湯謐，劉曄，任儉，張娜，曾紅霞，程維舜，李煜華，孫玉宏（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院作物科學(xué)研究所，430345）

風(fēng)味甜瓜中檸檬酸代謝研究進(jìn)展及RNA-seq技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

湯謐，劉曄，任儉，張娜，曾紅霞，程維舜，李煜華，孫玉宏
（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院作物科學(xué)研究所，430345）

摘 要：隨著人們生活水平的提高，兼具品質(zhì)、營養(yǎng)和健康特征的甜瓜新品種——風(fēng)味甜瓜應(yīng)運(yùn)而生，探索適度的風(fēng)味甜瓜糖酸比非常重要，而目前對(duì)甜瓜果實(shí)中主要有機(jī)酸成分檸檬酸的代謝機(jī)制尚不清晰，因此，綜述了風(fēng)味甜瓜果實(shí)檸檬酸代謝特性的研究進(jìn)展，并對(duì)利用RNA-seq技術(shù)分析甜瓜果實(shí)檸檬酸代謝關(guān)鍵基因的挖掘提出了一些展望。

關(guān)鍵詞：風(fēng)味甜瓜；檸檬酸；RNA-seq技術(shù)；基因挖掘；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)∶S651文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼∶A文章編號(hào)∶1001-3547（2016）24-0040-05

甜瓜（Cucumis meloL.），葫蘆科（Cucurbitaceae)甜瓜屬（Cucumis）一年生蔓性草本植物。其果實(shí)通常呈球形或長橢圓形，果皮平滑，有縱溝紋；果肉白色、黃色或綠色，味美甘甜；含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、煙酸、鈣、鐵等營養(yǎng)物質(zhì)，是夏季常見的消暑瓜果之一，在果蔬生產(chǎn)和消費(fèi)中占據(jù)著重要地位。2012年全國甜瓜播種面積達(dá)41萬hm2，總產(chǎn)量高達(dá)1 330萬t，已穩(wěn)超麻類、煙草等經(jīng)濟(jì)作物，成為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收的高效園藝作物（《全國西瓜甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2015-2020年）》；2014年，全國甜瓜播種面積達(dá)43.89萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)1 475.80萬t（《中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料（2014）》）。但是隨著人們生活水平的提高，傳統(tǒng)的高糖純甜單一口味的甜瓜已不能滿足人們的多樣化需求，兼具品質(zhì)、營養(yǎng)和健康特征的果蔬越來越受歡迎，糖、酸含量較高的甜瓜新品種——風(fēng)味甜瓜因此問世。

外觀、營養(yǎng)和風(fēng)味是決定甜瓜品質(zhì)的關(guān)鍵，而風(fēng)味品質(zhì)是消費(fèi)者尤為追求的。甜瓜風(fēng)味品質(zhì)主要由可溶性糖和有機(jī)酸的含量決定，適當(dāng)?shù)奶撬岜扔兄诠麑?shí)風(fēng)味品質(zhì)的提升，產(chǎn)生最佳的口感[1]。因此，研究這2種物質(zhì)的調(diào)控機(jī)制和代謝轉(zhuǎn)化非常重要。研究表明，甜瓜品種不同，其果實(shí)內(nèi)可溶性糖的成分和含量有差異，早熟甜瓜品種，由于生育期短，光合產(chǎn)物提前進(jìn)入果實(shí)，因此其可溶性糖的主要成分是果糖和葡萄糖；中晚熟甜瓜品種，果實(shí)發(fā)育前期可溶性糖主要成分是果糖和葡萄糖，后期主要是蔗糖[2]，而總糖、果糖、葡萄糖和蔗糖含量均受主基因和多基因控制[3]；甜瓜果實(shí)中可溶性糖的積累主要發(fā)生在果實(shí)發(fā)育的中后期，其與蔗糖磷酸合成酶和酸性轉(zhuǎn)化酶的活性有關(guān)，若合成酶活性升高而轉(zhuǎn)化酶活性降低，糖分就會(huì)不斷積累[4]。除此之外，溫光因子也會(huì)影響糖分含量的積累，如日溫差積累對(duì)果實(shí)總糖含量有影響，有效積溫積累對(duì)果實(shí)葡萄糖含量有影響，而有效輻射積累對(duì)果實(shí)果糖和蔗糖含量均有影響[3]。

