公司)。

1.1.2 主要儀器 便攜式血糖儀(德國羅氏公司)；BL-42OE生物機(jī)能實(shí)驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；酶標(biāo)儀(美國Molecular Deices公司)；低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；轉(zhuǎn)移電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；全自動生化分析儀(日本日立公司) 。

1.2 動物模型與干預(yù)

1.2.1 實(shí)驗動物與模型建立 選取雄性8周齡Wistar大鼠96只，體重200～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。96只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成糖尿病組和正常組(n=48)。禁食12 h后，糖尿病組大鼠腹腔一次性注射1% STZ(65 mg/kg，溶于0.l mmol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖液)來誘發(fā)糖尿病模型，正常組大鼠注射相同劑量的檸檬酸緩沖液。在基線和STZ注射后3 d，7 d，30 d和10周分別用便攜式血糖計檢測血糖，同時記錄體重。隨機(jī)血糖均需大于16.8 mmol/L、且同時具備多飲、多尿、體重減輕的糖尿病癥狀的大鼠認(rèn)為糖尿病造模成功，納入本研究。正常組大鼠4次隨機(jī)血糖低于8 mmol/L者入選。

1.2.2 動物分組與干預(yù) 糖尿病和正常大鼠分別隨機(jī)分為糖尿病對照組(DM)、糖尿病阿司匹林組(DM-ASA)、糖尿病辛伐他汀組(DM-SIM)、糖尿病阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組(DM-ASA+SIM)、正常對照組(NC)、正常阿司匹林組(NC-ASA)、正常辛伐他汀組(NC-SIM)、正常阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組(NC-ASA+SIM)。阿司匹林組、辛伐他汀組及阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組分別給予10 mg/kg阿司匹林、2 mg/kg辛伐他汀、10 mg/kg阿司匹林加2 mg/kg辛伐他汀溶于一定量的PBS灌胃，對照組給予等量PBS灌胃，連續(xù)8周。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清指標(biāo) 實(shí)驗結(jié)束后，大鼠腹腔注射7%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，稱體重，經(jīng)腹主動脈采血，分離血清。生化分析儀檢測大鼠血糖、血脂等指標(biāo)。分光光度儀檢測大鼠血清超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)、單胺氧化酶(malond ialdehyde, MDA)水平。Elisa法檢測大鼠血清NO、ET、PGI2、APN、TXB2水平。

1.3.2 血小板功能檢測 使用血小板聚集儀，按實(shí)驗操作程序計算出血小板聚集歐姆值。并在TEG分析儀上測算花生四烯酸誘導(dǎo)的聚集率。另外，使用流式細(xì)胞儀檢測血小板表面CD62P的表達(dá)水平。

1.3.3 胸主動脈離體血管張力實(shí)驗 取胸主動脈，置于冰冷的含95% O2、5% CO2的克氏液的浴皿，剔除周圍結(jié)締組織。剪成3 mm左右的血管環(huán)，用兩根不銹鋼微型掛鉤輕柔穿過血管管腔，水平懸掛在10 ml浴漕內(nèi)，下方固定，上方以一細(xì)鋼絲連于張力換能器。經(jīng)生物信號采集分析系統(tǒng)記錄血管的張力變化。浴管內(nèi)含有通以95% O2、5% CO2，37℃的克氏液10 ml。每個血管環(huán)懸掛在浴管后，基礎(chǔ)張力調(diào)至1.5 g，平衡1 h，每30 min換一次營養(yǎng)液。給予10-7mol/L的苯腎上腺素預(yù)收縮，達(dá)平臺期后，分別給予10-9～10-5mol/L乙酰膽堿舒張血管。通過信號采集系統(tǒng)，記錄張力變化。以苯腎上腺素所致的最大收縮張力為100%，然后分別計算出各濃度藥物所致舒張的百分比值，最后得出藥物的濃度-舒張效應(yīng)曲線。

1.3.4 Western blot 分析 Western blot法檢測大鼠胸主動脈HO-1、HO-2、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、COX-2等蛋白的表達(dá)水平。取凍存的胸主動脈組織稱量約20 mg左右，每10 mg組織加入200 μl蛋白裂解液，用玻璃研磨器于冰上勻漿；離心后取上清，按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度；取各組樣品40 μg總蛋白上樣于10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)膜后用TBST配制5%脫脂奶粉封閉，室溫放置1 h；加入一抗孵育，4℃過夜；洗膜，加入二抗，孵育 2 h，TBS-T洗3次，每次5 min；使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液將膜置于暗盒中曝光；將顯色后的膜或底片照相，并用LabWorks軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均為方差齊性，正態(tài)分布，多組間的組間數(shù)據(jù)差異用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重及生化指標(biāo)的改變

