吳松麗

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443000)

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·基礎(chǔ)研究·

子宮內(nèi)膜癌組織中miR-15a的表達(dá)變化及其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

吳松麗

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443000)

摘要：目的探討miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法 選取原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織標(biāo)本79份，利用熒光定量PCR檢測組織中miR-15a的表達(dá)。將miR-15a模擬物(miR-15a轉(zhuǎn)染組)、無關(guān)序列模擬物(非轉(zhuǎn)染組)轉(zhuǎn)染入RL95-2人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，并設(shè)立陰性對照組。利用熒光定量PCR檢測RL95-2細(xì)胞中miR-15a表達(dá)，利用Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)對RL95-2細(xì)胞遷移能力和侵襲力進(jìn)行檢測，利用Western blotting法檢測RL95-2細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的表達(dá)。結(jié)果miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中相對表達(dá)量(2.37±0.96)顯著低于癌旁組織(4.83±1.27)(P<0.05)；miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)；miR-15a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-15a相對表達(dá)量(8.71±2.65)顯著高于陰性對照組(3.62±1.97)和未轉(zhuǎn)染組(3.59±1.83)(P均 <0.05)；miR-15a轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組(P均<0.05)；miR-15a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2蛋白相對表達(dá)量(1.62±0.59)顯著低于陰性對照組(4.57±2.05)和未轉(zhuǎn)染組(4.64±2.17)(P均<0.05)。結(jié)論 miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)的miR-15a可通過抑制MMP-2蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：子宮腫瘤；miR-15a；侵襲；轉(zhuǎn)移；基質(zhì)金屬蛋白酶2

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重危害婦女健康的上皮性惡性腫瘤，占女性生殖道惡性腫瘤的25%～35%[1,2]。微小RNA(miRNAs)是一種內(nèi)源性小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)[3]。研究[4]表明，miRNA不僅調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、凋亡等過程，而且與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切。miR-15a是miR-15家族重要成員，是一類高度保守的miRNA[5]。有研究[6]指出，miR-15a與惡性腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移過程關(guān)系密切。2012年10月~2014年10月，本研究觀察了miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)變化，并探討其與臨床病理特征及腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為臨床實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1標(biāo)本、細(xì)胞及試劑來源經(jīng)病理學(xué)檢查的子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織79份，均來自三峽大學(xué)仁和醫(yī)院。根據(jù)FIGO 2000分期：Ⅰ期11份、Ⅱ期24份、Ⅲ期29份、Ⅳ期15份；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16份。 RL95-2人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞購自上海研域生物工程有限公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰酶均購自美國Gibco公司，總RNA提取試劑盒TRIzol和LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Roche公司，miR-15a片段設(shè)計(jì)及合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自南京生興生物，Cell Counting Kit-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，8.0 μm孔徑Transwell小室購自北京樂博生物科技有限公司，基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗兔(HRP標(biāo)記)均購自中杉金橋生物公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織miR-15a的檢測采用熒光定量PCR法。 利用總RNA提取試劑盒提取腫瘤組織、癌旁組織的RNA。利用紫外分光光度儀對提取RNA濃度及純度進(jìn)行檢測，取A260/A280值≥1.8樣品進(jìn)行PCR。將miR-15a設(shè)計(jì)成莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：miR-15：5′-GTCGTATC-CAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATFGCACTGGAT-ACGACCACAAACC-3′。以cDNA為模板完成轉(zhuǎn)錄，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR測定。miR-15a逆轉(zhuǎn)錄引物：上游：5′-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3′，以試劑盒中的通用引物作為下游引物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性45 s，95 ℃ 10 s，74 ℃ 15 s，反復(fù)進(jìn)行循環(huán)36次。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)檢測復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。利用2-ΔΔCt法對miR-15a相對表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3RL95-2細(xì)胞培養(yǎng)與miR-15a基因轉(zhuǎn)染①將RL95-2細(xì)胞株置于DMEM培養(yǎng)基中，放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁增殖，用0.25%胰酶消化、傳代，取對數(shù)生長的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。②根據(jù)LipofectamineTM2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒說明，分別將miR-15a模擬物(miR-15a轉(zhuǎn)染組)、無關(guān)序列模擬物(未轉(zhuǎn)染組)轉(zhuǎn)染入RL95-2細(xì)胞，并設(shè)立陰性對照組，于轉(zhuǎn)染后8 h將所有細(xì)胞置于新鮮完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4RL95-2細(xì)胞miR-15a表達(dá)的檢測采用熒光定量PCR法。利用總RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，其余步驟及結(jié)果的計(jì)算同1.2。

