劉東亮,馬秀嵐

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng)110000)

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膽脂瘤上皮細(xì)胞中Caspase-9及Smac的表達(dá)變化及其相關(guān)性

劉東亮1,馬秀嵐2

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽(yáng)110000)

摘要：目的探討膽脂瘤上皮細(xì)胞中Caspase-9和Smac的表達(dá)變化及其相關(guān)性。方法 選取16例膽脂瘤樣本及10例正常對(duì)照樣本。應(yīng)用免疫組化法及Western blotting法檢測(cè)Caspase-9和Smac的表達(dá)。采用Spearman檢驗(yàn)分析Caspase-9和Smac的相關(guān)性。結(jié)果膽脂瘤上皮細(xì)胞中Caspase-9及Smac蛋白表達(dá)較正常對(duì)照明顯降低(P均<0.01)，Smac及Caspase-9的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.744，P<0.01)。結(jié)論 膽脂瘤上皮細(xì)胞中Smac和Caspase-9的表達(dá)降低，Smac及Caspase-9的表達(dá)呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：膽脂瘤；Caspase-9；Smac；信號(hào)傳導(dǎo)通路

膽脂瘤是以上皮細(xì)胞增殖分化形成的角化上皮堆積為特點(diǎn)的慢性中耳疾病，如不積極治療，可進(jìn)行性破壞中耳及周圍重要結(jié)構(gòu)(如面神經(jīng)、顱底結(jié)構(gòu)等)，導(dǎo)致聽(tīng)力下降、面癱等，甚至是嚴(yán)重性的顱內(nèi)并發(fā)癥。膽脂瘤雖具有腫瘤的某些特性，但它并非真正的腫瘤。無(wú)凋亡抑制是其與惡性腫瘤區(qū)別的一個(gè)重要因素。Caspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑的起始因子，而Smac是內(nèi)源性凋亡時(shí)由線粒體釋放的促凋亡因子。我們檢測(cè)膽脂瘤上皮細(xì)胞中Caspase-9和Smac的表達(dá)，并分析了其相關(guān)性，來(lái)初步探討內(nèi)源性凋亡在膽脂瘤中的作用。

1資料與方法

1.1臨床資料取2012~2014年于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬耳鼻咽喉頭頸外科診斷并行手術(shù)治療的16例膽脂瘤患者的上皮組織標(biāo)本(膽脂瘤組)，其中患者男6例、女10例，年齡10～60(30.75±17.92)歲，均有1個(gè)月至40年的慢性耳流膿病史，標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為膽脂瘤；10例對(duì)照組標(biāo)本來(lái)自于同期因耳后或耳廓腫物接受手術(shù)治療的患者安全緣皮膚，病理證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞。

