蔡 煜，余凌帆，文智猷，龔 偉*，楊洪忠，趙昌平

（1.四川農業(yè)大學林學院，四川成都 611130；2.四川省林業(yè)科學研究院，四川成都 610081；3.天全縣林業(yè)局，四川天全 625500）

瀕危植物光葉蕨孢子離體培養(yǎng)與萌發(fā)研究

蔡 煜1，余凌帆2，文智猷2，龔 偉1*，楊洪忠3，趙昌平1

（1.四川農業(yè)大學林學院，四川成都 611130；2.四川省林業(yè)科學研究院，四川成都 610081；3.天全縣林業(yè)局，四川天全 625500）

近年來由于人類活動的干擾和地質災害的破壞，使國家Ⅰ級重點野生保護植物光葉蕨（Cystoathyrium chinensis Ching）的生長環(huán)境受到了嚴重影響，導致其數(shù)量稀少，瀕臨滅絕。為了保護和擴繁光葉蕨，運用組織培養(yǎng)快繁技術，以光葉蕨成熟孢子為外植體，研究不同滅菌方式、培養(yǎng)基和蔗糖濃度對光葉蕨孢子萌發(fā)的影響。結果表明：不同滅菌方式、培養(yǎng)基和蔗糖濃度對光葉蕨孢子萌發(fā)有明顯影響；最佳滅菌處理為孢子經(jīng)4 000 r·min-1離心制成孢子懸浮液，加入0.1%升汞溶液離心5 min，無菌水沖洗4～5次；最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為1／2MS＋20 g·L-1蔗糖，經(jīng)過90 d，萌發(fā)率可達57.8%。

光葉蕨；孢子；萌發(fā)

植物生物多樣性是人類社會賴以生存和發(fā)展的基礎，人類的衣、食、住、行等生活的許多方面都與生物多樣性密切相關。由于人類過度利用自然資源和物種資源，加劇也加速了自然生態(tài)系統(tǒng)退化和物種的退化，生物多樣性受到嚴重威脅［1］，形成的生態(tài)問題不但影響了人類的基本生活，而且嚴重威脅著人類的生存與發(fā)展［2］，保護植物的生物多樣性具有重要意義。2015年，余凌帆等在天全縣通過全縣普查，發(fā)現(xiàn)光葉蕨分布數(shù)量為58株，分布于我國四川省天全縣二郎山附近［3］，僅極少數(shù)存于溪溝邊的灌叢下［4］，屬國家Ⅰ級重點野生保護植物、瀕危物種，保護與擴繁光葉蕨具有重要性與迫切性。植物組織培養(yǎng)可以應用于快速繁殖優(yōu)良苗木、獲得脫毒苗、種質保存等，具有生產周期短、繁殖系數(shù)高、管理方便等特點，可選用植物的各種器官、組織、細胞和原生質體等作為外植體，如根、莖、葉、芽、花藥、花粉、孢子等。莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發(fā)生變異，是較好的選擇。此外因所需材料少，繁殖系數(shù)大，利用孢子進行組織培養(yǎng)具有較高的可行性?？紤]到光葉蕨稀少的現(xiàn)存數(shù)量，采集植株作組培材料將對被采植株造成毀滅性破壞，具有不可操作性；取嫩葉和成熟孢子是最可能的，其中孢子對植株的影響最小，且孢子數(shù)量大，更切合實際。目前有關光葉蕨的研究主要集中在其資源、生境及保護對策等方面，而有關光葉蕨孢子無菌繁殖的研究尚未見報道。本文以光葉蕨成熟孢子為外植體，篩選了適合孢子萌發(fā)的滅菌方式和最佳培養(yǎng)基，探索其組織培養(yǎng)過程中的關鍵技術，為光葉蕨種質資源保護和人工繁育體系構建提供參考。

1 材料與方法

1.1 孢子的采集

光葉蕨（Cystoathyrium chinensis Ching）孢子采自四川省天全縣二郎山。從帶有成熟孢子的葉片上撥下孢子囊，裝入干燥的5 ml離心管，用棉花封口，放置于28℃～30℃的人工氣候箱中培養(yǎng)。每天輕微搖動離心管2次，待孢子粉散出，便可進行孢子消毒。

