秦 瓊，魏淑芳，杜克云

（渠縣農(nóng)林局，四川渠縣 635200）

不同程度的葉銹病對楊樹生理代謝的影響

秦 瓊，魏淑芳，杜克云

（渠縣農(nóng)林局，四川渠縣 635200）

通過盆栽實驗研究了不同發(fā)病程度下，接種葉銹菌對青楊葉片組織內(nèi)過氧化物酶、多酚氧化酶活性、丙二醛和葉綠素含量的影響。研究表明：發(fā)病程度與楊樹生理指標的變化具有密切關系。接種葉銹菌后，隨著感病程度的增加，POD活性呈現(xiàn)梯度增長，感病末期達到活性最大值；PPO活性呈規(guī)律性增長，分別與對照組存在顯著差異（P＜0.01）；葉綠素含量一直呈下降趨勢，始末變化量明顯；丙二醛含量呈先迅速上升后緩慢下降態(tài)勢，在感病中期達到峰值。各生理指標與病情指數(shù)的相關性分析表明：過氧化物酶活性、多酚氧化酶活性均與病情指數(shù)呈顯著正相關（P＜0.05；P＜0.01）；葉綠素含量與感病等級呈顯著負相關（P＜0.01）；丙二醛含量與之無顯著相關性。關鍵詞：楊樹；葉銹病；生理代謝；酶活性

植物體內(nèi)一系列的生理代謝變化是反映植物機體健康程度的指標［1］。對于大多數(shù)寄主植物而言，病原菌的侵入不會直接導致植物組織的破壞或死亡，而是通過影響機體的生理代謝變化從而改變寄主植物的生理狀態(tài)［2］。過氧化物酶和多酚氧化酶是植物體內(nèi)普遍存在的兩種重要保護酶，研究顯示：過氧化物酶與植物的形態(tài)建成和抗逆性有關［3］，多酚氧化酶活性的變化被認為是植物受病原菌侵染后的一種防御性反應［4］。另外，測定植物丙二醛和葉綠素含量的變化在一定程度上也可以反映出植物的生長狀況和健康程度［5］。因此，研究植物機體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物酶、多酚氧化酶、丙二醛和葉綠素等物質(zhì)與寄主植物抗病機制的相關性在一定程度上為檢測寄主植物抗性、探索快速診斷寄主植物感病提供了有力的保障和發(fā)展前景。

楊樹（Populus spp.）是世界三大速生造林樹種之一，在我國生態(tài)環(huán)境建設以及解決生物能源問題中發(fā)揮著不可替代的作用，具有重要的經(jīng)濟、社會、生態(tài)效益［6］但目前，由柵銹菌屬（Melampsora sp）真菌所引起的楊樹葉銹?。ㄋ追Q黃粉?。﹪乐赜绊懼鴹顦洳姆e量的生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟損失，極大地威脅著我國林業(yè)生產(chǎn)建設［7］。國內(nèi)外有關楊樹葉銹病的大量研究主要集中在病原菌的鑒定和培養(yǎng)、發(fā)病規(guī)律及生物防治方面［8］，但對不同發(fā)病程度下葉銹菌對楊樹生理代謝的影響尚未見報道。本試驗通過研究不同發(fā)病程度下楊樹葉片組織內(nèi)過氧化物酶、多酚氧化酶活性及丙二醛、葉綠素含量的生理指標變化，揭示其抗性反應機制及生理生化變化特征，為進一步系統(tǒng)研究楊樹對葉銹菌的抗病育種工作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：品種為大青楊（Populus ussuriensis Kom），采購于雅安市園林植物公司的1年生枝條，在實驗溫室內(nèi)扦插盆栽培養(yǎng)。

供試菌種：落葉松-楊柵銹菌（Melampsora larici-populina Kleb.）四川寶興單孢菌系（Sb）由四川農(nóng)業(yè)大學森林保護省級重點實驗室提供。菌種的活化及接種均參照李振岐等方法［9］，并在溫室下將菌種人工擴繁于健康青楊葉片，產(chǎn)孢后用無菌水制成濃度為2×103CFU·mL-1的孢子懸浮液接種備用。

1.2 接種培養(yǎng)

選取健康盆栽青楊50盆作為實驗材料，每盆中選取葉齡指數(shù)4-8的葉片為備接種葉片［10］，接種前在葉背噴一層水膜，用棉簽蘸取備用的孢子懸浮液，均勻涂抹于葉背。另取10盆對葉片涂抹無菌水做空白對照。接種后分別隔離培養(yǎng)、觀察、并按照表1中的葉銹病分級標準在不同發(fā)病時期分別取樣測定，每組重復3次（參見表1）。