DM各組與NC各組相比， DM各組大鼠的體重顯著降低、血糖顯著升高(P<0.05)；NC各組在體重、血糖方面無差異；與NC各組相比，DM各組甘油三酯呈現(xiàn)升高趨勢，且DM組、DM-ASA組甘油三酯水平顯著高于NC各組(P<0.05)。NC和DM各組間在大鼠血脂水平無明顯差異(表1)。

Tab. 1 Comparison of body weight，serum lipid levels，fasting blood glucose among various groups(±s, n=12)

NC: Diabetic control; ASA: Aspirin; SIM: Simvastatin; FBG: Fasting blood glucose; TC: Total cholesterol; TG: Triglyceride; HDL-c: High density liporrotein- cholesterol; LDL-c: Low density liporrotein-cholesterol;

*P<0.05vsthe corresponding each group of NC

2.2 各組大鼠血小板功能的評價

全血阻抗法檢測血小板聚集值和TEG法檢測血小板聚集率，結(jié)果均顯示：DM對照組顯著高于NC組，DM-ASA組顯著高于NC-ASA組(P<0.05)；NC-ASA+SIM和DM-ASA+SIM組分別同NC-ASA、DM-ASA組相比，前者顯著下降(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測大鼠血小板CD62P表達(dá)率，結(jié)果顯示DM各組顯著高于NC各組(P<0.05)。DM-ASA+SIM組CD62P水平顯著低于DM-ASA(P<0.05，表2)。

2.3 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化

DM各組SOD值較NC各組明顯降低(P<0.05)，而MDA值顯著升高(P<0.05)；DM-ASA+SIM組SOD值顯著高于DM-ASA組(P<0.05)，其MDA值較DM-ASA 組呈現(xiàn)下降的趨勢，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異(表3)。

Tab. 2 Comparison of platelet aggregation，CD62P expression among various groups(±s,n=12)

PA(Ohms)PAR(%)CD62P(%)NC10．63±1．9478．47±12．7111．94±2．51NC?ASA7．34±2．8757．68±18．127．83±1．61NC?SIM9．33±2．5770．32±17．458．36±2．85NC?ASA+SIM5．91±2．32#41．75±16．27#6．57±1．80DM12．15±2．06?89．13±13．06?19．98±3．76DM?ASA8．17±2．95#66．28±15．85#18．02±4．33DM?SIM9．58±3．4174．63±14．7818．79±3．46DM?ASA+SIM6．25±2．46△36．81±12．59△13．45±3．74△

NC: Diabetic control; ASA: Aspirin; SIM: Simvastatin; PA: Platelet aggregation; PAR: Platelet aggregation rate

*P<0.05vsNC;?#P<0.05vsNC-ASA;?△P<0.05vsDM-ASA

Tab. 3 Comparison of SOD, MDA levels among various groups(±s,n=12)

SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)NC126．41±18．744．53±1．92NC?ASA132．26±17．694．22±1．81NC?SIM146．15±19．033．94±1．53NC?ASA+SIM170．84±26．327．19±2．34DM51．63±12．37?8．17±3．48?DM?ASA55．78±11．42?7．56±2．89?DM?SIM68．52±15．91?3．81±1．25?DM?ASA+SIM76．38±21．76?#7．08±2．26?

NC: Diabetic control; ASA: Aspirin; SIM: Simvastatin; SOD： Superoxide dismutase; MDA： Malondialdehyde

*P<0.05vsthe corresponding each group of NC;?#P<0.05vsDM-ASA group

2.4 各組NO、TXB2、6-Keto-PGF1α、APN、ET-1的變化

DM各組在NO、6-Keto-PGF1α、APN水平較NC各組明顯降低(P<0.05)，而ET-1、TXB2值顯著升高(P<0.05)；DM-ASA+SIM組NO、TXB2、6-Keto-PGF1α、APN、ET-1水平與DM-ASA比較，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表4)。

2.5 各組離體胸主動脈血管舒張反應(yīng)比較

DM各組胸主動脈環(huán)在10-5mol/L的乙酰膽堿(Ach)誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)百分比值均小于NC組，DM-ASA+SIM組動脈環(huán)在10-5mol/L的Ach引發(fā)的血管舒張反應(yīng)百分比值顯著大于DM-ASA組(P<0.05，圖1)。

