武 磊， 周學(xué)思， 杲修杰， 楊苗苗,2， 張志清， 李景剛， 王天輝△

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050； 2. 天津體育學(xué)院, 天津 300381； 3. 空軍后勤部疾病預(yù)防控制中心， 北京 100076)

離體大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立及評(píng)價(jià)*

武 磊1， 周學(xué)思1， 杲修杰1， 楊苗苗1,2， 張志清1， 李景剛3， 王天輝1△

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050； 2. 天津體育學(xué)院, 天津 300381； 3. 空軍后勤部疾病預(yù)防控制中心， 北京 100076)

目的：建立離體大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，為細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡的調(diào)控研究提供基礎(chǔ)。方法：大鼠斷頭處死在無(wú)菌條件下開(kāi)胸取主動(dòng)脈，經(jīng)組織塊培養(yǎng)法后傳代培養(yǎng)得到充足主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，接種于96孔板或爬片培養(yǎng)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，用于之后的各項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)。以不加H2O2的組作為對(duì)照組，以不同濃度的H2O2(100、200、300、400、500 μmol/L)作用于內(nèi)皮細(xì)胞相同時(shí)間12 h，來(lái)篩選最佳作用濃度；依據(jù)結(jié)果以相同濃度的H2O2(100和200 μmol/L)分別作用不同時(shí)間(3、6、9、12及24 h)，來(lái)篩選最佳作用時(shí)間。通過(guò)免疫熒光法鑒定、細(xì)胞存活率檢測(cè)、生化指標(biāo)(LDH-L、NO、MDA、SOD)檢測(cè)及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)等變化，評(píng)價(jià)及驗(yàn)證模型的建立。結(jié)果：對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ⅷ型膠原抗原進(jìn)行免疫熒光染色后鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功；在12 h的相同作用時(shí)間下，隨著H2O2濃度的加大，細(xì)胞存活率呈顯著下降(77.63%±5.20%～40.90%±2.10%)；相同濃度(100 μmol/L組和200 μmol/L組)隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞存活率呈顯著遞減(100 μmol/L組為86.83%±12.11%～44.26%±5.70%，200 μmol/L組為78.28%±11.98%～34.45%±5.87%)；以H2O2濃度為100 μmol/L作用3、6、9、12及24 h，培養(yǎng)液中生化指標(biāo)在9 h后LDH-L與MDA呈顯著遞增，NO與SOD呈顯著遞減；在H2O2濃度為100 μmol/L與作用時(shí)間12 h的條件下，流式檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率為16.92%±2.37%，顯著高于對(duì)照組2.68%±0.47%(P<0.01)； TUNEL檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)為17.65%±2.36%，顯著高于對(duì)照組的3.23%±0.57%(P<0.01)。結(jié)論：該方法成功建立了體外血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探索了輕重適度的誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡的造模方法，可以成為開(kāi)展多種血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及凋亡調(diào)控機(jī)制研究的基礎(chǔ)。

大鼠；內(nèi)皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；損傷；凋亡；模型

心血管疾病是造成世界范圍內(nèi)致殘和過(guò)早死亡的主要原因，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為組織與血液循環(huán)之間的關(guān)鍵屏障，是所有心血管疾病的共同作用靶點(diǎn)[1]。研究表明，內(nèi)皮功能受損患者血管疾病事件的發(fā)生率明顯高于無(wú)內(nèi)皮功能受損患者[2]。氧化應(yīng)激是心血管內(nèi)皮功能障礙的重要誘因之一，在心血管疾病的發(fā)生中起著重要作用[3]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)源性產(chǎn)生的氧化物質(zhì)失衡或外源性氧化物質(zhì)的過(guò)量攝入,導(dǎo)致氧化性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積而引發(fā)氧化-還原反應(yīng)失衡狀態(tài)。心血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是氧化應(yīng)激損傷的主要形式，同時(shí)也是多種心血管疾病發(fā)生與演變的前奏[4]。

