王 林,朱金峰,許自成*,王 遠,姚 倩,王蒙蒙,張景華

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院,河南 鄭州 450002;2.河南省煙草公司 漯河市公司,河南 漯河 462000)

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河南烤煙煙葉中糖苷類物質(zhì)的鑒定與分析

王 林1,朱金峰2,許自成1*,王 遠1,姚 倩1,王蒙蒙1,張景華1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 煙草學院,河南 鄭州 450002;2.河南省煙草公司 漯河市公司,河南 漯河 462000)

摘要：采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESI MS/MS)，分析鑒定了河南烤煙葉片中9種主要的糖苷類香味前體物質(zhì)。通過對液相色譜圖和質(zhì)譜圖進行分析,推測9種糖苷類香味前體物質(zhì)分別為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷及其同分異構(gòu)體、新綠原酸及其同分異構(gòu)體、綠原酸及其同分異構(gòu)體、隱綠原酸、蕓香苷、山奈酚-3-蕓香糖苷,并分析了其相對含量。本研究結(jié)果為提高煙葉香氣品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：烤煙;葉片；糖苷類物質(zhì);鑒定

煙草中的香味成分對煙葉的品質(zhì)有重要的影響,其不僅以游離態(tài)存在,還以糖苷結(jié)合態(tài)形式存在,是香味成分的主要來源之一[1-4]。糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)是煙草重要的香味前體物質(zhì)[5-6],對煙葉香氣品質(zhì)有重要作用。糖苷類香味前體物質(zhì)本身一般不具備揮發(fā)性,但在煙葉烘烤和陳化過程中,糖苷鍵斷裂釋放出香味成分,從而對提升煙氣香味產(chǎn)生重要影響[7-10]。由于糖苷類香味前體物質(zhì)具有儲放穩(wěn)定性和釋香穩(wěn)定性等特點,所以分析研究糖苷類香味前體物質(zhì)對卷煙調(diào)香工作有重要的意義。最近幾年,已有大量有關(guān)煙葉化學成分鑒定的綜述性報道,有關(guān)煙葉糖苷類化合物也有一些深入研究,主要集中在煙草糖苷類化合物作為香味前體所發(fā)生的作用[11-13]。

糖苷的種類繁多,要獲得完整的標樣存在一定的困難,高效的純化、分離技術(shù)不完善,使得系統(tǒng)地分離、鑒定煙草糖苷類化合物較為困難。多級串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以提供被分析成分的結(jié)構(gòu)信息,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)目前已被應用于植物有效成分的分離與結(jié)構(gòu)分析鑒定實驗。本文選取河南烤煙煙葉樣品,對河南烤煙煙葉中的糖苷類化學成分進行了鑒定分析,旨在為提高河南烤煙香氣品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料和儀器

試劑和樣品：甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(色譜純)、Mill-Q超純水;其它有機試劑均為分析純?？緹煙熑~C2F于2014年8月30日采自河南省漯河市煙草公司的復烤煙葉。

儀器：美國Agilent 1100 Series LC/MSD Trap XCT液質(zhì)聯(lián)用儀;超聲波清洗器(SK 25M86A023,美國Ku-DOS); Clams500四級桿質(zhì)譜儀(美國PE公司); API3200QTRAP串聯(lián)三重四級桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB公司);超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1提取與分離

1.2.1.1糖苷類香味前體物質(zhì)的分離準確稱取10 g煙樣(過80目篩)于錐形瓶中,加100 mL的甲醇，超聲萃取1 h；將萃取液過濾,對殘渣再加入100 mL的甲醇，超聲萃取1 h；合并兩次萃取液,萃取液過濾濃縮至干(真空泵35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干),加100 mL的水，溶解后過XAD-2柱;先用400 mL的水洗去酸、堿和糖,再用300 mL乙醚-正己烷(體積比為1 ∶1,各150 mL)洗去游離的香味物質(zhì)和油脂、蠟質(zhì)成分,最后用300 mL甲醇將糖苷洗脫下來;將甲醇洗脫液減壓濃縮至干(真空泵旋轉(zhuǎn)蒸干),得到初步純化的糖苷。