Tab. 4 Comparison of NO, TXB2, 6-Keto-PGF1α, APN and ET-1 levels among various groups(±s, n=12)

NC: Diabetic control; ASA: Aspirin; SIM: Simvastatin; NO: Nitric oxide; TXB2: Thromboxane B2; APN: Adiponectin; ET-1: Endothelin-1; 6-Keto-PGF1α: 6 keto prostaglandin F 1α

*P<0.05vsthe corresponding each group of NC;?#P<0.05vsDM-ASA group

Fig. 1 Outcomes of isolated thoracic aorta tension experiment among various groups(n=12)*P<0.05vsDM-ASA

2.6 各組胸主動脈HO-1、HO-2、Bcl-2、eNOS、p-eNOS、COX-2蛋白的表達(dá)

DM-ASA+SIM組HO-1、Bcl-2、eNOS、p-eNOS蛋白相對表達(dá)量較DM其他組升高；NC-ASA+SIM組HO-1、Bcl-2、eNOS、p-eNOS蛋白相對表達(dá)量較NC其他組升高；DM-ASA+SIM組COX-2蛋白相對表達(dá)量較其他DM組降低，NC-ASA+SIM組COX-2蛋白相對表達(dá)量較NC其它組降低；各組HO-2蛋白相對表達(dá)量的無顯著差異(圖2、3，表5、6)。

Fig. 2 Western blot showing HO-1、HO-2、Bcl-2 expression in thoracic aorta among various groups

Tab. 5 Comparison of the relative ratio of HO-1，HO-2,Bcl-2 expression evaluated by densitometric analyses among various groups(±s,n=12)

HO?1HO?2Bcl?2NC0．19±0．010．32±0．030．13±0．06NC?ASA0．29±0．040．39±0．020．26±0．02NC?SIM0．30±0．070．33±0．070．24±0．07NC?ASA+SIM0．46±0．02?0．37±0．010．39±0．02?DM0．12±0．030．35±0．060．14±0．01DM?ASA0．27±0．060．33±0．040．28±0．04DM?SIM0．25±0．020．36±0．060．25±0．03DM?ASA+SIM0．43±0．05#0．38±0．020．40±0．08#

NC: Diabetic control; ASA: Aspirin; SIM: Simvastatin; HO-1: Heme oxygenase-1; BCL-2: B-cell lymphoma-2

*P<0.05vsNC-ASA;?#P<0.05vsDM-ASA

Fig. 3 Western blot showing eNOS、p-eNOS、COX-2 expression in thoracic aorta among various groups

Tab. 6 Comparison of the relative ratio of eNOS，p-eNOS, COX-2 expression evaluated by densitometric analyses among various groups (±s,n=12)

eNOSp?eNOSCOX?2NC0．15±0．020．18±0．070．44±0．03NC?ASA0．31±0．060．32±0．080．30±0．04NC?SIM0．27±0．030．29±0．040．26±0．01NC?ASA+SIM0．39±0．05?0．49±0．02?0．21±0．03?DM0．11±0．020．13±0．010．46±0．02DM?ASA0．29±0．040．28±0．040．32±0．01DM?SIM0．24±0．030．25±0．030．27±0．04DM?ASA+SIM0．37±0．08#0．47±0．06#0．16±0．02#

NC: Diabetic control; ASA: Aspirin; SIM: Simvastatin; eNOS: Endothelial nitric oxide synthase; COX-2: Cyclooxygenase-2

*P<0.05vsNC-ASA;?#P<0.05vsDM-ASA

3 討論

目前應(yīng)用最多的是化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的糖尿病動物模型，其造模方法簡便可靠。STZ通過對實(shí)驗動物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用而發(fā)揮其致糖尿病作用，同時其毒性相對較小，動物存活率高，所致糖尿病模型作用穩(wěn)定、快速、方便、自然緩解少。本實(shí)驗選用STZ 65 mg/kg腹腔注射誘發(fā)糖尿病模型，其72 h后血糖高達(dá)16.7 mmol/L以上，此后血糖維持較高水平。STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型與人類Ⅰ型糖尿病的臨床表現(xiàn)、經(jīng)過及胰島的改變等方面有許多相似之處[6]。已有研究表明，在大血管并發(fā)癥方面，Ⅰ型糖尿病與Ⅱ型糖尿病患者的發(fā)病率相似[7]。故本研究選擇與Ⅰ型糖尿病相似的STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠模型為研究對象。

阿司匹林已在心血管病的二級預(yù)防中廣泛應(yīng)用，并具有確切的療效。但近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分患者存在阿司匹林抵抗現(xiàn)象，這些患者在規(guī)范接受阿司匹林治療后，仍然會發(fā)生缺血性和血栓事件。