在心血管疾病的研究中，血管內(nèi)皮細(xì)胞是體外實(shí)驗(yàn)常用的造模細(xì)胞，而造模方法與劑量時(shí)間的選擇，是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，對(duì)探索氧化應(yīng)激致心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，對(duì)防治此類疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的指導(dǎo)作用。為了建立研究所需的細(xì)胞損傷輕重適度的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，在參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)摸索和篩選，通過(guò)檢測(cè)和驗(yàn)證，制作既能造成細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而又不大范圍死亡的細(xì)胞損傷模型，為各類相關(guān)研究提供模型基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雄性，180～220 g。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK-(軍)2007-004)。

1.2 主要試劑與儀器

M199培養(yǎng)基(GIBCO BRL公司),胰蛋白酶(Serva公司)，特級(jí)胎牛血清 (上海尚寶生物科技有限公司)，封閉用山羊血清、封閉用兔血清(天津翔天生物公司)，雙抗(華北制藥)，多聚賴氨酸、四唑鹽(MTT)、PMSF(Sigma公司)，乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)測(cè)定試劑盒(北京中生北控生物科技有限公司)，一氧化氮(nitric oxide, NO)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Ⅷ因子相關(guān)抗原兔抗大鼠多克隆抗體、羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(武漢博士德公司)，TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒(ROCHE公司)，RIPA 裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，核蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，過(guò)氧化氫(30%AR，H112515，上海阿拉丁生化科技公司)，其余試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。ARA1140電子天平(美國(guó)OHAUS)，UV8500紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(海天美公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(北京儀器廠)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)TLL-C型(北京四環(huán)科學(xué))，Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Electron公司)，GH802-2型超凈臺(tái)(天津生物凈化設(shè)備廠)，倒置顯微鏡(OLMPUS)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

以不加H2O2的組作為對(duì)照組，以不同濃度的H2O2(100、200、300、400、500 μmol/L)作用于內(nèi)皮細(xì)胞相同時(shí)間12 h，然后以相同濃度的H2O2(100和200 μmol/L)分別作用不同時(shí)間(3、6、9、12及24 h)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，篩選最佳作用濃度和時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)免疫熒光法鑒定、細(xì)胞存活率檢測(cè)、生化指標(biāo)檢測(cè)及氧化應(yīng)激損傷后內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)變化來(lái)判斷體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立情況。

1.3.1 組織材料培養(yǎng)方法 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法，傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇參照文獻(xiàn)[5]。大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法：(1)將大鼠斷頭處死，然后迅速開(kāi)胸取出主動(dòng)脈，無(wú)菌條件下快速浸泡于PBS中，剔除血管上的結(jié)締組織后，剪開(kāi)動(dòng)脈血管平展鋪于PBS浸濕的濾紙上，剪成1×2 mm2左右的小塊。(2)用眼科鑷將剪切好的動(dòng)脈組織塊送入培養(yǎng)瓶中，動(dòng)脈內(nèi)膜貼在培養(yǎng)瓶壁上，用牙科探針在瓶壁上均勻擺置，每小塊間距5 mm 左右。組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)注入適量培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶斜放在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。(3)放置培養(yǎng)2～4 h 待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，培養(yǎng)液與組織塊完全接觸后，靜置培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)4～5 d后，細(xì)胞從組織塊周圍爬出，待細(xì)胞基本鋪滿組織塊之間的空隙時(shí)，取出組織塊，細(xì)胞傳代。

主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合形成單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗一次，0.25%的胰酶消化，在顯微鏡下觀察，見(jiàn)到細(xì)胞收縮和聚集時(shí)，倒去消化液，加入含10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)瓶。放入37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)情況。每隔2 d換液。

