胡玉婷，江　河，潘庭雙，凌　俊，段國慶（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，合肥　230031）

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基于線粒體COI序列探討安徽長江流域黃鱔群體遺傳分化

胡玉婷，江河*，潘庭雙，凌俊，段國慶
（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，合肥230031）

摘要：探討安徽長江流域黃鱔群體遺傳結(jié)構(gòu)，采用線粒體COI的DNA條形碼序列研究該區(qū)6個(gè)黃鱔野生群體（當(dāng)涂、無為、繁昌、貴池、懷寧和望江）遺傳分化。180個(gè)樣本COI片段（665 bp）中共檢出52個(gè)變異位點(diǎn)（變異率7.8%）、40種單倍型。序列中A、T、G、C堿基平均含量分別為24.7%、28.2%、17.1%、30.0%，A+T含量大于G+C含量。AMOVA分析中，高達(dá)68.45%遺傳變異來自群體間，說明黃鱔群體間已產(chǎn)生顯著遺傳分化。群體間系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：6個(gè)群體形成兩大類群（當(dāng)涂和繁昌群體為一類群，其余群體為另一類群），分析表明結(jié)果與各群體地理位置密切相關(guān)。同時(shí)由NCBI下載合鰓魚科幾個(gè)物種的COI同源序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，顯示黃鱔與同屬的山黃鱔聚為一支，并與不同屬的合鰓魚和穴棲蛇胸鱔聚為一支。研究表明，基于COI的DNA條形碼序列適于黃鱔群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。

關(guān)鍵詞：黃鱔；COI條形碼；遺傳分化；長江

胡玉婷,江河,潘庭雙,等.基于線粒體COI序列探討安徽長江流域黃鱔群體遺傳分化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 47(2): 74-80. Hu Yuting, Jiang He, Pan Tingshuang, et al. Genetic differentiation of Monopterus albus populations from Anhui Province in Yangtze River basin based on mitochondrial COI barcode sequence[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47 (2): 74-80. (in Chinese with English abstract)

黃鱔（Monopterus albus）隸屬合鰓魚目（Synbranchiformes）合鰓魚科（Synbranchidae）黃鱔屬，適宜生長在泥塘、溝渠和稻田等緩流淺水中，廣泛分布于我國中東部地區(qū)淡水水域。黃鱔具有重要營養(yǎng)和藥用價(jià)值，市場需求大，是我國重要淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一，人工養(yǎng)殖已在長江中下游地區(qū)廣泛開展。段國慶研究表明，隨養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大和環(huán)境污染加劇，黃鱔野生資源越來越少，且出現(xiàn)種質(zhì)退化和遺傳多樣性降低等問題[1]。

賀順連研究表明，由于我國各地黃鱔相互流通，東南亞黃鱔及山黃鱔Monopterus cuchia、穴黃鱔Monopterus fossorius涌入我國[2]，加劇本土黃鱔種質(zhì)污染風(fēng)險(xiǎn)。目前，通過我國黃鱔不同地理群體RAPD、微衛(wèi)星和線粒體序列（Cytb、D-loop）等遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)我國黃鱔形成遺傳變異不同的地方群體，在一些小尺度區(qū)域內(nèi)存在較大遺傳差異[3-7]，顯示我國黃鱔群體具有較高遺傳多樣性和較大遺傳分化。目前尚無采用線粒體COI序列研究黃鱔群體遺傳結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道。

線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（Cytochrome c oxidase subunit I，COI）基因具有引物通用性高、長度適宜、進(jìn)化速率適中等特點(diǎn)，既可作為動(dòng)物種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記[8-12]，又可廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究，是理想的動(dòng)物DNA條形碼[13-14]。研究采集安徽長江流域6個(gè)地理群體的黃鱔，通過COI基因DNA條形碼序列分析，探討黃鱔群體間遺傳分化水平，可為豐富黃鱔遺傳結(jié)構(gòu)研究內(nèi)容、黃鱔種質(zhì)資源保護(hù)和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用野生黃鱔樣品分別采集于安徽長江流域6個(gè)群體（當(dāng)涂縣31.45°N、118.61°E；無為縣31.18°N、117.99°E；繁昌縣31.02°N、118.32°E；貴池縣30.77°N、117.64°E；懷寧縣30.72°N、116.96°E和望江縣30.40°N、116.83°E），各30尾。樣品采集后活體運(yùn)回，立即解剖取其背部肌肉保存于無水乙醇中備用。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

采用天根生化科技（北京）有限公司動(dòng)物基因組提取試劑盒，按照說明書提取黃鱔基因組DNA。下載NCBI中黃鱔線粒體基因組序列（登錄號：NC003192），Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)COI擴(kuò)增引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

引物序列為MF1：AACCACAAAGACATTG GCACC；MR1：CCAAAGCCTGGAAGAATCAAG。反應(yīng)體系總體積50 μL，其中：10×PCR Buffer （MgCl2）5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 4.0 μL，10 mmol·L-1引物各1.5 μL，50 ng·L-1模板DNA 2 μL，5 U·μL-1的Taq DNA酶0.3 μL，滅菌超純水35.7 μL。上述試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、52℃退火35 s、72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生物公司純化并采用ABI3730XL測序儀雙向測序，測序引物為MF1和MR1。