有機(jī)酸成分和含量也是影響果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的主要因素，其成分以檸檬酸為主，還包括蘋果酸、琥珀酸等。研究表明，甜瓜中有機(jī)酸積累的遺傳多態(tài)性較低；此外，日溫差積累對(duì)果實(shí)總酸、檸檬酸、蘋果酸含量影響較大[3]，而在目前研究中對(duì)于調(diào)控檸檬酸代謝的調(diào)控機(jī)制還不是特別清晰，其分子標(biāo)記方面的研究也較少[5]，挖掘的關(guān)鍵基因也比較少，因此，運(yùn)用RNA-seq技術(shù)研究甜瓜果實(shí)中檸檬酸代謝特性，并挖掘其中主要的調(diào)控基因，對(duì)提高甜瓜果實(shí)檸檬酸的含量具有重要作用。

1 檸檬酸代謝途徑研究進(jìn)展

葡萄糖經(jīng)過三羧酸循環(huán)生成丙酮酸，丙酮酸主要有兩方面的去處，一是在丙酮酸脫氫酶的作用下氧化脫羧生成乙酰CoA（乙酰輔酶A），二是在丙酮酸羧化酶的作用下羧化生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA在檸檬酸合酶的作用下縮合生成檸檬酸。Lobit等[6]利用依賴于簡化的線粒體三羧酸循環(huán)表示的檸檬酸代謝模型預(yù)測了果實(shí)快速生長期檸檬酸的含量，該模型僅考慮了三羧酸循環(huán)的3個(gè)中間體（檸檬酸、蘋果酸和丙酮酸），并假設(shè)2個(gè)組分之間的流動(dòng)僅受酶活性、溫度、初始濃度、目標(biāo)組分濃度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的CO2被呼吸作用同化后，在細(xì)胞質(zhì)和線粒體之間的流動(dòng)除了受溫度和酶活性影響外，主要受兩區(qū)室之間的濃度梯度影響[3]。

1.1 風(fēng)味甜瓜中的檸檬酸代謝

經(jīng)過前人的研究可以看出，風(fēng)味甜瓜果實(shí)中的有機(jī)酸主要是檸檬酸[7，8]，其含量占果實(shí)鮮質(zhì)量的1.0%，而傳統(tǒng)甜瓜僅為0.2%[9]。研究表明，甜瓜中有機(jī)酸含量由主基因和多基因控制，而檸檬酸合成酶、乙烯、Ca2+-CaM信號(hào)系統(tǒng)這3類基因的上調(diào)表達(dá)均與檸檬酸積累有關(guān)[3]。湯謐[9]以風(fēng)味3號(hào)甜瓜為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)PEPC（檸檬酸合酶）、CS（丙酮酸羧化酶）、IDH（異檸檬酸合酶）和MDH（蘋果酸脫氫酶）這4種酶活性變化與檸檬酸含量的變化呈顯著相關(guān)。可見，在植物細(xì)胞中，檸檬酸的積累不是單一的某一生化反應(yīng)的結(jié)果，而是一系列生理過程的綜合結(jié)果。

1.2 其他園藝作物中的檸檬酸代謝

檸檬酸代謝特性在柑橘類研究中已比較成熟。孫琦[10]指出檸檬酸降解有2條途徑∶一條途徑是在順烏頭酸酶（ACO）的催化下被轉(zhuǎn)化為異檸檬酸，另一條途徑是在ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-CL）的作用下，被分解為草酰乙酸和乙酰輔酶A。此外，檸檬酸通過谷氨酸代謝途徑也從兩方面實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化和減酸，一是在GAD（谷氨酸脫羧酶）的作用下，檸檬酸進(jìn)入GABA（γ-氨基丁酸）循環(huán)而被消耗，二是在GS（谷氨酰胺合成酶）的催化下形成谷酰胺，進(jìn)入氨基酸代謝途徑。檸檬酸在柑橘中的代謝機(jī)制表現(xiàn)為檸檬酸→異檸檬酸、酮戊二酸和谷氨酸，此后谷氨酸被分解 （分解代謝的途徑為谷氨酸→GABA→琥珀酸半醛→琥珀酸）或者用于合成谷氨酸鹽[9]。在研究檸檬酸與蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑時(shí)，Rafaelr等[11]主要研究了其在檸檬酸通道中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘋果酸能強(qiáng)烈地抑制檸檬酸離子通道運(yùn)輸，但對(duì)依賴ATP的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)影響很小，因此認(rèn)為在柑橘果肉細(xì)胞中，檸檬酸及蘋果酸進(jìn)入液泡的通道相同。檸檬酸從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡時(shí)，需要通過液泡上的H+-ATP酶（V-ATPase）調(diào)節(jié)，同時(shí)在轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中也伴隨著質(zhì)子的流動(dòng)[12]。