細(xì)胞凍存方法：0.25%的胰酶將長(zhǎng)成致密單層的細(xì)胞消化下來(lái)，吹打成細(xì)胞懸液，吸入離心管1 000×g離心10 min，棄上清，加入含20% FCS，10%二甲基亞砜的培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞，移至凍存管。置于4℃ 2 h，-20℃ 6 h，-70℃過(guò)夜后置于液氮中保存。

細(xì)胞復(fù)蘇方法：從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中，讓其在1 min內(nèi)融化，將細(xì)胞懸液吸出移入離心管中，加入含10% FCS培養(yǎng)液，吹打混勻后離心，用培養(yǎng)液洗2次后移入培養(yǎng)瓶，置于CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng),隔天換液。

1.3.2 內(nèi)皮細(xì)胞鑒定方法 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光法鑒定血管內(nèi)皮細(xì)胞：(1)細(xì)胞爬片，用PBS洗3次，每次2 min。用預(yù)冷的多聚甲醛(4%)37℃固定15 min；(2)用PBS洗3次，每次2 min。0.1%的Triton x-100 室溫透化細(xì)胞5 min；(3)用PBS洗3次，每次2 min。加5%山羊血清封閉液2 ml，4℃過(guò)夜；(4)用PBS洗3次，每次2 min。加1∶50稀釋的Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體(兔抗大鼠)50 μl，37℃作用1 h；(5)用PBS洗3次，每次2 min。加1∶10稀釋的山羊抗兔羅丹明標(biāo)記的二抗50 μl，37℃作用45 min；(6)用PBS洗3次，每次2 min。50%的甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞陽(yáng)性呈紅色。

1.3.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)方法 四唑鹽(MTT)比色法：血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板， H2O2作用結(jié)束后，棄去原有培養(yǎng)液。換成無(wú)血清M199培養(yǎng)基200 μl/well，每孔加MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃、5%CO2孵育 4 h, 終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液上清，每孔加入150 μl DMSO,振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值。

1.3.4 生化指標(biāo)檢測(cè)方法 血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中生化指標(biāo)乳酸脫氫酶(LDH)同工酶(LDH-L)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定方法參照各試劑盒說(shuō)明書。

1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 采用PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率: 獲得單個(gè)細(xì)胞的懸浮液對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量十分關(guān)鍵。因此上機(jī)前必須將樣品制成單細(xì)胞懸液，步驟如下：(1)倒去培養(yǎng)液，加入適量無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS液，停留片刻去掉；(2)加入適量0.25%胰酶(或0.02%EDTA+0.25%胰酶)消化液，3 min后，肉眼或鏡下觀察，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙時(shí)倒去消化液；(3)加入培養(yǎng)液，用吸管吸取適量培養(yǎng)液吹打細(xì)胞(機(jī)械分散)，直到將貼壁細(xì)胞吹下并分散為單個(gè)細(xì)胞。固定全細(xì)胞的PI染色方法：(1)將分離細(xì)胞移至15 ml錐形管中。檢查有單個(gè)細(xì)胞懸浮，1 000 ×g離心5 min，棄上清；(2)用不含Ca2+或Mg2+的PBS將細(xì)胞洗2次，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，即在管上；(3)用約500 μl的PBS重懸細(xì)胞；(4)加5 ml冷乙醇，4℃固定過(guò)夜(當(dāng)旋轉(zhuǎn)攪拌防止結(jié)團(tuán)時(shí)，要非常慢地加入乙醇。在染色前，細(xì)胞可以保持固定3周以上)；(5)用含1%BSA或1%小牛血清的800 μl 10×PI溶液(500 μg/ml PI，Sigma；在3.8×10-2mol/L檸檬酸鈉溶液中，pH 7.0)；(6)加入100 μl煮沸過(guò)的RNA酶A，37℃孵育30 min；(7)用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析固定的樣品。

采用TUNEL法原位檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，方法參照試劑盒說(shuō)明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光鑒定大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

