姚　堯，王　琪，荊小莉，李　冰，張胤鳴，王志軍，李成志，林漢成，張　吉，黃　平，王振原（.西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，陜西西安7006；.西安市公安局高新分局，陜西西安70065；.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海0006）

?

豬肋軟骨和肋骨的ATR-FTIR光譜變化與死亡時(shí)間的關(guān)系

姚堯1，2，王琪1，荊小莉2，李冰1，張胤鳴1，王志軍1，李成志1，林漢成1，張吉1，黃平3，王振原1
（1.西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，陜西西安710061；2.西安市公安局高新分局，陜西西安710065；3.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

摘要：目的應(yīng)用衰減全反射傅里葉變換紅外（attenuated total reflection-Fourier transform infrared，ATRFTIR）光譜技術(shù)分析長(zhǎng)白豬死后肋軟骨和肋骨組織隨死亡時(shí)間推移的化學(xué)降解過(guò)程，為死后較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)推斷死亡時(shí)間提供可行的新途徑和方法。方法豬放血處死后取肋軟骨和肋骨離體置于20℃環(huán)境，后每72h提取部分組織樣本，進(jìn)行ATR-FTIR光譜分析，并與對(duì)應(yīng)死亡時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果隨死亡時(shí)間的延長(zhǎng)，肋軟骨與肋骨FTIR的主要吸收峰峰位沒(méi)有發(fā)生明顯變化，而其部分峰強(qiáng)比出現(xiàn)了不同時(shí)序性的變化趨勢(shì)，并與死亡時(shí)間存在良好的相關(guān)性，肋軟骨較肋骨組織有更好的時(shí)序性。結(jié)論應(yīng)用ATRFTIR光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)死后豬肋軟骨和肋骨組織光譜學(xué)變化存在一定的規(guī)律性，有望成為基于光譜學(xué)推斷死亡時(shí)間的一種新途徑。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；譜學(xué)，傅里葉變換紅外；衰減全反射；肋骨；肋軟骨；死亡時(shí)間；豬

傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜技術(shù)有著特異性高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，目前除被廣泛應(yīng)用于藥物研究、化工冶煉、刑偵鑒定等多個(gè)領(lǐng)域外，還可用于生物大分子結(jié)構(gòu)定性、定量的研究[1-2]。該技術(shù)可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞和組織等復(fù)雜體系內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)的含量變化，而無(wú)須運(yùn)用物理和化學(xué)手段對(duì)樣本進(jìn)行破壞性的處理[3-6]。

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷是死亡案件需要解決的重要問(wèn)題之一，對(duì)于確定和排除嫌疑人、縮小偵查范圍等工作有著非常重要的價(jià)值。前期研究[7-13]中，通過(guò)利用FTIR光譜技術(shù)研究大鼠不同軟組織死后光譜學(xué)的變化規(guī)律，已經(jīng)證明了該技術(shù)在PMI推斷研究中的可行性。但是，由于尸體腐敗和昆蟲(chóng)入侵等原因，肌肉、心、腎等軟組織難以長(zhǎng)久保存。尤其是死亡1周以上的尸體，除了法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)能有所幫助外，傳統(tǒng)法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中缺乏一套行之有效的方法來(lái)推斷這類(lèi)尸體的PMI[14]，故利用軟組織的光譜學(xué)性質(zhì)推斷PMI有著其固有的“時(shí)間窗”限制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性長(zhǎng)白豬4只，由陜西肉聯(lián)廠(chǎng)提供，電擊至昏后放血處死，選擇豬離體肋軟骨和肋骨，盡量保留其周?chē)浗M織，置于溫度20℃、濕度60%的恒溫恒濕環(huán)境中，于死后0~30 d每隔72 h取材（即0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d），每次取材部位均位于肋軟骨或肋骨表面且相互不影響，組織塊大小約為2.0mm×2.0mm×0.5mm，并保證樣本表面平整，PBS溶液洗凈樣本表面，置于2.5mL管內(nèi)-80℃凍存。