1.2上皮細(xì)胞中Caspase-9和Smac蛋白的檢測(cè) ①蛋白定性表達(dá)：采用免疫組化法。取新鮮膽脂瘤組織及安全緣皮膚，一部分送病理證實(shí)，余浸入甲醛溶液中保存，擇期包埋，制作石蠟標(biāo)本。按照常規(guī)SABC法進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)空白對(duì)照。上述步驟中用己知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以排除非特異性著色。結(jié)果判定：細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。在陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行分析。先按染色強(qiáng)度計(jì)分:O分為沒(méi)有染色，1分為微弱棕黃色，2分為中等強(qiáng)度棕黃色，3分為深棕色；然后每張400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞的平均百分比，按照百分比計(jì)分: 0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。每張切片隨機(jī)取3個(gè)400倍視野,每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分，計(jì)算表達(dá)積分(染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分乘積)，并規(guī)定此積分：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。②蛋白定量表達(dá)：采用Western blotting法。將少量組織塊(100 mg左右)置于 1～2 mL 勻漿器中球狀部位，加400 μL 單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器進(jìn)行勻漿，裂解30 min 后，即可用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4 ℃、1 2000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20 ℃保存。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10% SDS-PAGE膠垂直電泳，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，保持每孔40 μg蛋白上樣。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉常溫下封閉搖床l h，PBS液洗膜3次，每次15 min，然后加入按說(shuō)明書(shū)要求稀釋的Caspase-9和Smac和內(nèi)參GAPDH抗體，于4 ℃孵育過(guò)夜。TBST液洗膜3次，每次15 min，加入二抗，室溫下?lián)u床l h。TBST液洗膜3次，每次15 min，用ECL顯色液顯色，定影液終止顯色。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1各組Caspase-9、Smac的表達(dá)對(duì)照組Smac表達(dá)局限于基底部增生區(qū)細(xì)胞胞質(zhì)中，越靠近角質(zhì)層其表達(dá)越弱或呈陰性表達(dá)。膽脂瘤上皮無(wú)或弱陽(yáng)性(-～+)表達(dá)，主要集中在顆粒細(xì)胞層。對(duì)照組Caspase-9局限于基底部增生區(qū)細(xì)胞胞質(zhì)中，越靠近角質(zhì)層其表達(dá)越弱或呈陰性表達(dá)。膽脂瘤上皮無(wú)或弱陽(yáng)性(-～+)表達(dá)，主要集中在顆粒細(xì)胞層和透明細(xì)胞層。膽脂瘤組Smac的表達(dá)為-、+、++、+++分別為0、6、4、0例，對(duì)照組分別為5、11、0、0例。膽脂瘤上皮的Smac表達(dá)明顯弱于對(duì)照組(χ2=4.975，P<0.05)。膽脂瘤組Caspase-9的表達(dá)為-、+、++、+++分別為0、6、4、0例，對(duì)照組分別為6、10、0、0例。膽脂瘤組Caspase-9表達(dá)明顯弱于對(duì)照組(χ2=10.156，P<0.01)。膽脂瘤組、對(duì)照組Caspase-9表達(dá)分別為0.47±0.11、0.87±0.14，Smac表達(dá)分別為0.23±0.12、0.71±0.13。膽脂瘤組Caspase-9、Smac的表達(dá)均低于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　Western blotting法檢測(cè)Caspase-9及Smac的表達(dá)

2.2Smac及Caspase-9表達(dá)的相關(guān)性Smac與Caspase-9的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.744，P<0.01)。

3討論

中耳膽脂瘤為囊袋狀結(jié)構(gòu)，囊內(nèi)壁為復(fù)層鱗狀上皮，后天原發(fā)或繼發(fā)于中耳的膽脂瘤上皮多來(lái)源于鼓膜上皮層，形成的囊內(nèi)充滿脫落上皮、角化物質(zhì)和膽固醇結(jié)晶。人們通過(guò)研究膽脂瘤上皮細(xì)胞中增殖標(biāo)志物，試圖證明膽脂瘤囊內(nèi)壁復(fù)層鱗狀上皮高度增生的特性。這些標(biāo)志物包括細(xì)胞角蛋白[1]、增殖細(xì)胞核抗原[2]、表皮生長(zhǎng)因子[3]、Ki67[4]、HMGB-1[5]等。最后這些結(jié)果都支持膽脂瘤上皮細(xì)胞具有高度增殖的行為，且這種增殖主要以基底層為主。

在一個(gè)多細(xì)胞機(jī)體中，細(xì)胞分裂增殖與凋亡是對(duì)立統(tǒng)一的，共同協(xié)調(diào)著組織和器官形態(tài)發(fā)生的發(fā)展方向，使組織細(xì)胞數(shù)處于動(dòng)態(tài)平衡。在中耳膽脂瘤中，其鱗狀上皮具有高度增殖現(xiàn)象已經(jīng)被公認(rèn)，這與腫瘤相似，但是中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞仍具有凋亡能力，從而使中耳膽脂瘤上皮的細(xì)胞處于相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡，高速產(chǎn)生大量的角化碎片。