Ⅷ型膠原抗原是內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原，可作為內(nèi)皮細(xì)胞鑒定的依據(jù)。用羅丹明標(biāo)記的抗體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ⅷ型膠原抗原進(jìn)行免疫熒光染色后，含有Ⅷ型膠原抗原的正常血管內(nèi)皮細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光陽(yáng)性反應(yīng)(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ)，證實(shí)細(xì)胞內(nèi)有內(nèi)皮細(xì)胞特有的Ⅷ型膠原抗原存在。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目在98%以上，可以用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的劑量-時(shí)間效應(yīng)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用不同濃度(100、200、300、400、500 μmol/L)的H2O2作用于內(nèi)皮細(xì)胞12 h，于96孔板上每種濃度各6孔，并以不加H2O2的組作為對(duì)照組(Control group,C)。MTT檢測(cè)結(jié)果表明，H2O2不同濃度各組的內(nèi)皮細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組，隨著H2O2濃度的加大，細(xì)胞存活率呈顯著降低趨勢(shì)(表1)?？紤]100 μmol/L組(77.63%±5.2%)和200 μmol/L組(50.41%±6.7%)的細(xì)胞存活率已滿足實(shí)驗(yàn)?zāi)康模m有降低但仍處于較高水平有助于恢復(fù)，且屬于可以恢復(fù)的可逆性損傷的水平，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用H2O2100 μmol/L和200 μmol/L兩種不同濃度作用不同時(shí)間來(lái)篩選最佳作用時(shí)間點(diǎn)。

Tab. 1 The rate of the effects of different doses of H2O2 on the survival of endothelial cells(±s, n=6)

*P<0.05vscontrol group

將100 μmol/L和200 μmol/L兩種濃度的H2O2分別作用不同時(shí)間(3、6、9、12及24 h)，并以不加H2O2的組作為對(duì)照組。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，3、6、9、12和24 h組的內(nèi)皮細(xì)胞存活率均顯著低于對(duì)照組，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組呈現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞存活率顯著降低的變化趨勢(shì)(表2)。100 μmol/L和200 μmol/L組變化趨勢(shì)基本相同，均滿足研究所需，其中100 μmol/L組在5個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)的內(nèi)皮細(xì)胞存活率均高于200 μmol/L，且在12 h時(shí)間存活率高于60%，從內(nèi)皮細(xì)胞損傷恢復(fù)方面考慮，采用100 μmol/L H2O2作為實(shí)驗(yàn)濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

Tab. 2 The effects of different time on the survival rate of endothelial cells at the same dose of H2O2(±s,n=6)

Time(h)H2O2doses(μmol/L)100μmol/LCellviability(%)200μmol/LCellviability(%)0100100386．83±12．11?78．28±11．98?680．59±10．32?70．60±9．87?976．54±9．90?55．48±9．23?1271．83±7．80?49．13±6．67?2444．26±5．70?34．45±5．87?

*P<0.05vscontrol group

2.3 H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中生化指標(biāo)的影響

以不加H2O2的組作為對(duì)照組，加入100 μmol/L H2O2分別作用3 h、6 h、9 h、12 h及24 h。3 h和6 h組與C組相比培養(yǎng)液中LDH-L、NO、MDA、SOD含量均無(wú)顯著變化。9 h組(2.43±0.34)U/L、12 h組(4.61±0.66)U/L及24 h組(7.68±1.29)U/L的LDH-L含量遞增，顯著高于C組(1.94±0.36)U/L；9 h組(35.56±3.43)μmol/L、12 h組(24.46±3.92)μmol/L及24 h組(14.45±2.88)μmol/L的NO含量遞減，顯著低于C組(53.06±4.59)μmol/L；9h組(3.72±0.51)nmol/L、12 h組(6.54±0.54)nmol/L及24 h組(7.97±0.71)nmol/L的MDA含量遞增，顯著高于C組(1.57±0.34)nmol/L；9 h組(9.21±0.68)U/ml、12 h組(8.30±0.36)U/ml及24 h組(7.12±0.53)U/ml的SOD含量遞減，顯著低于C組(10.72±0.52)U/ml。說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2所造成的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷出現(xiàn)加重趨勢(shì)(表3)。