1.2.1.2UPLC-MS/MS分析樣品將1.2.1.1中所得到的初步純化的糖苷用甲醇定容到25 mL,取上清液1 mL，過0.22 μm的濾膜,濾液供UPLC-MS/MS分析。

1.2.2UPLC-MS/MS分析條件

1.2.2.1色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫為室溫；檢測波長254 nm；進樣量5 μL。流動相: A相為0.1%甲酸-甲酸銨水溶液；B相為甲醇；C相為乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序

1.2.2.2質(zhì)譜條件ESI離子源,毛細管電壓3500 V,干燥氣溫度350 ℃,干燥氣流速10.0 L/min,霧化氣壓力50.0 psi。

2結(jié)果與分析

2.1河南烤煙糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測

在本實驗中,通過電噴霧一級質(zhì)譜進行母離子全掃描(Q1),發(fā)現(xiàn)糖苷母離子以[M-H]-和[M+H]+兩種形式存在。對所采集樣品的液相色譜圖上的9個色譜峰進行了解析歸屬。而這9個色譜峰所一一對應的液相色譜圖和質(zhì)譜圖的保留時間如表2所示。

2.2河南烤煙糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

對于峰1和峰2，推測應為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷及其同分異構(gòu)體[14-15]。這是因為正離子模式的質(zhì)譜圖均有m/z 163、179、311、357等,負離子模式的質(zhì)譜圖均有m/z 309、355、405、425等(見圖1),所以推測應為同分異構(gòu)體。在質(zhì)譜圖上有分子離子m/z 355([M-H]-)、m/z 357([M+H]+),故推測該物質(zhì)的分子量應為356；根據(jù)參考文獻，推測可能為α-紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷和β-紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷,其中分子離子m/z 163表明丟失了整個糖苷配基。

表2　河南烤煙糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測

圖1　峰1和峰2的全掃描質(zhì)譜圖

峰3、4、5、6、7的質(zhì)譜圖信息如圖2～圖3所示。從一級質(zhì)譜圖可以看出均有準分子離子m/z 353([M-H]-),推測為綠原酸及其4種同分異構(gòu)體,但目前文獻報道綠原酸只存在3種同分異構(gòu)體(綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸)[16-17],所以還需進行進一步的考究確證。從二級質(zhì)譜圖中可以看出,峰3和峰4有m/z 191、179、173、135,峰5和峰6有m/z 191、179,峰7有m/z 191、179、173、135,峰3、4和7雖然含有相同的碎片離子,但是對應的相對豐度差別很大。由此推測峰3和峰4為新綠原酸及其同分異構(gòu)體,峰5和峰6為綠原酸及其同分異構(gòu)體,峰7為隱綠原酸。

圖2　峰3、4、5、6、7的全掃描質(zhì)譜圖

圖3　峰3、4、5、6、7的MS2全掃描質(zhì)譜圖

對于峰8，推測應為蕓香苷。在負離子掃描的一級質(zhì)譜圖上有準分子離子m/z 609([M-H]-),將其打碎進行二級質(zhì)譜分析,出現(xiàn)的碎片中豐度較高的是m/z 301。在正離子掃描的一級質(zhì)譜圖上有準分子離子m/z 611([M+H]+),將其打碎進行二級質(zhì)譜分析,出現(xiàn)的碎片中豐度較高的是m/z 303。結(jié)合正、負離子模式的二級質(zhì)譜圖,推斷該碎片分子量為302,為蕓香苷失去蕓香糖苷所得的黃酮苷元(見圖4～圖6)。

圖4　峰8的全掃描質(zhì)譜圖

圖5　峰8的MS2全掃描質(zhì)譜圖

對于峰9，推測應為山奈酚-3-蕓香糖苷。在一級質(zhì)譜圖上分別有m/z 593([M-H]-)、595([M+H]+)。在二級質(zhì)譜圖上,丟失蕓香糖苷,出現(xiàn)山奈酚的準分子離子峰m/z 285([M-H]-)、287([M+H]+)(見圖7～圖9)。