目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要集中在三條途徑：外源性凋亡途徑(死亡受體途徑)、內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[6~8]。Caspase 家族成員大多都是凋亡的啟動(dòng)子或效應(yīng)子, 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有14 種Caspase蛋白，其中Caspase-3 起著關(guān)鍵作用，而且也是目前為止在Caspase家族中研究比較透徹的一個(gè)，它是最主要的效應(yīng)因子，一旦被激活，即發(fā)生下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng),則凋亡便不可避免，于是Caspase-3 也被稱為“死亡蛋白酶”[10]。正常情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3 以無(wú)活性的酶原形存在, 細(xì)胞凋亡信號(hào)的出現(xiàn)可導(dǎo)致Caspase-3 在多種蛋白水解酶的作用下,發(fā)生裂解而活化[11~13]。

凋亡的執(zhí)行過(guò)程是一系列Caspase蛋白級(jí)聯(lián)切割的過(guò)程。不同蛋白酶分別切割并激活Caspase-3 酶原。活化的Caspase-3 又進(jìn)一步切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞走向死亡。在內(nèi)源性凋亡途徑中，由于生長(zhǎng)激素撤退、射線輻射等凋亡因素刺激后，引起B(yǎng)H3-Only蛋白中促凋亡因子較抗凋亡因子成分增加，線粒體膜改變(如離子通道開(kāi)放、膜電位下降及通透性增高等)，線粒體膜間隙的細(xì)胞色素C等釋放，釋放到胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與Apaf-1及dATP結(jié)合，形成的復(fù)合物募集pro-Caspase-9，形成凋亡復(fù)合體，pro-Caspase-9自動(dòng)活化，Caspase-9為線粒體凋亡的起始因子，活化的Caspase-9剪切并將執(zhí)行Caspase(如Caspase-3, -6 and -7)活化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14~17]。凋亡抑制蛋白(IAPs)是Caspase家族的抑制因子，該家族成員均含有1～3個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)序列，利用此結(jié)構(gòu)區(qū)與Caspase-8,7,9結(jié)合而發(fā)揮抑制凋亡的作用[16]。Smac蛋白正常時(shí)也位于線粒體膜間隙，在凋亡誘導(dǎo)因子的作用下，同細(xì)胞色素C一起釋放人胞質(zhì)，與凋亡IAPs結(jié)合并解除其對(duì)Caspases的抑制作用，從而使Caspase活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)Smac與Caspase-9在膽脂瘤上皮細(xì)胞中的表達(dá)均弱于對(duì)照組，說(shuō)明以Caspase-9為起始因子的內(nèi)源性凋亡途徑在膽脂瘤上皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程中是被抑制的，這可能與膽脂瘤的病因及刺激因素有關(guān)，因?yàn)閮?nèi)源性凋亡的刺激因素主要為生長(zhǎng)因子撤退、癌基因激活、DNA損傷、化療和射線等。本病例中患者均有慢性中耳炎病史，而在炎癥反應(yīng)過(guò)程中炎細(xì)胞釋放的白介素、腫瘤壞死因子等恰恰是誘導(dǎo)外源性凋亡的重要細(xì)胞因子;本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組上皮細(xì)胞的Smac及Caspase-9均有陽(yáng)性表達(dá)，且均以基底層為主，說(shuō)明皮膚正常細(xì)胞確實(shí)存在增殖與凋亡的負(fù)反饋?zhàn)饔?，使基底?xì)胞在迅速增殖的過(guò)程中凋亡相關(guān)因子亦增加，阻止基底細(xì)胞的過(guò)度增殖。無(wú)論在對(duì)照組亦或是膽脂瘤組，Caspase-9與Smac的表達(dá)水平呈正相關(guān)，證實(shí)了Smac通過(guò)結(jié)合IAP，阻斷IAP對(duì)Caspase-9的抑制作用，增強(qiáng)了Caspase-9的促凋亡作用。但是由于IAP不僅能結(jié)合Caspase-9，也能結(jié)合其他凋亡相關(guān)的Caspases，所以Smac結(jié)合IAP后，亦能增強(qiáng)其他Caspases的凋亡活性。

總之，本研究結(jié)果顯示，與正常上皮比較，內(nèi)源性凋亡在膽脂瘤中是明顯受到抑制的，通過(guò)解除這種抑制從而達(dá)到對(duì)膽脂瘤的藥物治療效果，可能將會(huì)是今后努力的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Olszewska E, Sudhoff H. Comparative cytokeratin distribution patterns in cholesteatoma epithelium[J]. Histol Histopathol, 2007,22(1):37-42.