表1 葉銹病分級標準Tab.1 The leaf rust grading standards

1.3 生理指標的測定

1.3.1 過氧化物酶活性的測定

酶液的提取參照童蘊慧等的方法［11］。酶活性的測定參照李合生的方法［12］，略有改動：依次加入2%H2O20.5 mL，0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚1 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用），0.05 mol·L-1pH6.8磷酸緩沖液1.5 mL，酶液0.05 mL，立即于20℃水浴中保溫5 min。TU-1800SPC紫外可見分光光度計（美國Beckman公司）測OD470的變化，每分鐘讀數(shù)1次，記錄5分鐘的OD470值。以ΔOD／g（FW）*min表示酶活性，以吸光度值（ΔOD）變化0.1為1個酶活性單位（u）。

1.3.2 多酚氧化酶活性的測定

酶液提取同上。酶活性測定參照朱廣廉等的方法［13］，略有改動：依次加入0.02 mol·L-1的鄰苯二酚1.5 mL，0.05 mol·L-1磷酸緩沖液1.5 mL，對照以蒸餾水代替酶液，反應在30℃下溫育2 min，TU-1800SPC紫外可見分光光度計測OD398的變化。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量的測定

MDA含量測定參照鄒琦的方法［14］：取0.5 g葉片，加少許石英砂和10%的TCA（三氯乙酸）8 mL，冰浴研磨，勻漿于10 000 g冷凍離心10 min，取上清液2 mL加入0.6%硫代巴比妥酸（TBA）2mL混勻，后于沸水浴反應20 min，迅速冷卻，離心。取上清液測定532 nm、600 nm和450 nm波長下的吸光度。用蒸餾水作參比，計算公式如下：

CMDA（μmol·L-1）＝6.45（OD532-OD600）-0.56 OD450

MDA含量（μmol·g-1FW）＝CMDA×樣品提取液體積（mL）／樣品鮮重（g）

1.3.4 葉綠素含量的測定

稱取0.5 g葉片，放到研缽中，加石英砂少許，丙酮3 mL，研磨成勻漿，再加入5 mL丙酮，攪拌提取5 min，靜置在暗箱里過夜提取，第2天得到深綠色的提取液，觀察綠渣呈無色后用漏斗過濾，濾液即為色素提取液。分別以提取溶劑為空白，掃描測定提取液的吸收值A663、A645。根據(jù)提取液中葉綠素濃度，換算成每克鮮葉中葉綠素含量［mg·g-1（FW）］。

利用Arnon公式計算葉綠素的濃度：

葉綠素a濃度（mg·L-1）：Ca＝12.7 A663-2.69 A645；

葉綠素b濃度（mg·L-1）：Cb＝22.9 A645-4.68 A663；

葉綠素總濃度（mg·L-1）：C（a＋b）＝Ca＋Cb＝8.02 A663＋20.21A645。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL和SPSS分析軟件進行葉銹病病情指數(shù)與各個生理指標比較分析和各個生理指標的差異分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)病程度下葉銹菌對楊樹葉片內(nèi)過氧化物酶（POD）活性的影響

健康楊樹葉片在接種落葉松-楊柵銹菌后，POD活性發(fā)生了明顯變化，酶活值呈現(xiàn)梯度增長，始末變化量為29.86 U·g-1（FW）*min，并在5級發(fā)病程度達到最大活性值83.11 U·g-1（FW）* min，而對照組中酶活力均保持在一個較低的穩(wěn)定水平。POD活性試驗表明：不同發(fā)病程度下楊樹葉片內(nèi)POD活性均與健康對照差異顯著（P＜0.05）（圖1），說明病原菌的入侵改變了青楊葉片組織內(nèi)的POD酶活性系統(tǒng)的代謝變化，隨著感病指數(shù)的增加POD活性逐漸增強。

圖1 不同感病程度POD含量

2.2 不同發(fā)病程度下葉銹菌對楊樹葉片內(nèi)多酚氧化酶（PPO）活性的影響

由圖2可知，在不同生理時期內(nèi)健康青楊葉片組織內(nèi)的PPO活性均無顯著變化。接種落葉松-楊柵銹菌后，隨著感病程度的增加PPO活性呈規(guī)律性增長，2～5級發(fā)病程度的PPO活性均明顯高于健康對照的PPO活性，分別與對照組差異顯著（P＜0.05）。在5級發(fā)病程度下，PPO活性達到峰值27.53 U·g-1（FW）*min，是同時期對照組PPO活性4.34 U·g-1（FW）*min的6倍。