研究證實(shí)，糖尿病與阿司匹林抵抗顯著相關(guān)。Cezary 等[8]用全血阻抗法檢測ADP誘導(dǎo)血小板聚集值，發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠阿司匹林不能有效降低ADP誘導(dǎo)的血小板聚集值。本研究結(jié)果顯示，DM組較NC組、DM-ASA組較NC-ASA組在全血阻抗法歐姆值、TEG法血小板聚集率、血小板表面CD62P表達(dá)水平均顯著升高。NC-ASA+SIM較NC-ASA組、DM-ASA+SIM組較DM-ASA組在全血阻抗法歐姆值、TEG法血小板聚集率均顯著下降。DM-ASA+SIM組CD62P水平顯著低于DM-ASA組。這些結(jié)果提示：糖尿病大鼠血小板更易活化、聚集，并且血小板對阿司匹林的反應(yīng)性低于正常大鼠，驗證了糖尿病可能是導(dǎo)致阿司匹林抵抗的重要因素。同時，該結(jié)果也提示聯(lián)用辛伐他汀可顯著抑制血小板的活化、聚集。

既往研究表明，糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血脂紊亂、炎癥反應(yīng)促使血小板活性增強(qiáng)[9]，同時血脂紊亂、炎癥反應(yīng)、胰島素抵激活抗凝血因子并抑制纖溶系統(tǒng)，另外高糖所致血漿和血小板的糖基化，影響了阿司匹林的乙?；痆10，11]，也可能為糖尿病患者阿司匹林抵抗的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，在糖尿病大鼠，阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組較單用阿司匹林組血清NO、6-Keto-PGF1α、APN顯著升高，ET-1、TXB2顯著降低。另外，其胸主動脈HO-1、eNOS、p-eNOS、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，COX-2蛋白水平顯著下調(diào)。研究表明，APN、HO-1、eNOS、p-eNOS、Bcl-2等蛋白的上調(diào)及COX-2蛋白表達(dá)的下調(diào)，可減輕炎癥、氧化應(yīng)激等病理生理過程，從而改善血管內(nèi)皮功能，進(jìn)而減輕血小板的活化、聚集[12-16]。同時，糖尿病大鼠阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀組顯著增加內(nèi)皮胸主動脈舒張反應(yīng)。表明聯(lián)合辛伐他汀治療，可改善糖尿病大鼠內(nèi)皮功能，從而協(xié)同發(fā)揮抗血小板作用。

綜上所述，糖尿病大鼠呈現(xiàn)阿司匹林反應(yīng)性減低的現(xiàn)象，阿司匹林聯(lián)合辛伐他汀可顯著降低糖尿病大鼠的血小板聚集及活化功能，提示辛伐他汀具有潛在的改善血小板對阿司匹林的反應(yīng)性的作用。

[1] Floyd CN, Ferro A. Mechanisms of aspirin resistance[J].PharmacolTher, 2014, 141(1): 69-78.

[2] Ajjan R, Storey RF, Grant PJ. Aspirin resistance and diabetes mellitus[J].Diabetologia, 2008, 51(3): 385-390.

[3] Ertugrul DT, Tutal E, Yildiz M，etal. Aspirin resistance is associated with glycemic control, the dose of aspirin, and obesity in type 2 diabetes mellitus[J].JClinEndocrinolMetab, 2010, 95(6): 2897-2901.

[4] Sacco M， Pellegrini F， Roncaglioni MC，etal. Primary prevention of cardiovascular events with low-dose aspirin and vitamin E in type 2 diabetic patients: results of the Primary Prevention Project (PPP) trial[J].DiabetesCare, 2003, 26(12): 3264-3272.

[5] Sacco M, Pellegrini F, Roncaglioni MC，etal. Rosuvastatin reduces platelet activation in heart failure: role of NO bioavailability[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2005, 25(5): 1071-1077.

[6] King AJ. The use of animal models in diabetes research[J].BrJPharmacol, 2012, 166(3): 877-894.

[7] Laing SP, Swerdlow AJ, Carpenter LM，etal. Mortality from cerebrovascular disease in a cohort of 23 000 patients with insulin-treated diabetes[J].Stroke, 2003, 34(2): 418-421.

[8] Watala C, Ulicna O, Golanski J，etal. High glucose contributes to aspirin insensitivity in streptozotocin-diabetic rats: a multiparametric aggregation study[J].BloodCoagulFibrinolysis, 2006, 17(2): 113-124.