1.2測(cè)量方法及測(cè)量參數(shù)設(shè)置

取出-80℃凍存的樣本，-50℃真空凍干24 h，使用日本Shimadzu公司生產(chǎn)的FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀在4000~400cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)累計(jì)100次。為消除樣本厚度和含量帶來(lái)的差異，本實(shí)驗(yàn)采用峰強(qiáng)比的相對(duì)值作為分析數(shù)據(jù)。

1.3光譜指標(biāo)選擇

根據(jù)光譜吸收峰的分布，將4000~400cm-1中紅外分為3區(qū)（Ⅰ：3 500~2 800 cm-1；Ⅱ：1 700~1 350 cm-1；Ⅲ：1 350~900 cm-1）。選擇紅外光譜中主要吸收峰為研究指標(biāo)[4]（表1），通過(guò)峰強(qiáng)比消除樣本厚度帶來(lái)的影響。選取峰強(qiáng)比：A2 925/A3 303、A2 852/A3 303、A1 652/A1 541、A1652/A1396、A1541/A1396、A1454/A1396、A1238/A1396、A1080/A1396。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

紅外光譜圖分析運(yùn)用Shimadzu公司提供的IR solution v1.10軟件，測(cè)量紅外光譜中各個(gè)譜帶峰位、峰強(qiáng)度，并計(jì)算不同吸收峰的峰強(qiáng)比。采用SPSS 18.0計(jì)算不同PMI吸收峰峰強(qiáng)比，用x±s表示；用7種數(shù)學(xué)擬合方程對(duì)峰強(qiáng)比和PMI進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

在敘述的過(guò)程中，要詳細(xì)的敘述能夠直接表現(xiàn)文章主題的材料，與主題有關(guān)但不能直接表現(xiàn)主題的材料要盡量采用概述的方式。

表1 FTIR光譜中主要吸收峰指認(rèn)

2結(jié)　果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)FTIR光譜峰位變化

豬死后不同時(shí)間點(diǎn)骨的FTIR圖譜分析顯示，在4000~400cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，隨著PMI的推移，9個(gè)吸收峰沒(méi)有明顯的峰位改變。說(shuō)明豬死后30d內(nèi)，骨組織所含的主要化學(xué)基團(tuán)構(gòu)型并未發(fā)生明顯的改變。

2.2豬死后骨FTIR圖譜光譜學(xué)改變

光譜吸收峰強(qiáng)度大體上表現(xiàn)為3種趨勢(shì)：上升、下降、保持穩(wěn)定。在2925、2852、1541、1396cm-1處隨PMI延長(zhǎng)升高，在1238、1080cm-1處隨PMI延長(zhǎng)下降，3303、1652、1454cm-1處相對(duì)保持穩(wěn)定，但3303cm-1吸收峰峰面積逐漸減小，而1 396 cm-1吸收峰峰面積逐漸增大（圖1）。

總體而言，豬個(gè)體之間雖然峰位沒(méi)有明顯區(qū)別，但是峰強(qiáng)比存在一定個(gè)體差異。其中，個(gè)體之間差異以A2925/A3303、A2852/A3303較為明顯；同時(shí)肋軟骨組織的差異普遍小于肋骨組織的差異。

在肋骨和肋軟骨組織的峰強(qiáng)比中，A2 925/A3 303、A2852/A3303在6 d內(nèi)隨PMI延長(zhǎng)而上升，肋軟骨在6 d達(dá)到峰值后出現(xiàn)下降并于15 d后保持穩(wěn)定，而肋骨組織在6d達(dá)到峰值后開(kāi)始下降直至15d，而后又上升至30d實(shí)驗(yàn)結(jié)束。A1652/A1541、A1652/A1396在6d內(nèi)隨PMI延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，而后趨于穩(wěn)定。A1 238/A1 396隨PMI的延長(zhǎng)一直呈下降趨勢(shì)。肋軟骨組織的峰強(qiáng)比中A1 080/A1 396是下降趨勢(shì)，而肋骨的這兩個(gè)峰強(qiáng)比均在3d達(dá)到峰值，隨后呈上下波動(dòng)狀態(tài)（圖2）。A1541/A1396、A1313/A1396變化則不穩(wěn)定，故未在圖2中列出。