2 風(fēng)味甜瓜中調(diào)控檸檬酸代謝的主要基因研究進(jìn)展

雖然對(duì)于風(fēng)味甜瓜果實(shí)中檸檬酸的代謝機(jī)制的研究尚不清楚，但目前運(yùn)用分子標(biāo)記等現(xiàn)代生物技術(shù)已挖掘了其中的一些關(guān)鍵基因。Cohen等[13]將與檸檬酸含量有關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位到連鎖群上，結(jié)果檢測到5個(gè)和檸檬酸含量有關(guān)的QTLs，其分別位于LGⅣ、LGⅧ、LGⅪ、LGⅫ上。朱慧芹[14]利用六世代聯(lián)合分離分析法發(fā)現(xiàn)，檸檬酸含量受1對(duì)加性-顯性主基因和加性-顯性上位性多基因（DO）控制。朱慧芹等[15]以口感酸甜味差異明顯的甜瓜品種為研究對(duì)象，定位了3個(gè)與檸檬酸含量有關(guān)的QTL（cit7.1、cit8.1、cit8.2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)其分別位于LGⅦ、LGⅧ上；林瓊[16]發(fā)現(xiàn)在柑橘中，其檸檬酸降解以谷氨酰胺途徑為主，而最有可能與CitCHX、CitALMT和CitDIC這3個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因有關(guān)。

3 RNA-seq技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及其在主要作物中的應(yīng)用

3.1 RNA-seq技術(shù)及其發(fā)展現(xiàn)狀

RNA-seq就是通過高通量測序技術(shù)，檢測mRNA、smallRNA、LncRNA等的序列信息，研究其表達(dá)水平的一種方法?，F(xiàn)如今，高通量測序技術(shù)已廣泛運(yùn)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域，并在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域獲得諸多成果。例如在果蔬作物的研究中，已完成對(duì)葡萄、番木瓜、蘋果、草莓、香蕉、梨、甜橙、克里曼丁柑橘和桃等作物的全基因組測序，這有助于在相關(guān)物種上開展基因和啟動(dòng)子挖掘、分子遺傳標(biāo)記開發(fā)、全基因組關(guān)聯(lián)分析、比較基因組學(xué)等研究[17]。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組與代謝組的紐帶，轉(zhuǎn)錄組測序是對(duì)已完成全基因組測序物種進(jìn)行深入研究的有效方法[18]。相較于基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)針對(duì)的是被轉(zhuǎn)錄表達(dá)的部分特定基因，其研究范圍縮小，針對(duì)性更強(qiáng)。

與傳統(tǒng)的EST測序或芯片技術(shù)相比，RNA-seq技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄物及其可變剪切體表達(dá)水平的檢測更加精確，并有助于新的基因、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的發(fā)掘及基因結(jié)構(gòu)變化的發(fā)現(xiàn)。因此，RNA-seq被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄組研究的一個(gè)革命性工具[19，20]。目前應(yīng)用比較普遍的測序平臺(tái)是Illumina，如運(yùn)用HiSeq 2000測序儀，采用邊合成邊測序的技術(shù)手段，能同時(shí)檢測數(shù)億條序列信息，并對(duì)表達(dá)豐度極低的序列有較好的檢測效果[21]。

3.2 RNA-seq技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

對(duì)于已知全基因組序列的物種，比對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序信息，可以研究基因的表達(dá)差異、結(jié)構(gòu)變化，并發(fā)現(xiàn)新基因。近年來，該技術(shù)得到廣泛運(yùn)用，并取得了良好結(jié)果。Filichkin等[22]對(duì)擬南芥（Arabidopsis thaliana）轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)至少42%的內(nèi)含子基因存在可變剪接；Zhang等[23]對(duì)水稻（Oryza sativa）轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測序，發(fā)現(xiàn)了7 232個(gè)有組織特異性的新轉(zhuǎn)錄本和23 800個(gè)可變剪接，為分析水稻復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供了廣泛的依據(jù)；李瀅等[24]應(yīng)用Roche 454（GS FLX Titanium System）對(duì)二年生丹參根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，研究其基因表達(dá)譜，挖崛其功能基因，共獲得18 235條Unigene，其中，13 980條Unigene為首次發(fā)現(xiàn)。于安民[25]采用高通量RNA-seq測序技術(shù)，首次獲得了陽春砂的轉(zhuǎn)錄組信息和3個(gè)不同發(fā)育期果實(shí)的表達(dá)譜信息，為陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中糖和萜類代謝的研究提供了重要的遺傳信息，為深入研究陽春砂果實(shí)發(fā)育及次生代謝調(diào)控的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