Time(h)LDH?L(U/L)NO(μmol/L)MDA(nmol/ml)SOD(U/ml)01．94±0．3653．06±4．591．57±0．3410．72±0．5231．98±0．2850．00±3．501．73±0．1310．67±0．2762．28±0．1849．86±3．151．98±0．3010．62±0．3292．43±0．34?35．55±3．43?3．72±0．51?9．21±0．68?124．61±0．66?24．46±3．92?6．54±0．54?8．30±0．36?247．68±1．29?14．45±2．88?7．97±0．71?7．12±0．53?

LDH: Lactate dehydrogenase; NO: Nitric oxide; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase

*P<0.05vscontrol group

2.4 H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入100 μmol/L H2O2作用12 h，并以不加H2O2的組作為對(duì)照組，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，12 h組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率16.92%±2.37%顯著高于對(duì)照組2.68%±0.47%(P<0.01)，提示H2O2能夠?qū)е录?xì)胞凋亡率增加。

進(jìn)行TUNEL檢測(cè)后結(jié)果表明，氧化應(yīng)激損傷組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)17.65%±2.36%顯著高于對(duì)照組3.23%±0.57%(P<0.01, 圖2，圖2見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅱ)，證明在該濃度時(shí)間條件下能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞適度損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)主要通過(guò)如下途徑，對(duì)維持心血管系統(tǒng)正常運(yùn)行發(fā)揮重要作用：(1)調(diào)節(jié)血管張力；(2)參與血管重構(gòu)；(3)抗血小板聚集和抗血栓形成；(4)參與炎癥反應(yīng)；(5)選擇性通透循環(huán)物質(zhì)。引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素很多，主要包括：(1)氧化應(yīng)激；(2)同型半胱氨酸血癥；(3)血流動(dòng)力和血管應(yīng)力；(4)血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)；(5)煙草、毒素等細(xì)胞毒性物質(zhì)及免疫因素等。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷不僅可以促進(jìn)血管局部血栓的形成，還可釋放血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、內(nèi)皮素、5-羥色胺、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、粘附分子等血管活性分子，促進(jìn)血管的收縮，進(jìn)而啟動(dòng)和引起一系列損傷后反應(yīng)，導(dǎo)致心血管疾病(冠心病、高血壓等)以及經(jīng)皮冠脈介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生[6，7]。

在很多引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因素中，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷在心血管內(nèi)皮功能障礙和心血管疾病的發(fā)生中起著重要作用。H2O2是一類活性氧，它不僅能直接氧化細(xì)胞膜上的脂質(zhì)及蛋白，而且能自由穿過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)鐵離子反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。我們通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，首先驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)成功；又以濃度梯度和時(shí)間梯度通過(guò)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化證實(shí)H2O2對(duì)細(xì)胞氧化損傷存在的劑量-時(shí)間關(guān)系；依據(jù)兩次結(jié)果篩選出細(xì)胞損傷輕重適度且滿足所需的100 μmol/L濃度和12 h作用時(shí)間做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

