李波 譚軍 鐘茜 李高峰 吳維子

[摘要]目的：檢測點陣激光治療前后黃褐斑實驗動物皮損中c-kit的變化，探討點陣激光對黃褐斑的治療機(jī)理。方法：建立黃褐斑實驗動物模型，應(yīng)用點陣激光干預(yù)動物模型。應(yīng)用免疫組化染色方法檢測治療前后c-kit表達(dá)的變化，使用醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)定量檢測各標(biāo)本中c-kit的陽性染色指數(shù)（pos it ive

index，PI）。結(jié)果：c-kit在黃褐斑小鼠模型中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，點陣激光干預(yù)側(cè)c-kit表達(dá)明顯低于未干預(yù)側(cè)，P<0.05。結(jié)論：點陣激光可能通過減少或抑制c-kit表達(dá)從而達(dá)到治療黃褐斑的目的。

[關(guān)鍵詞]點陣激光；黃褐斑；小鼠模型；C-kit

[中圖分類號]R758.4+2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）02-0030-03

黃褐斑是發(fā)生在顏而部的色素沉著斑，多發(fā)生于女性，皮損對稱性分布于顏而、額、而頰、鼻背、唇周及頦部皮膚；形態(tài)不規(guī)則，呈淡褐色或暗褐色，邊界明顯或模糊不清，常呈大片狀分布。其病因復(fù)雜，目前并不完全清楚，現(xiàn)認(rèn)為是多種因素綜合的結(jié)果。其主要因素有：過度接觸紫外線，內(nèi)分泌失調(diào)，情緒情感因素，遺傳等。該疾病也是美容皮膚科治療的重點和難點之一。目前點陣激光是皮膚美容醫(yī)學(xué)研究的熱點，有學(xué)者應(yīng)用點陣激光治療黃褐斑取得了良好的療效，但也有學(xué)者質(zhì)疑其效果，同時對于點陣激光治療黃褐斑的機(jī)制并不清楚。近來，有研究顯示c-kit與黑素合成關(guān)系密切，并發(fā)現(xiàn)c-kit在許多色素性疾病中表達(dá)明顯增高，通過與其配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）的結(jié)合，使黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的表達(dá)增加、活性增強(qiáng)，黑素合成增加。

筆者應(yīng)用雌激素與UVB聯(lián)合刺激白色小鼠建立黃褐斑動物模型，并應(yīng)用點陣激光干預(yù)，檢測治療后c-kit表達(dá)的變化并與未干預(yù)組對比，以期了解點陣激光治療對病損皮膚c-kit表達(dá)的影響。

1 資料和方法

1.1 動物模型制作、取材與干預(yù)

選取健康成年雌性白色小鼠25只，通過對實驗小鼠進(jìn)行紫外線背部特定部位祛毛后照射、注射黃體酮和慢性應(yīng)激抑郁刺激法綜合作用建立小鼠黃褐斑實驗動物模型，其中5只對照背部左右側(cè)造模前后均取材。其余20只以低能量點陣CO²激光治療左側(cè)皮損區(qū)，取對側(cè)作為對照，激光干預(yù)后背部兩側(cè)每日外用四環(huán)素油膏l(xiāng)Od，4次/d，術(shù)后3周殺死所有小鼠，取背部皮損區(qū)標(biāo)本。

1.2 設(shè)備與參數(shù)

美國科醫(yī)人公司生產(chǎn)Encore ActiveFX^TM CO²點陣激光設(shè)備，參數(shù)：30mJ/c㎡，40HZ，1-3-3，CPG模式。

1.3 免疫組織化學(xué)染色觀察

所有標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定、脫水、包埋后，4μm厚石蠟切片，60℃烤片4-8h，石蠟切片脫蠟至水，加入0.Olmmol/l pH6.O檸檬酸緩沖液，微波處理lOmin，2次；蒸餾水洗，浸入PBS液中5min，3%H₂O₂阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。每張切片加入兔抗鼠單克隆c-kit抗體，1：100稀釋，4℃孵育過夜，PBS沖洗，5mln 3次，加入PV-6000通用型免疫組化二步法檢測試劑盒，37℃孵育20min，PBS沖洗，5min 3次，然后將切片置于AEC顯色液中顯色20min；蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染5s，水溶性封片劑封片。應(yīng)用PBS替代兔抗鼠c-kit抗體作陰性對照。

按照曹芳等的方法：采用MioAS醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)切片行定量分析。c-kit陽性產(chǎn)物位于胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃色、棕黃色、棕褐色顆粒均為陽性表達(dá)。MioAS在光鏡400倍，電壓3.66V、電流2.27A條件下，每張切片隨機(jī)選取3個高倍視野，每個視野必須包括表皮全層與部分真皮，并將胞漿內(nèi)或ECM出現(xiàn)淡黃色顆粒時界定為陽性染色強(qiáng)度（optical，density，OD）為1，此為OD低限，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色、棕褐色等染色顆粒時，計算機(jī)以O(shè)D為1時的染色強(qiáng)度為參照，測量出相應(yīng)的OD值。同時將每個高倍視野而積劃分為35.1萬個像素點，1個像素點=0.039μ㎡，陽性染色而積（positive area，PA）以像素點表示。計算免疫組織化學(xué)陽性染色指數(shù)（positive index，PI），PI=PA×OD，每組示蹤結(jié)果重復(fù)3次，取PI平均值作為c-kit的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對t檢驗，P