1.2 孢子的消毒

在離心管中加少許蒸餾水浸泡1 h后4 000 r· min-1離心5 min，去除清液。用以下6種方式消毒：（1）加3%NaClO溶液4 000 r·min-1離心3 min后去除清液；（2）加3%NaClO溶液4 000 r·min-1離心5 min后去除清液；（3）加3%NaClO溶液4 000 r ·min-1離心7min后去除清液；（4）加0.1%升汞溶液4000 r·min-1離心3 min后去除清液；（5）加0. 1%升汞溶液4 000 r·min-1離心5 min后去除清液；（6）加0.1%升汞溶液4 000 r·min-1離心7 min后去除清液。以上方式滅菌后，均使用無菌水沖洗4～5次，每次4 000 r·min-1離心5 min后去除清液。最后加無菌水稀釋，充分振蕩得到無菌孢子懸濁液［5，6］。

6種滅菌處理，每處理3次重復，每個重復接種90瓶。每瓶接種1滴（約0.1 ml）。播種90 d后統(tǒng)計孢子污染率和萌發(fā)率。

1.3 孢子的萌發(fā)培養(yǎng)

基本培養(yǎng)基包括MS、1／2MS和1／4MS共3種，蔗糖濃度水平包括10 g·L-1、20 g·L-1和30 g· L-1共3個水平，采用兩因素3水平試驗設計共9個處理，每個處理3次重復，每個重復接種60瓶，每瓶接種1滴（約0.1 ml），播種90 d后統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基瓊脂濃度均為7 g·L-1，pH 5.8。培養(yǎng)基經(jīng)121℃高溫、高壓滅菌20 min左右。培養(yǎng)箱溫度為（22～25）℃，光照強度為2 000 lx～2 300 lx，光照時間12 h·d-1。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌處理對污染率和萌發(fā)率的影響

接種2 d～3 d后各處理污染試管數(shù)逐漸增加，一周左右污染試管數(shù)開始穩(wěn)定，60 d后孢子開始逐漸萌發(fā)，90 d后統(tǒng)計污染率和萌發(fā)率，統(tǒng)計結果見表1。由表1可以看出，在相同滅菌劑條件下，污染率和萌發(fā)率均隨滅菌時間的延長而降低；在相同處理時間條件下，3%NaClO的污染率（平均為33.5%）均高于0.1%HgCl2的（平均為28.0%），相反，3%NaClO的（平均為40.9%）萌發(fā)率均低于0.1%HgCl2的（平均為47.3%）。污染率處理1最高為44.1%，處理6最低為15.6%，其它各處理呈現(xiàn)出處理4（40.4%）＞處理2（34.1%）＞處理5（28.1%）＞處理3（22.2%）的變化規(guī)律。萌發(fā)率處理5最高為51.1%，處理3最低為34.8%，其它各處理呈現(xiàn)出處理2（46.7%）＝處理4（46.7%）＞處理6（44.1%）＞處理1（41.1%）的變化規(guī)律。以上結果表明，與3%NaClO相比，0.1%HgCl2處理的污染率相對較低，而萌發(fā)率相對較高。綜合污染率和萌發(fā)率兩個指標，采用處理5（即0.1%升汞溶液4 000 r·min-1離心5 min）的效果最好，能獲得較低的污染率和較高的萌發(fā)率（表1）。

表1 不同滅菌處理對孢子萌發(fā)的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，接種90 d后，不同培養(yǎng)基對光葉蕨孢子萌發(fā)的影響比較明顯，萌發(fā)率隨著培養(yǎng)基中無機鹽濃度的降低呈現(xiàn)先升后降的趨勢。全量MS培養(yǎng)基中，孢子萌發(fā)率為43.7%，原葉體長勢一般；1／2MS最適宜孢子萌發(fā)，萌發(fā)率為52.4%，高于同一蔗糖濃度的其他水平，原葉體色澤鮮綠，質地較厚；1／4MS培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)有一定的影響，萌發(fā)率最低為36.1%，原葉體長勢較MS中的差，且質地偏薄。不同蔗糖濃度的培養(yǎng)基對光葉蕨孢子萌發(fā)的影響比較明顯，萌發(fā)率隨著濃度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢。萌發(fā)率最高的蔗糖濃度為20 g·L-1，原葉體生長較快，個頭大，色澤亮麗。蔗糖濃度為30 g· L-1的萌發(fā)率比10 g·L-1的萌發(fā)率低，且原葉體色澤較10 g·L-1枯黃。同一蔗糖濃度下，萌發(fā)率1／2MS＞MS＞1／4MS。同一無機鹽濃度水平，不同蔗糖濃度條件下孢子萌發(fā)率20 g·L-1（48.1%）＞10 g·L-1（43.7%）＞30 g·L-1（40.4%）。因此萌發(fā)率高且原葉體長勢佳的培養(yǎng)基為1／2MS＋20 g· L-1蔗糖，萌發(fā)率最高為57.8%。