1.5RL95-2細(xì)胞遷移能力的檢測采用Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)小室置入24孔板中，取2×105個(gè)轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，將細(xì)胞混合液貼壁放置于小室上層，將含20% FBS的培養(yǎng)基加入到小室下層，于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)15 h，將小室取出并去除培養(yǎng)基，將上層細(xì)胞擦去，用PBS沖洗3次，于室溫下用甲醇固定5 min，用0.5%結(jié)晶紫進(jìn)行5 min染色后，用清水浸洗5～8次，倒置晾干后，用刀片將膜取下，封片后于高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6RL95-2細(xì)胞侵襲能力的檢測 采用Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。取保存于-20 ℃的基質(zhì)膠，于4 ℃條件下過夜融化，在冰上將4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋到1 mg/mL。取40 μL稀釋后的基質(zhì)膠包被小室多聚碳酸酯膜的上室面，于37 ℃條件下孵育3～5 h，凝固后備用；取4×105個(gè)轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，將細(xì)胞混合液加到基質(zhì)膠上層，將含20% FBS的培養(yǎng)基加到小室下層，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后將小室取出，擦拭掉上層細(xì)胞后，用PBS沖洗3次，室溫下用甲醇進(jìn)行固定后，用結(jié)晶紫進(jìn)行染色，清水浸洗后晾干，封片。于高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對穿膜細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7RL95-2細(xì)胞MMP-2蛋白的檢測利用Western blotting法。利用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行檢測。取提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)PVDF膜后，用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉60 min，分別將1∶1 000和1∶20 000稀釋的MMP-2及對照蛋白特異性一抗加入，于4 ℃下過夜孵育，用TBST進(jìn)行漂洗4次，每次4 min，將相應(yīng)濃度二抗加入后，于室溫下靜置60 min，再用TBST漂洗4次，每次4 min，加入ECL，于暗室條件下顯影，利用Quantity One軟件對顯影條帶進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中miR-15a的表達(dá)比較miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中相對表達(dá)量為2.37±0.96、癌旁組織為4.83±1.27，兩者比較，t=10.896，P=0.000。

2.2miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與組織學(xué)分級和肌層浸潤無關(guān)(P均>0.05)，與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，詳見表1。

表1　miR-15a表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系±s)

2.3各組miR-15a的相對表達(dá)量比較miR-15a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-15a相對表達(dá)量為8.71±2.65、陰性對照組為3.62±1.97、未轉(zhuǎn)染組為3.59±1.83，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.165，P<0.05)，miR-15a轉(zhuǎn)染組高于陰性對照組及未轉(zhuǎn)染組(t分別為14.148、14.190，P均<0.05)。

2.4各組細(xì)胞遷移力和侵襲力比較miR-15a轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組(P均<0.05)，詳見表2。

2.5各組MMP-2蛋白表達(dá)的比較miR-15a轉(zhuǎn)染

表2　各組細(xì)胞遷移力和侵襲力比較(個(gè)±s)

注：與未轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，#P<0.05。

組細(xì)胞中MMP-2蛋白相對表達(dá)量為1.62±0.59、陰性對照組為4.57±2.05、未轉(zhuǎn)染組為4.64±2.17，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.381，P<0.05)； miR-15a轉(zhuǎn)染組低于陰性對照組、未轉(zhuǎn)染組(t分別為10.458、7.747，P均<0.05)。

3討論

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤，早期治療往往預(yù)后良好，但隨著腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，患者5年生存率顯著下降[7]。腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)的、多步驟的生物學(xué)過程，需要多種細(xì)胞因子和生長因子共同參與完成[8]，對腫瘤細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究，有助于為腫瘤的生物治療提供作用靶位。miR-15a是miRNA重要類型之一，位于人染色體13q14。研究[9]表明，miR-15a是抑癌基因，在多數(shù)惡性腫瘤中呈低表達(dá)或不表達(dá)。本研究顯示，miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中相對表達(dá)量顯著低于癌旁組織，進(jìn)一步與臨床病理特征關(guān)系分析顯示，miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與FIGO高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān),提示miR-15a可能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤。

為進(jìn)一步研究miR-15a在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤中的作用，采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法，分別對RL95-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同的miR-15a模擬片段，利用Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)[10]對miR-15a不同表達(dá)細(xì)胞的遷移力和侵襲力進(jìn)行檢測， 結(jié)果顯示，miR-15a轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組，說明miR-15a與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲力有關(guān)，過表達(dá)miR-15a可抑制RL95-2細(xì)胞體外遷移和侵襲力。

MMP-2作為MMPs家族重要成員，可使細(xì)胞外基質(zhì)中纖維膠原發(fā)生裂解；同時(shí)，可使骨膠原發(fā)生降解，從而加速腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散過程[11]。有研究[12]指出，子宮內(nèi)膜癌組織中MMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高，且與淋巴轉(zhuǎn)移及組織浸潤有關(guān)。為進(jìn)一步探討miR-15a在抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的可能機(jī)制，本研究對不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，miR-15a轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2蛋白相對表達(dá)量顯著低于陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組，說明過表達(dá)的miR-15a可能通過減少M(fèi)MP-2蛋白表達(dá)而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，miR-15a在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，過表達(dá)的miR-15a可能通過抑制MMP-2顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲，提示miR-15a在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，有望為子宮內(nèi)膜癌早期發(fā)現(xiàn)提供參考及生物學(xué)治療提供新的靶位。

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(收稿日期：2015-08-25)

中圖分類號：R737.33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0024-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.008