2 結(jié)果

從切片與檢測結(jié)果來看c-kit在未造模的正常白色小鼠上皮中表達(dá)較少，在大部分黃褐斑小鼠模型上皮中呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖1）。點陣激光干預(yù)后，干預(yù)側(cè)較未干預(yù)側(cè)PI值明顯降低，表示c-kit表達(dá)明顯降低，PO.05。

3 討論

黃褐斑是皮膚美容醫(yī)學(xué)的難題，是多因素作用的結(jié)果，既往學(xué)者應(yīng)用注射黃體酮或紫外線照射等方式來造模，這些造模方法只是單一的反應(yīng)黃褐斑疾病的一種狀態(tài)，近來已有學(xué)者開始應(yīng)用多種干擾因素開始造模并獲得成功，筆者應(yīng)用此種因素制作黃褐斑模型較能正確反映黃褐斑的病理生理狀態(tài)。

2004年Imokawa等提出皮膚黑色素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子并構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)，互相協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)黑素顆粒的合成、成熟及轉(zhuǎn)運等。干細(xì)胞因子（SCF）和其配體c-kit就是一對重要的細(xì)胞因子。SCF發(fā)揮作用需依賴于特定的配體（c-kit）形成配基受體二聚體復(fù)合物，從而啟動相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的各種生物學(xué)行為。c-kit作為III型跨膜蛋白酪氨酸激酶受體蛋白家族成員之一，已發(fā)現(xiàn)其在黑色素生成、造血、肥大細(xì)胞發(fā)育及功能等方面均發(fā)揮著重要的作用。皮膚中SCF和c-kit主要由角質(zhì)形成細(xì)胞與成纖維細(xì)胞分泌，SCF與其配體c-kit結(jié)合后，后者能迅速催化自身磷酸化，促進(jìn)配基受體二聚物的形成，并磷酸化胞漿內(nèi)信號分子，依次激活酪氨酸激酶、酪氨酸酶，轉(zhuǎn)化酪氨酸為黑色素。

研究證實SCF/KIT途徑在維持黑色素細(xì)胞的存活、誘導(dǎo)遷移、調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的增殖與黑色顆粒的合成中起了極為關(guān)鍵的作用。Kang等認(rèn)為：黃褐斑病損皮膚組織中SCF（干細(xì)胞因子）和其配體c-kit的高表達(dá)是導(dǎo)致色素沉著的重要因素。李菲等在比較了黃褐斑、黑變病和炎癥后色素沉著皮損中c-kit受體的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)黃褐斑中c-kit受體的表達(dá)較另兩組顯著增高，并認(rèn)為c-kit受體可能在黃褐斑的色素沉著中起著重要的調(diào)控作用。

隨著點陣激光應(yīng)用的擴(kuò)展，許多學(xué)者應(yīng)用其治療黃褐斑取得了良好的療效。2005年Tannous報道應(yīng)用1550nm點陣激光治療多種治療抵抗的混合型黃褐斑患者，治療了2次，間隔3周，在隨后的6個月隨訪中，見色素明顯減退，而且無明顯副作用。爾后，又不斷有學(xué)者報道應(yīng)用點陣激光治療黃褐斑患者獲得了較好的療效。為進(jìn)一步證實點陣激光的治療效果，Goldberg等在治療前及治療后3個月取活檢，光鏡顯示治療后組織內(nèi)色素細(xì)胞數(shù)量相對降低，電鏡顯示在角質(zhì)形成細(xì)胞周圍色素細(xì)胞數(shù)量減少及黑素顆粒相對減少，Goldberg認(rèn)為可能與點陣激光改變組織的超微結(jié)構(gòu)有關(guān)。其具體機(jī)制尚待研究。

激光治療皮膚色素疾病時，高流量能直接汽化和剝脫病損組織，且治療深度深，可能刺激皮膚色素細(xì)胞，導(dǎo)致明顯的皮膚色素沉著反應(yīng)，使色斑加深。激光在能量較低時有其光化學(xué)效應(yīng)或生物學(xué)效應(yīng)，對組織細(xì)胞產(chǎn)生一定影響。點陣激光以其特有的隨機(jī)點狀治療模式，可以最大限度的減少激光光斑對周圍組織熱損傷，且治療部位保留部分原有組織，“橋”狀愈合模式縮短了治療后恢復(fù)時間。有學(xué)者應(yīng)用點陣激光高能量剝脫治療黃褐斑后，其即時效果明顯，但在治療后3-6周，所有病例均出現(xiàn)暫時性炎癥后色素沉著，同時部分病例伴發(fā)持久性紅斑，提示點陣激光治療黃褐斑的流量需要控制，避免出現(xiàn)明顯剝脫效果。同時研究采用的為白色雌性小鼠，皮膚較人類薄，故本研究應(yīng)用的點陣CO₂激光流量為30mJ/c㎡，較低能量治療，應(yīng)用CPG（電腦圖形生成系統(tǒng)）模式，點狀散在治療，中間保留部分原有組織，能有效縮短愈合時間。

筆者觀察到點陣CO₂激光治療后皮損中c-kit表達(dá)明顯降低，未干預(yù)組皮損中c-kit降低緩慢，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)意義；同時治療后的黃褐斑模型比未治療的色素減輕，提示點陣CO₂激光在可能通過某一途徑減少或抑制c-kit表達(dá)，達(dá)到治療黃褐斑的目的，其具體機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。