表2 不同培養(yǎng)基和蔗糖濃度對孢子萌發(fā)的影響

3 討論

本實驗得出，最佳滅菌處理為0.1%升汞離心5 min，可獲得較高的孢子萌發(fā)率，這與王洋［7］在對扇葉鐵線蕨（Adiantum flabellulatum）孢子離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)升汞處理4 min的孢子萌發(fā)率遠高于升汞處理8 min的孢子萌發(fā)率的結果相似。升汞處理時間導致孢子萌發(fā)率高的原因與升汞滅菌效果好有關，減少了因污染導致的孢子萌發(fā)率降低問題［8］。本實驗升汞滅菌處理的效果比次氯酸鈉的效果好，升汞具有較強的消毒滅菌能力，這與吳菲菲［9］的研究結果一致，但與吳長輝［10］對里白（Diplopterygium glaucum（Thunb.ex Houtt）Nakai）孢子滅菌的研究結果相反。出現(xiàn)差異的原因可能與不同蕨類所處環(huán)境菌類不同及孢子對特定濃度的滅菌劑的耐受能力不同有關。

蔗糖和無機鹽在組織培養(yǎng)中既可調節(jié)滲透壓又可作為營養(yǎng)物質，一般在孢子萌發(fā)前期以調節(jié)滲透壓為主，因而低濃度的無機鹽和蔗糖濃度，有利于孢子從外界吸收水分而萌發(fā)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，孢子萌發(fā)與無機鹽濃度有關，1／2MS培養(yǎng)基接種的孢子萌發(fā)率最高。無機鹽濃度適中的培養(yǎng)基有利于孢子的萌發(fā)，無機鹽濃度過低或過高均會影響孢子的萌發(fā)率。關于無機鹽濃度對蕨類植物孢子萌發(fā)的研究，付偉等［12］的研究結果發(fā)現(xiàn)，河北峨眉蕨（Lunathyrium vegetius（Kitag.）Ching）孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為1／2MS，其次為MS，最差為1／4MS；吳長輝［10］的研究發(fā)現(xiàn)，里白孢子的萌發(fā)率1／2MS（83.2%）顯著高于MS（66.4%）與1／4MS（66.7%）；江金蘭［13］研究結果發(fā)現(xiàn)，鐵線蕨（Adiantum capillus-veneris L.）孢子在培養(yǎng)基1／2MS的萌發(fā)率較MS的高。相反，王蕾等［14］的研究結果表明，MS全培養(yǎng)基對東北對開蕨（Phyllitis japonica Kom.）孢子萌發(fā)效果優(yōu)于1／2MS；孫銳等［15］的研究結果發(fā)現(xiàn)，粗梗水蕨（Ceratopteris pteridoides（Hook.）Hieron.）孢子接種在MS完全培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)率最高，可達60.5%，顯著高于1／2MS（43.8%）和1／5MS（43.2%）。本研究結果與付偉等［13］、吳長輝［10］和江金蘭［14］等結果相似，而與王蕾等［14］和孫銳等［15］的研究結果相反。出現(xiàn)結果差異的原因，可能與植物不同有關，從而導致特定植物孢子萌發(fā)所需無機鹽濃度有高有低有所不同。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度的變化對光葉蕨孢子萌發(fā)的影響也較大。2%蔗糖濃度較適合于光葉蕨孢子的萌發(fā)，在同一無機鹽濃度水平條件下孢子萌發(fā)率呈現(xiàn)出20 g·L-1＞10 g·L-1＞30 g·L-1的變化規(guī)律，即蔗糖濃度在1%～3%范圍內，隨著蔗糖濃度的增加孢子萌發(fā)率呈先增后減的趨勢，30 g ·L-1最小。關于蔗糖濃度對蕨類植物孢子萌發(fā)的研究，劉公梅［16］對團葉鱗始蕨（Lindsaea orbiculata（Lam.））孢子萌發(fā)的研究結果表明，培養(yǎng)基中不添加或添加低濃度（低于2%）的蔗糖利于團葉鱗始蕨孢子萌發(fā)，當蔗糖濃度高于3%時，團葉鱗始蕨孢子的萌發(fā)率下降；吳芹［17］對黑足鱗毛蕨（Dryopteris fuscipes C.Chr.）孢子無菌萌發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，以2%的蔗糖濃度最佳，孢子萌發(fā)較早，且原葉體長勢最好；相反，吳長輝［10］的研究結果發(fā)現(xiàn)，較高蔗糖濃度能促進萌發(fā)，在0～40 g·L-1范圍內最適合里白孢子萌發(fā)的蔗糖濃度為30 g·L-1，誘導率可達91.48%。本研究結果與劉公梅［16］和吳芹［17］等結果相似，而與吳長輝［10］的研究結果相反。出現(xiàn)以上不同結果差異的原因在于，一般而言隨著濃度的增加，蔗糖對孢子萌發(fā)的抑制作用加重［18］，但由于孢子種類不同，萌發(fā)時需要的營養(yǎng)物質與滲透壓不同，有些植物孢子萌發(fā)需要較高濃度的蔗糖與無機鹽［19］。在本研究中，孢子萌發(fā)只設置了3個無機鹽濃度水平和3個蔗糖濃度水平，其他的培養(yǎng)基及蔗糖濃度水平的培養(yǎng)效果有待進一步研究，生長素與細胞分裂素對孢子萌發(fā)的影響程度及原葉體增殖和生根誘導等有待于進一步研究，以完善光葉蕨組培快繁技術體系。