3.3 RNA-seq技術(shù)在園藝作物中的應(yīng)用

Zenoni等[26]通過Illumina GAⅡ測序平臺(tái)，對(duì)葡萄（Vitis vinifera）坐果、著色、成熟3個(gè)發(fā)育期的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，通過與參考基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族的新基因以及可變剪接。楊侃侃[27]通過RNA-seq技術(shù)，檢測了黃皮、綠皮西瓜在不同生長時(shí)期的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因主要體現(xiàn)在細(xì)胞組成、分子功能、生物過程等方面。馮超[28]對(duì)楊梅不同時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行RNA-seq，分析了楊梅的密碼子偏好性并鑒定出4個(gè)高頻密碼子，檢測到果實(shí)成熟期蔗糖累積和有機(jī)酸降解的關(guān)鍵基因，分別是蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因和GAD基因；對(duì)不同有機(jī)酸含量的楊梅品種進(jìn)行進(jìn)一步RNA-seq發(fā)現(xiàn)，液泡H+-ATPase（V-ATPase）B亞基的基因可能對(duì)不同品種楊梅的有機(jī)酸含量起決定作用。魏海蓉[29]通過對(duì)不同品種的櫻桃進(jìn)行RNA-seq，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)與花青素生物合成相關(guān)的基因。

4 RNA-seq技術(shù)在甜瓜中的應(yīng)用及對(duì)果實(shí)檸檬酸代謝特性的分析展望

高通量測序技術(shù)在甜瓜的研究中也有著廣泛的應(yīng)用。2012年甜瓜基因組測序完成，為關(guān)鍵基因發(fā)掘奠定了重要基礎(chǔ)。牛鵬輝[30]通過對(duì)甜瓜的全基因組數(shù)據(jù)分析，共鑒定出56個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，并篩選出14個(gè)候選的內(nèi)參基因。陳嘉貝等[31]對(duì)在鹽脅迫環(huán)境下不同品種甜瓜進(jìn)行RNA-seq分析，共發(fā)現(xiàn)27個(gè)響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，其中18個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量下調(diào)，9個(gè)上調(diào)。

目前，檸檬酸代謝的調(diào)控機(jī)制還不明確，也只是運(yùn)用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記來進(jìn)行基因定位。而利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行全基因組測序已成為時(shí)代的潮流，運(yùn)用RNA-seq技術(shù)研究甜瓜果實(shí)檸檬酸代謝特性，并挖掘其中主要的調(diào)控基因，將會(huì)為豐富風(fēng)味甜瓜的品質(zhì)研究提供可能。

鑒于如今RNA-seq技術(shù)的快速發(fā)展，以及RNA-seq技術(shù)自身的優(yōu)勢，已在很多物種上開展基因和啟動(dòng)子挖掘、分子遺傳標(biāo)記開發(fā)、全基因組關(guān)聯(lián)分析、比較基因組學(xué)的研究。在甜瓜檸檬酸代謝研究中運(yùn)用RNA-seq技術(shù)，將有助于在甜瓜中挖掘更多調(diào)控檸檬酸代謝的基因。下一步我們的研究也將引入轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究策略，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期（前期、中期、后期）的果實(shí)進(jìn)行RNA-seq測序，系統(tǒng)研究果實(shí)發(fā)育不同階段的轉(zhuǎn)錄組變化，對(duì)基因的差異表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因所參與的主要生物學(xué)過程，挖掘與檸檬酸代謝有關(guān)的基因，構(gòu)建相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析相關(guān)基因在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，同時(shí)測定相關(guān)基因編碼酶在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的活性以及檸檬酸含量，為揭示風(fēng)味甜瓜檸檬酸積累的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為豐富甜瓜果實(shí)的品質(zhì)研究提供可能。

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Research Progress of Citrate Metabolism and Application Status of RNA-seq Technology on Flavor Melon

TANG Mi,LIU Ye,REN Jian,ZHANG Na,ZENG Hongxia,CHENG Weishun,LI Yuhua,SUN Yuhong
(Institute of Crop Sciences,Wuhan Academy of Agricultural Science and Technology,430345)

With the growth of the living standard,traditional melon with high sugar can't meet consumers'diversification demands,so flavor melon,a new melon cultivar is born at the right moment with the speciality of quality,nutrition and health.It is very important to excogitate the best sugar-acid ratio,since the metabolic mechanism of the main organic acid of citric acid in melon is not clear.This paper summarized the research progress of citrate metabolism on flavor melon,and put forward the prospect about exploring some key genes related with citrate metabolism on flavor melon using the RNA-seq technology.

Flavor melon;Citric acid;RNA-seq;Gene discovery;Research progress

10.3865/j.issn.1001-3547.2016.24.017

湯謐（1981-），女，高級(jí)農(nóng)藝師，從事西瓜甜瓜品種選育與栽培技術(shù)研究工作，E-mail：344463296@qq.com

孫玉宏（1968-），通信作者，女，正高職高級(jí)農(nóng)藝師，常年從事西瓜甜瓜品種選育和相關(guān)栽培技術(shù)研究與推廣工作

2016-11-08