在接下來(lái)幾項(xiàng)生化指標(biāo)的選取上，LDH廣泛存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，胞漿中LDH大量釋放到細(xì)胞外而使血液中的LDH活性水平升高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LDH活性水平的遞增是細(xì)胞損傷程度加劇的重要標(biāo)志。NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有舒張血管平滑肌、抗血小板聚集、抗血小板和血細(xì)胞黏附及抗血管平滑肌細(xì)胞增生等多種生物學(xué)功能[8]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NO含量的遞減提示內(nèi)皮細(xì)胞損傷加劇從而抑制NO的合成。MDA是心血管組織脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，MDA在血液中的含量是反映心血管組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度和心血管組織損傷水平的敏感性指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDA含量的遞增提示內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)氧化損傷加劇。SOD是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分[9]，主要作用是清除機(jī)體內(nèi)氧自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SOD活性遞減反應(yīng)細(xì)胞清除氧自由基的能力減弱，提示細(xì)胞損傷加劇。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著H2O2濃度的加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率呈顯著遞減趨勢(shì)，細(xì)胞損傷呈顯著遞進(jìn)趨勢(shì)。為了使內(nèi)皮細(xì)胞處于尚能保護(hù)的自由基環(huán)境，達(dá)到細(xì)胞損傷輕重適度，既能造成細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而又不大范圍死亡的需要，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定以100 μmol/L濃度 H2O2誘導(dǎo)損傷時(shí)間為12 h的造模條件，建立內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，保證實(shí)驗(yàn)的可行性，與某些文獻(xiàn)報(bào)道的濃度基本吻合[10]，作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。綜合流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)的驗(yàn)證，判斷血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型成功建立，該方法可以成為開(kāi)展主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制研究的模型基礎(chǔ)。

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Establishment and evaluation of oxidative stress injury model of in vitro rat aortic endothelial cells

WU Lei1, ZHOU Xue-si1, GAO Xiu-jie1, YANG Miao-miao1,2, ZHANG Zhi-qing1, LI Jing-gang3, WANG Tian-hui1△

(1. Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050; 2. Tianjin University of Sport, Tianjin 300381; 3. Air Force Logistics Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100076, China)

Objective: To establish a model of oxidative stress injury in cultured rat aortic endothelial cells, and to provide a basis for the research of cell injury and apoptosis. Methods: The rats were decapitated to get the aorta in thoracic operation under aseptic conditions. By subculture after tissue block culture method to get sufficient aortic endothelial cells, cultured in 96-well plates or grow on cover glass for the following test. Without H2O2group as a control group, with different doses of H2O2(100,200,300,400,500 μmol/L) treated endothelial cells in 12 h to screen the optimal dose. Based on the results, with the same dose of H2O2(100 or 200 μmol/L) acted on endothelial cells respectively in different time (3, 6, 9, 12 and 24 h) to screen the optimal duration. Each group was made in sextuplicate. The establishment of the model was evaluated by immunofluorescence, cell viability testing, biochemical indicators detection (lactate dehydrogenase(LDH), nitric oxide(NO), malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD))and apoptosis index testing. Results: Endothelial cells were cultured successfully and verified by immunofluorescence staining of intracellular antigen Ⅷ collagen. With the increase of H2O2doses at the same action time 12 h, the cell viability was significantly decreased (77.63%±5.20% to 40.90%±2.10%). The same dose(100 μmol/L group and 200 μmol/L group)with the action time increasing, the cell viability was significantly decreased (100 μmol/L group was 86.83%±12.11% to 44.26%±5.70%, 200 μmol/L group was 78.28%±11.98% to 34.45%±5.87%). At dose of H2O2was 100 μmol/L and treated in 3,6,9,12 and 24 h, LDH-L and MDA were significantly increased after 9 h while NO and SOD were significantly decreased. In H2O2dose of 100 μmol/L and action time 12 h, flow cytometry showed endothelial cell apoptosis rate was 16.92%±2.37%, significantly higher than the control group of 2.68%±0.47%(P<0.01); TUNEL detected endothelial cell apoptosis index was 17.65%±2.36%, which was significantly higher than that in the control group of 3.23%±0.57%(P<0.01). Conclusion: The method was successfully established a model of oxidative stress injury in cultured rat aortic endothelial cells, explore the moderate conditions that induced cells injury and apoptosis which could be a basis for the research.

rats; endothelial cells; oxidative stress; injury; apoptosis; model

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(81373108，30971421)

2015-08-13

2016-06-13

R361+.3

A

1000-6834(2016)04-390-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.002

△【通訊作者】Tel: 022-84655322； E-mail: wydny668@163.com