將豬肋軟骨與肋骨不同峰強(qiáng)比與PMI進(jìn)行7種曲線(xiàn)擬合后，發(fā)現(xiàn)A1 238/A1 396、A1 080/A1 396的三次方曲線(xiàn)擬合方程有著最佳擬合決定系數(shù)（P＜0.05，表2，圖3~4）。

表2豬肋軟骨峰強(qiáng)比死后的三次方曲線(xiàn)擬合回歸方程

3討　論

本研究以豬肋軟骨和肋骨為研究對(duì)象，在4000~ 400 cm-1頻率范圍內(nèi)測(cè)定不同PMI點(diǎn)的FTIR圖譜。一般而言，物質(zhì)分子中不同構(gòu)型的基團(tuán)在FTIR光譜中都有著其各自對(duì)應(yīng)的吸收峰，可根據(jù)這些特征性吸收峰峰位是否發(fā)生變化來(lái)推斷物質(zhì)分子中主要化學(xué)基團(tuán)的構(gòu)型是否發(fā)生了變化。結(jié)果顯示，隨著PMI的推移吸收譜的峰位沒(méi)有明顯的變化，吸收峰峰強(qiáng)呈上升、下降和保持穩(wěn)定3種變化趨勢(shì)，相應(yīng)峰強(qiáng)比也出現(xiàn)同樣的變化趨勢(shì)。豬肋軟骨與肋骨的光譜學(xué)變化基本相似，但是肋軟骨比肋骨的結(jié)果更為穩(wěn)定，個(gè)體差異更小，擬合優(yōu)度更高。一方面這可能是肋軟骨質(zhì)地更為均勻，減小了取材部位帶來(lái)的誤差；另一方面則可能肋軟骨更為柔軟，切割取材時(shí)切面更光滑，能更好地與探頭晶體緊密接觸，減少了光束的散射。

3.1Ⅰ區(qū)3500~2800cm-1范圍光譜學(xué)變化

C-H伸縮振動(dòng)引起了3303~2800cm-1波數(shù)區(qū)域的2個(gè)明顯吸收峰，2 925 cm-1和2 852 cm-1分別為CH2的反對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)的伸縮振動(dòng)，這兩個(gè)峰均來(lái)自組織內(nèi)脂類(lèi)的振動(dòng)[15-17]，死后肋軟骨和肋骨這兩個(gè)峰都有升高。筆者認(rèn)為，可能的機(jī)制為，生物體死亡后新陳代謝停止，體內(nèi)的脂質(zhì)含量在短時(shí)間內(nèi)相對(duì)保持不變，死亡晚期由于體內(nèi)外細(xì)菌的大量繁殖，脂質(zhì)的合成遠(yuǎn)大于分解。3303cm-1吸收峰主要是來(lái)自蛋白質(zhì)N-H振動(dòng)，其峰面積和峰寬相對(duì)縮小，說(shuō)明分子濃度有所降低導(dǎo)致其振動(dòng)減弱，該變化則是由蛋白質(zhì)降解所引起。

3.2Ⅱ區(qū)1700~1350cm-1范圍光譜學(xué)變化

1652cm-1吸收峰是由酰胺Ⅰ中C-O伸縮振動(dòng)引起，可以用來(lái)推測(cè)分子中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，1541cm-1是蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ中的N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生。骨和軟骨組織中，1652cm-1吸收峰峰強(qiáng)均保持穩(wěn)定，1541cm-1吸收峰在死后峰強(qiáng)都增加。1454cm-1吸收峰主要由脂肪CH2彎曲振動(dòng)引起，其次也可以來(lái)自于蛋白質(zhì)[18]，其在死后肋軟骨與肋骨中保持相對(duì)穩(wěn)定。A1 652/A1 541反映酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ比值的改變，由圖2可以看出該比值在兩種組織中6 d內(nèi)呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明相對(duì)于酰胺Ⅰ，酰胺Ⅱ含量在死后早期階段內(nèi)含量相對(duì)增加，而后二者的含量比值趨于相對(duì)穩(wěn)定。1 396 cm-1在所有光譜中存在，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積有所增加，該吸收峰是脂肪酸COO-振動(dòng)引起[18]，脂肪酸分子的增加為合成脂肪提供了基本原料，也印證了C-H分子的增加。