4 結論

滅菌處理對光葉蕨孢子污染率和萌發(fā)率有顯著的影響，孢子滅菌和萌發(fā)的最佳滅菌方式是0.1%升汞溶液4 000 r·min-1離心5 min后去除清液，無菌水沖洗4～5次，其次是3%NaClO溶液4 000 r· min-1離心5 min后去除清液，無菌水沖洗4～5次。不同無機鹽濃度培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)率的大小為：1／2MS＞MS＞1／4MS；不同蔗糖濃度培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)率的大小為：20 g·L-1＞10 g·L-1＞30 g·L-1。孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為1／2MS＋20 g·L-1蔗糖，萌發(fā)率可達57.8%，該培養(yǎng)基培養(yǎng)的原葉體生長較快，個頭大，質地厚，色澤鮮綠。

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A Study of the M ethod of Spore Vitro Culture of Cystoathyrium chinensis Spores

CAIYu1YU Ling-fan2WEN Zhi-you2GONGWei1*YANG Hong-zhong3ZHAO Chang-ping1

（1.College of Forestry，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611134；2.Sichuan Academy of Forestry，Chengdu 610066；3.Forestry Bureau of Tianquan，Tianquan 205500）

In recent years，the growth environment of Cystoathyrium chinensis Ching has been seriously affected because of the destruction of human interference and geological disaster activities.The species is on the verge of extinction.For the protection and propagation of it，tissue culture propagation techniqueswere used to turnmature spores as explants.Researcheswere conducted on influences of different sterilization，themedium and sucrose concentration on spore germination.The results showed that the best sterilization was spores through 4 000 r·min-1centrifugal prepared spore suspension，0.1%mercuric chloride solution was centrifuged for 5 min，rinsed with sterilewater for 4～5 times；the best germinationmedium was 1／2MS＋20 g·L-1sucrose.After 90 d，the germination rate could reach 57.8%.

Cystoathyrium chinensis Ching，Spore，Germination

S723

A

1003-5508（2016）06-00-0

10.16779／j.cnki.1003-5508.2016.06.016

2016-08-08

天全縣光葉蕨極小種群拯救保護生境營造及技術培訓部分項目（天政采招［2014］27號）。

蔡煜（1993-），碩士生，四川溫江人，從事森林培育及生物技術方面研究。E-mail：627200302＠qq.com。通訊作者：余凌帆（1977-），男，四川渠縣人，副研究員，現(xiàn)從事小種群研究與保護方面工作。