圖2 不同感病程度POD含量

2.3 不同發(fā)病程度下葉銹菌對楊樹葉片內(nèi)丙二醛（MDA）含量的影響

健康對照組中MDA含量變化幅度較小，2級發(fā)病程度MDA含量達到峰值6.34μmol·g-1（FW），最大變化量為0.96μmol·g-1（FW）（圖3）。感病組中，接種落葉松-楊柵銹菌后均引起MDA含量一定范圍內(nèi)的增加或降低。感病初期，MDA含量急劇上升，并在2級發(fā)病程度下達到最大值為7.87 μmol·g-1（FW），比健康對照組增幅28.6%；3級發(fā)病程度下，MDA含量略有下降，但仍維持在較對照高的水平上；4級發(fā)病程度下，MDA含量下降至5.53μmol·g-1（FW），明顯低于對照；5級發(fā)病程度下，MDA含量達到最低值3.90μmol·g-1（FW），比健康對照組降低33.6%。

圖3 不同感病程度MDA含量

2.4 不同發(fā)病程度下葉銹菌對楊樹葉片內(nèi)葉綠素（Chl）含量的影響

接種落葉松-楊柵銹菌后，不同感病時期內(nèi)青楊葉片組織中葉綠素含量均呈下降趨勢，分別與對照組差異顯著（P＜0.05）（圖4），說明病原菌的侵入影響了植株葉片內(nèi)葉綠素的合成，降低了植株的光合作用，從而影響了植株的正常生長。2級發(fā)病程度下，植株葉片內(nèi)葉綠素含量驟降，比健康對照組降低15.1%；3～5級發(fā)病程度下，葉綠素含量下降趨勢較為平穩(wěn)，始末變化量為124.60 mg·g-1（FW）。

圖4 不同感病程度葉綠素含量

2.5 生理指標與感病程度的相關性

將接種落葉松-楊柵銹菌后的各生理指標因子的平均值與感病程度進行相關性分析（表2），其中POD活性與感病等級達到顯著水平（P＜0.05）；PPO活性與感病程度也呈顯著相關（P＜0.01），且兩生理指標與抗病性密切正相關；而葉綠素含量與感病等級成顯著負相關（P＜0.01）。此外，MDA含量與感病程度沒有達到顯著水平，即MDA與感病程度不具有相關性。1-3級發(fā)病程度下，各生理指標的變化幅度較為明顯，而在4-5級發(fā)病程度下，各生理指標變化量趨于平緩，說明健康青楊葉片受病原菌侵染后會在短時間內(nèi)影響葉片組織的生理代謝，從而改變?nèi)~片組織內(nèi)POD、PPO酶活性，以及葉綠素的含量。

表2 生理指標與感病等級相關性分析Tab.2 Correlation analysis between physiological indices and infection index

3 結論與討論

自從1958年第1篇與植物病原菌侵染有關的植物過氧化物酶論文發(fā)表以來，利用抗性酶檢測植物抗性強弱已經(jīng)成為研究的新熱點，國內(nèi)外大量學者研究表明：過氧化物酶（POD）的活性變化與植物抗性具有密切關系［15］。POD是植物保護酶系的重要保護酶之一，具有快速有效的清除植物組織體內(nèi)多余活性氧自由基的作用［16］。本試驗中接種落葉松-楊柵銹菌后POD活性呈現(xiàn)梯度增長，5級發(fā)病程度下達到峰值，這與潘建菁［17］等人對青枯菌侵染煙株后其體內(nèi)POD活性的變化的研究結果相似，說明健康青楊葉片受到病原菌侵染后破壞了葉片組織內(nèi)的活性氧自由基平衡，導致寄主葉片組織內(nèi)的自由基和過氧化物含量增多，寄主需要大量POD快速有效的清除葉片組織內(nèi)多余的代謝物質(zhì)，因此在感病初期和中期POD含量驟升，隨著感病程度的增加，POD含量逐漸呈現(xiàn)梯度增長，并在5級發(fā)病程度下達到最大。此外，POD活性與感病等級的相關性分析表明：POD活性與感病等級達到顯著水平（P＜0.05），并與抗病性密切正相關，這也與李華琴［18］對小麥抗、感品種接種菌種后葉片的POD活性變化結果相一致，說明在一定程度上POD可以看作是植株內(nèi)部病變的“生化癥狀”［19］，植株葉片組織內(nèi)POD活性的變化可以作為檢測和鑒定楊樹抗葉銹病的重要指標之一。