3.3Ⅲ區(qū)1350~900cm-1范圍光譜學(xué)變化

1 238 cm-1和1 080 cm-1吸收峰分別來(lái)自核酸中PO2-反對(duì)稱(chēng)與對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，可以反映組織中核酸的含量。本研究分析了死后肋軟骨和肋骨在不同時(shí)間點(diǎn)1080、1238和1 396cm-1處的峰強(qiáng)比，可以看出隨著PMI的推移，骨和軟骨組織中的PO2-含量呈緩慢下降趨勢(shì)，提示骨和軟骨組織中核酸降解速率相對(duì)較慢。國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者的研究也進(jìn)一步表明死后組織中核酸的含量與PMI存在著一些必然的聯(lián)系[19-21]。

本研究表明，F(xiàn)TIR光譜可以有效地檢測(cè)到豬死亡后肋軟骨和肋骨的光譜學(xué)變化，特別是比較穩(wěn)定的晚期的FTIR光譜變化，將為研究晚期PMI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前本實(shí)驗(yàn)只是在恒定溫度、濕度環(huán)境下對(duì)離體肋軟骨及肋骨組織進(jìn)行研究，與實(shí)際檢案中復(fù)雜環(huán)境中的在體組織有所差別。所以，為了更好地服務(wù)于法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)工作，還需要進(jìn)一步對(duì)不同溫度、不同死亡方式、不同個(gè)體、不同環(huán)境、人尸體骨組織和軟骨組織進(jìn)行測(cè)量，收集不同條件的ATR-FTIR光譜學(xué)數(shù)據(jù)，不斷進(jìn)行校正和完善。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃紅英，尹齊和.傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（ATR-FTIR）的原理與應(yīng)用進(jìn)展[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊（自然科學(xué)、醫(yī)學(xué)版），2011，32（1）：20-31.

[2]朱蕾，蘇艷.傅里葉紅外光譜分析在環(huán)境試驗(yàn)中的應(yīng)用[J].環(huán)境技術(shù)，2002，20（3）：5-9.

[3] Cohenford MA，Rigas B. Cytologically normal cells from neoplastic cervical samples display extensive structural abnormalities on IR spectroscopy：implications for tumor biology[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（26）：15327-15332.

[4] Movasaghi Z，Rehman S，ur Rehman I. Fourier Transform Infrared（FTIR）spectroscopy of biological tissues[J]. App Spectrosc Rev，2008，43（2）：134-179.

[5]范曉燕.傅立葉變換紅外光譜在生命科學(xué)中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)研究，2003，7（2）：83-87.

[6]吳瑾光.近代傅里葉變換紅外光譜技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1994.

[7] Huang P，Tian W，Tuo Y，et al. Estimation of Postmortem Interval in Rat Liver and Spleen Using Fourier Transform Infrared Spectroscopy[J]. Spectroscopy Letters，2009，42（2）：108-116.

[8] Huang P，Ke Y，Lu Q，et al. Analysis of postmortem metabolic changes in rat kidney cortex using Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Spectroscopy，2008，22（1）：21-31.

[9]黃平，蘇昌沛，李石松，等.大鼠心肌傅里葉變換紅外光譜變化與死亡時(shí)間的關(guān)系[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（1）：1-5.

[10]黃平，王世偉，白杰，等.應(yīng)用FTIR光譜技術(shù)推斷死亡時(shí)間[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（2）：104-109.

[11] Tuo Y，Huang P，Ke Y，et al. Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopic investigation of the postmortem metabolic process in rat and human kidney cortex[J]. Appl Spectrosc，2010，64（3）：268-274.

[12] Ke Y，Li Y，Wang ZY. The changes of fourier transform infrared spectrum in rat brain[J]. J Forensic Sci，2012，57（3）：794-798.