[9] Ajjan R, Grant PJ. Coagulation and atherothrombotic disease[J].Atherosclerosis, 2006, 186(2): 240-259.

[10]Dunn EJ, Philippou H, Ariёns RA，etal. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus[J].Diabetologia, 2006, 49(5): 1071-1080.

[11]Watala C, Boncler M, Gresner P. Blood platelet abnormalities and pharmacological modulation of platelet reactivity in patients with diabetes mellitus[J].PharmacolRep, 2005, 57 Suppl: 42-58.

[12]Renna NF, Vazquez MA, Lama MC，etal. Effect of chronic aspirin administration on an experimental model of metabolic syndrome[J].ClinExpPharmacolPhysiol, 2009, 36(2): 162-168.

[13]Kunieda Y, Nakagawa K, Nishimura H，etal. HMG CoA reductase inhibitor suppresses the expression of tissue factor and plasminogen activator inhibitor-1 induced by angiotensin II in cultured rat aortic endothelial cells[J].ThrombRes, 2003, 110(4): 227-234.

[14]Shao H, Shen Y, Liu H，etal. Simvastatin suppresses lung inflammatory response in a rat cardiopulmonary bypass model[J].AnnThoracSurg, 2007, 84(6): 2011-2018.

[15]Leytin V, Mody M, Semple JW，etal. Flow cytometric parameters for characterizing platelet activation by measuring P-selectin (CD62) expression: theoretical consideration and evaluation in thrombin-treated platelet populations[J].BiochemBiophysResCommun, 2000, 269(1): 85-90.

[16]Remuzzi G, Benigni A, Dodesini P，etal. Reduced platelet thromboxane formation in uremia. Evidence for a functional cyclooxygenase defect[J].JClinInvest, 1983, 71(3): 762-768.

The experimental study of simvastatin on improving aspirin resistance in diabetic rats

HAO Wei-jun1, KE Se-zhang2, LIU Lin3, LI Jian-hua3, LUO Xiao-xing3, SUN Yu-fa1, CAO Jian3, FAN Li3△

(1. Health Care Section of Security Bureau, Chinese PLA General Staff Department, Beijing 100017; 2. Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Zhangzhou 363000; 3. Geriatric Cardiology Department of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective: The purpose of the present study was to investigate the effects of the combination of aspirin, simvastatin in diabetic rat on platelet function. Methods: Eight-week-old male Wistar rats were selected and randomly divided into diabetic group (n=48) and normal control group (n=48). Diabetic rats were injected with 1% STZ (65mg/kg, dissolved in 0.l mmol/L, pH 4.5 citrate buffer) to induce diabetic model and the rats in normal control group were injected with the same dose of citrate buffer. A rat with blood glucose greater than 16.8 mmol/L and along with diabetic symptoms of polydipsia, polyuria and weight loss was considered the successful model of diabetes. Diabetic rats and normal Wistar rats were randomly divided into 4 groups and given aspirin(10 mg/kg), simvastatin(2 mg/kg), combination of aspirin(10mg/kg) and simvastatin(2 mg/kg), PBS for 8 weeks, respectively. The platelet function and the expression of CD62P were evaluated. The levels of nitric oxide (NO), endothelin (ET), thromboxane B2(TXB2), prostacyclin (PGI2), adiponectin (APN), TXB2 were detected in the serum. The expressions of heme oxygenase-1(HO-1), HO-2, endothelial nitric oxide synthase(e-NOS), p-eNOS, B-cell lymphoma-2(Bcl-2), cyclooxygenase-2(COX-2) in thoracic aorta were evaluated by Western blot. Results: Compared with control rats, diabetic rats had high platelet aggregation and activation (P<0.05), which treated aspirin also showed lower aspirin sensitivity (P<0.05). The combination of drugs upregulated the expression of HO-1, eNOS, p-eNOS, BCL-2, APN levels and decreased the expression of COX-2, and had a greater inhibitory effect on platelet aggregation and activation. The combination of drugs improved endothelial function, adjusted TXA2/PGI2 levels and increased NO levels, which resulted in a great potential antiplatelet effect. Conclusion: These results suggest that simvastatin may improve the effect of aspirin on anti-platelet function in diabetic rats.

simvastatin; diadetes; platelet resistance; rat

軍隊“十二五”保健課題(12BJZ39)；總參保健課題(ZCWS14B09)

2016-05-10

2016-06-28

R34

A

1000-6834(2016)05-395-06

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.003

△【通訊作者】Tel: 010-66939114; E-mail: calvin301@163.com