2.3河南烤煙糖苷類物質(zhì)的含量分析

通過高效液相色譜的定量分析,對河南煙葉中推測的9種糖苷類物質(zhì)的相對含量進行了測定,結(jié)果如表3。從表3中得知,蕓香苷的相對含量最高,紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷的相對含量次之,新綠原酸和隱綠原酸的含量最低。高效液相色譜法的定量測定結(jié)果為今后糖苷類物質(zhì)的測定提供了依據(jù)?？赏ㄟ^對糖苷類物質(zhì)的含量進行比較,分析不同實驗處理對糖苷類物質(zhì)含量的影響,從而為提高煙葉糖苷類物質(zhì)的含量提供指導。

圖6　蕓香苷的裂解途徑

圖7　峰9的全掃描質(zhì)譜圖

圖8　峰9的MS2全掃描質(zhì)譜圖

圖9　山奈酚-3-蕓香糖苷的裂解途徑

3小結(jié)與討論

本文采用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析法定性和定量地分析鑒定了河南烤煙煙葉中的糖苷類化學成分。在實驗過程中,通過電噴霧質(zhì)譜對母離子進行了掃描,并對多級質(zhì)譜進行了分析,推測出9種糖苷類前體物質(zhì)為紫羅蘭醇-β-D-葡萄糖苷及其同分異構(gòu)體、新綠原酸及其同分異構(gòu)體、綠原酸及其同分異構(gòu)體、隱綠原酸、蕓香苷、山奈酚-3-蕓香糖苷。該方法為不同煙草中糖苷類物質(zhì)的分析鑒定提供了一定的理論依據(jù)。

表3　河南烤煙糖苷類物質(zhì)的相對含量

煙草的香氣受不同狀態(tài)、不同類別香氣成分的組成和比例的影響?，F(xiàn)今研究多集中在對游離態(tài)香氣物質(zhì)的研究上[18-19],而大量糖苷類物質(zhì)在陳化燃燒過程中釋放的香氣對煙葉香氣的提高有突出的貢獻[20-22]。有關(guān)學者多采用氣相色譜法分析糖苷類前體物質(zhì)分解釋放的小分子物質(zhì)對煙葉香氣的影響[23-25],所得結(jié)果的可靠性可能受游離態(tài)香氣物質(zhì)含量的影響而降低。本實驗采用高效液相色譜法對煙草中糖苷類物質(zhì)的相對含量進行了直接分析,這為今后開展提高煙草中糖苷類物質(zhì)含量的實驗提供了有效的途徑。

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(責任編輯:黃榮華)

Identification and Analysis of Glycosidic Substances from Flue-cured Tobacco Leaves in Henan Province

WANG Lin1, ZHU Jin-feng2, XU Zi-cheng1*, WANG Yuan1,YAO Qian1, WANG Meng-meng1, ZHANG Jing-hua1

(1. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2. Luohe Branch of Henan Provincial Tobacco Company, Luohe 462000, China)

Abstract：Nine main glycosidic flavor precursors from flue-cured tobacco leaves grown in Henan Province were identified and analyzed by using ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS). The chemical structures of 9 main glycosidic flavor precursors were determined by analysis of the liquid chromatography and mass spectrogram, they were ionol-β-D-glucopyranoside and its structural isomer, chlorogenic acid and its structural isomer, neochlorogenic acid and its structural isomer, cryptochlorogenic acid, rutin, kaempferol-3-rutin, respectively, and their content were determined. This research provided a theoretical basis for improving aroma quality of tobacco leaves.

Key words：Flue-cured tobacco; Leaf; Glycosidic substances; Identification

中圖分類號：S572.01

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)02-0049-05

作者簡介：王林(1992─),女,河南安陽人,碩士研究生,主要從事煙草栽培與質(zhì)量評價研究。*通訊作者:許自成。

基金項目：河南省煙草公司科技攻關(guān)項目(HYKJ 201105、HYKJ 201043)。

收稿日期：2015-07-09