多酚氧化酶（PPO）活性的變化是植物受病原菌侵染后的一種防御性反應，它可氧化體內(nèi)酚類物質(zhì)，形成對病原微生物具有更高毒性的醌類物質(zhì)，限制病原細菌的進一步擴展，從而抑制病原菌葡聚糖酶活性［20］。沈業(yè)壽［21］等認為PPO活性的增加直接與品種的抗病性成正比。本研究結果表明：接種落葉松-楊柵銹菌后，隨著感病程度的增加PPO活性呈規(guī)律性增長，并與感病等級呈顯著正相關（P＜0.01），這與徐建華［22］等對多酚氧化酶的活性變化與魔芋的抗病性的研究結論相一致。結合王潤華［23］、張建軍［24］、宋從鳳［25］等人的研究可推測當病原菌侵染寄主植物時，多酚氧化酶與底物接觸把酚類物質(zhì)氧化成對病原菌毒性更強的醌（或其衍生物），而醌對病原菌有毒殺性，會引起植物體內(nèi)多酚氧化酶活性的升高，對植株自身起保護作用，因而PPO活性與植物的抗病性呈正相關［26］

丙二醛（MDA）是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，在一定程度上可反映植物受氧化傷害的程度［27］。大量研究也表明：MDA在植物體內(nèi)的含量與植物細胞膜系統(tǒng)的變化具有相關性，當植物體內(nèi)的MDA含量超過一定的閾值植物膜系統(tǒng)將會遭到破壞［28］。2級發(fā)病程度下，葉片內(nèi)MDA含量急劇上升，比健康對照增長28.6%，結合何開躍［29］等的研究可以推測感病初期植物葉片生物膜功能遭到破壞或喪失，通透性損傷，自由基過多，導致MDA大量累積。隨著感病程度的增加，POD活性增強，使得膜系統(tǒng)多余的自由基得到轉(zhuǎn)化，植物細胞膜系統(tǒng)生理活動正常，MDA含量逐漸恢復平衡。盡管MDA含量與感病程度沒有達到顯著相關水平，但是仍可以通過測定接種病原菌后MDA含量的變化來了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性［30］。

近些年來，人們對葉綠素的研究已經(jīng)不再局限于光合作用，而是將葉綠素含量變化與植物的抗病機制聯(lián)系起來［31］。大部分學者認為有關葉綠素與植物抗病性的關系，在不同植物與病原菌的相互作用中表現(xiàn)不同［32］。本研究接種落葉松-楊柵銹菌后，不同感病等級下青楊葉片組織中葉綠素含量均呈下降趨勢，隨著感病等級的增加，葉綠素含量逐漸減少，呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢，說明葉綠素含量的變化與青楊抗病反應有關，這與徐秉良［33］等的研究苜蓿對白粉病的抗性與葉綠素含量的關系中的結論不謀而合，說明病原菌的侵入破壞了植物體的葉綠素的生物合成。換而言之，在某種程度上植物組織葉綠素的含量變化可以反應植物抗病性的高低，研究葉綠素的含量變化對于預測植物抗病性具有一定的理論和實踐意義。

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Effects of Poplar Leaf Rust on the Physiological M etabolism of Populus cathayana under Different Disease Degrees

QIN Qiong WEIShu-fang DU Ke-yun

（Bureau of Agriculture and Forestry，Quxian 635200，Sichuan，China）

Pot cultivation experiments were used to study the effects of Melampsora larici-populina on the physiologicalmetabolism of Populus cathayana under different disease degrees，specifically on the activities of its POD，PPO enzymes，and the contents of its MDA and Chlorophyll.The results showed that the changes of physiological indexes of poplarswere closely related with their disease degree.After inoculation with M．larici-populina and with the increasing of disease degrees，POD activity showed a gradient growth and reached itsmaximum value at the end；As compared with the control groups，PPO activity increased regularly，and there were significant differences with the control（P＜0.01）；To chlorophyll content，it decreased significantly in the whole process；While the MDA content decreased slowly after a rapidly increase，and it peaked in themid susceptible period.The correlation analysis of physiological indexes and disease degrees showed that the activities of POD and PPO were positively related to the disease degree（P＜0.05；P＜0.01）；And the chlorophyll content was negatively related to it（P＜0.01）；and there was no significant correlation between MDA content and disease degree.

Poplar，Leaf rust，Physiologicalmetabolism，Enzymatic activity

S763

A

1003-5508（2016）06-00-0

10.16779／j.cnki.1003-5508.2016.06.019

2016-09-08

秦 瓊（19 -），。

doi：10.16779／j.cnki.1003-5508.2016.06.020