[13] Xuan MG，F(xiàn)u GW，Liu F，et al. The impact of gender，age and tissues in vitro on estimating postmortem interval by FTIR spectroscopy[J]. Fa Yi Xue Za Zhi，2013，29（1）：1-4.

[14]胡萃.法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)[M].重慶：重慶出版社，2000.

[15] Crane NJ，Bartick EG，Perlman RS，et al. Infrared spectroscopic imaging for noninvasive detection of latent fingerprints[J]. J Forensic Sci，2007，52（1）：48-53.

[16] Dogan A，Ergen K，Budak F，et al. Evaluation of disseminated candidiasis on an experimental animal model：a fourier transform infrared study[J]. Appl Spectrosc，2007，61（2）：199-203.

[17] Cakmak G，Togan I，Severcan F. 17Beta-estradiol induced compositional，structural and functional changes in rainbow trout liver，revealed by FT-IR spectroscopy：a comparative study with nonylphenol[J]. Aquat Toxicol，2006，77（1）：53-63.

[18] Cakmak G，Togan I，Ugˇuz C，et al. FT-IR spectroscopic analysis of rainbow trout liver exposed to nonylphenol[J]. Appl Spectrosc，2003，57（7）：835-841.

[19] Larkin B，Iaschi S，Dadour I，et al. Using accumulated degree-days to estimate postmortem interval from the DNA yield of porcine skeletal muscle[J]. Forensic Science Medicine & Pathology，2009，6（2）：83-92.

[20] Ma J，Pan H，Zeng Y，et al. Exploration of the R code-based mathematical model for PMI estimation using profiling of RNA degradation in rat brain tissue at different temperatures[J]. Forensic Science Medicine & Pathology，2015，11（4）：530-537.

[21]張志宏，袁雅潔.核酸與死亡時(shí)間的相關(guān)性及其檢測(cè)方法[J].中國(guó)司法鑒定，2013（1）：95-97.

（本文編輯：鄒冬華）

Relationship between PMI and ATR-FTIR Spectral Changes in Swine Costal Cartilages and Ribs

YAO Yao1,2, WANG Qi1, JING Xiao-li2, LI Bing1, ZHANG Yin-ming1, WANG Zhi-jun1, LI Cheng-zhi1, LIN Han-cheng1, ZHANG Ji1, HUANG Ping3, WANG Zhen-yuan1
（1. School of Forensic Science and Medicine, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China; 2. Gaoxin Branch of Xi’an Public Security Bureau, Xi’an 710065, China; 3. Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, P.R.China, Shanghai 200063, China）

Abstract：Objective To analyze postmortem chemical changes in Landrace costal cartilages and ribs using attenuated total reflection-Fourier transform infrared（ATR-FTIR）spectroscopy, and to provide a novel technique for estimation of postmortem interval（PMI）. Methods The swines were sacrificed by hemorrhage and their costal cartilages and ribs were kept in 20℃. The chemical analysis of the costal cartilages and ribs were performed using ATR-FTIR every 72 h. The correlation between the certain spectral parameters and PMI was also analyzed. The time-dependent changes of costal cartilages were more significant than ribs. Results There were no obvious changes for the main absorbance bands position, and some absorbance band ratios showed time-dependent changes and significant correlations with the PMI. Conclusion ATR-FTIR has the ability to analyze postmortem chemical changes of the swine costal cartilages and ribs, and it can be a new method to estimate PMI based on spectroscopy.

Key words：forensic pathology; spectroscopy, Fourier transform infrared; attenuated total reflection; ribs; costal cartilage; postmortem interval; swine

收稿日期：（2015-10-16）

通信作者：黃平，男，博士，研究員，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究及鑒定；E-mail：huangp@ssfjd.cn 王振原，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究及鑒定；E-mail：wzy218@mail.xjtu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273339、81273335）

作者簡(jiǎn)介：姚堯（1985—），男，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究及鑒定；E-mail：yaoxiangshuai@qq.com

文章編號(hào)：1004-5619（2016）01-0021-05

中圖分類(lèi)號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.005