[2] Raffa S, Leone L, Scrofani C, et al. Cholesteatoma-associated fibroblasts modulate epithelial growth and differentiation through KGF/FGF7 secretion[J]. Histochem Cell Biol, 2012,138(2):251-269.

[3] Thorup MB, Munk M, Poulsen SS, et al. Expression of the epidermal growth factor system in human middle ear cholesteatoma[J]. Acta Otolaryngol, 2014,134(2):124-134.

[4] Kuczkowski J, Pawelczyk T, Bakowska A, et al. Expression patterns of Ki-67 and telomerase activity in middle ear cholesteatoma[J]. Otol Neurotol, 2007,28(2):204-207.

[5] Chi Z, Wang Z, Liang Q, et al. Induction of cytokine production in cholesteatoma keratinocytes by extracellular high-mobility group box chromosomal protein 1 combined with DNA released by apoptotic cholesteatoma keratinocytes[J]. Mol Cell Biochem, 2015,400(1-2):189-200.

[6] Kiechle FL, Zhang X. Apoptosis: biochemical aspects and clinical implications[J]. Clin Chim Acta, 2002,326(1-2):27-45.

[7] Ashe PC, Berry MD. Apoptotic signaling cascades[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2003,27(2):199-214.

[8] Liu H, Baliga R. Endoplasmic reticulum stress-associated caspase 12 mediates cisplatin-induced LLC-PK1 cell apoptosis[J]. J Am Soc Nephrol, 2005,16(7):1985-1992.

[9] Stepień A, Izdebska M, Grzanka A. The types of cell death[J]. Postepy Hig Med Dosw, 2007,61:420-428.

[10] Poreba M, Strózyk A, Salvesen GS, et al. Caspase substrates and inhibitors[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013,5(8):a008680.

[11] Galluzzi L, Kepp O, Kroemer G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy[J]. Oncogene, 2012, 31(23):2805-2808.

[12] Snigdha S, Smith ED, Prieto GA, et al. Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J]. Neurosci Bull, 2012,28(1):14-24.

[13] Choudhary GS, Al-Harbi S, Almasan A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Methods Mol Biol, 2015,1219:1-9.

[14] Shi L, Chen J, Yang J, et al. MiR-21 protected human glioblastoma U87MG cells from chemotherapeutic drug temozolomide induced apoptosis by decreasing Bax/Bcl-2 ratio and caspase-3 activity[J]. Brain Res, 2010,1352:255-264.

[15] Kuida K. Caspase-9[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2000,32(2):121-124.

[16] Yang D, Song X, Zhang J, et al. Therapeutic potential of siRNA-mediated combined knockdown of the IAP genes (Livin, XIAP, and Survivin) on human bladder cancer T24 cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2010,42(2):137-144.

[17] Du C, Fang M, Li Y, et al. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J]. Cell, 2000,102(1):33-42.

《山東醫(yī)藥》第55卷第45期73頁(yè)“塵螨過(guò)敏哮喘患兒舌下含服粉塵螨滴劑后血清塵螨SlgE、SlgG4及IL-12、IL-13水平變化”一文應(yīng)為上海市嘉定區(qū)衛(wèi)生局青年科研基金立項(xiàng)項(xiàng)目(QNKYJJ 2012-12-02)。

本刊編輯部

(收稿日期：2015-03-09)

中圖分類號(hào)：R735.8

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)01-0049-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.018

通信作者：馬秀嵐(E-mail：subtlety@126.com)