1.2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Clustal X[15]和Seaview[16]軟件排序并輔以人工校正。采用DNAsp 5.0[17]軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)和單倍型數(shù)目、單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）。使用Mega 4.0[18]軟件計(jì)算序列堿基組成、變異率、群體和個(gè)體間平均遺傳距離（Kumara2-parameter距離模型）并構(gòu)建相關(guān)分子系統(tǒng)樹。軟件Network 4.600（http:// www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm）繪制單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖。由Arlequin 3.5軟件[19]計(jì)算群體遺傳分化系數(shù)（F-statistics，F(xiàn)st）和分子變異分析（Analysis of molecular variance，AMOVA），并用排列測驗(yàn)法（Permutation test）檢驗(yàn)Fst的顯著性水平（重復(fù)1 000次）。

2結(jié)果與分析

2.1序列變異分析

經(jīng)比對排序后，獲得黃鱔線粒體COI同源序列665 bp，未發(fā)現(xiàn)堿基插入和缺失。其中，有變異位點(diǎn)52個(gè)（變異率7.8%），包括簡約信息位點(diǎn)42個(gè)，單突變位點(diǎn)10個(gè)。平均A、T、G、C含量分別為24.7%、28.2%、17.1%和30.0%，A+T含量較高（52.9%），G+C含量（47.1%）較低，表現(xiàn)出較為明顯的堿基組成偏倚性。序列變異主要發(fā)生在三聯(lián)密碼子的第3個(gè)堿基上，符合蛋白質(zhì)編碼基因第3位點(diǎn)進(jìn)化最快一般規(guī)律。4種堿基在密碼子第1、2、3位點(diǎn)的平均含量具有較大差異，密碼子第3位點(diǎn)上G含量偏低尤為明顯。

6個(gè)群體共180條COI序列有40種單倍型（見表1），單倍型間最大變異率為4.06%。各群體單倍型差異較大，各群體獨(dú)有單倍型較多（29個(gè)），其中僅包含1個(gè)樣品的單倍型19個(gè)。群體間共享單倍型僅11個(gè)，單倍型Hap4為5個(gè)群體共有，分布最廣泛，包含43個(gè)個(gè)體（出現(xiàn)頻率23.9%）；另有2種單倍型（Hap5，Hap12）為3個(gè)群體共有、8個(gè)單倍型（Hap2-3，10，13，15，27-28，31）為2個(gè)群體共有。繁昌與其他群體間均無共享單倍型。

表1黃鱔COI基因單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹及在不同群體中的分布Table 1 NJ-tree of and distributions of haplotypes of M. albus based on COI sequences

黃鱔單倍型在群體間分布和簡約進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖分別見表1、圖1。結(jié)果顯示：黃鱔單倍型的群體分布非隨機(jī)，存在一定地理結(jié)構(gòu)，形成兩大類群：類群I主要包括當(dāng)涂、繁昌群體，且各自有一定獨(dú)立性；其余群體組成類群II，其中懷寧群體主要介于其他三群體與類群I之間。黃鱔單倍型分子系統(tǒng)樹顯示40種單倍型屬于兩遺傳譜系（見表1），兩譜系單倍型間的最小堿基變異數(shù)為11個(gè)，序列差異率為1.65%（見圖1），最小遺傳距離為0.01994；兩譜系單倍型間最大遺傳距離為0.04054。

黃鱔各群體單倍型多樣性普遍較高（0.352~ 0.867），而所有群體核苷酸多樣性則偏低（0.00126~ 0.01321）。其中，無為（WW）群體單倍型多樣性最高；當(dāng)涂群體核苷酸多樣性最高；繁昌（FC）群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性均最低（見表2）。

圖1基于線粒體COI序列的黃鱔單倍型簡約進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)Fig. 1 Statistical parsimony network of M. albus haplotypes based on mtDNA COI sequences

表2黃鱔群體遺傳多樣性參數(shù)Table 2　 Parameter of genetic diversity of M. albus populations based on COI sequences

2.2群體遺傳結(jié)構(gòu)與分化

黃鱔群體間K-2P遺傳距離見表3。群體間平均遺傳距離較大（0.00268~0.03027），其中繁昌群體與所有群體間的遺傳距離均較大（0.01519~0.03027），其中繁昌與望江群體間遺傳距離最大。由于不同群體間遺傳距離反映遺傳組成分化程度，上述結(jié)果顯示黃鱔群體間存在較高遺傳差異。群體間遺傳分化系數(shù)Fst值顯示（見表3）：除三對群體間（GC、WW、WJ），其他群體間Fst值（0.359~0.926）均明顯大于0.05，且有極顯著差異（P<0.001）。

分子變異分析（AMOVA）結(jié)果顯示：來自群體間遺傳變異高達(dá)68.45%，群體內(nèi)變異為31.55%（P< 0.001），表明黃鱔6個(gè)群體間產(chǎn)生明顯遺傳分化（見表4）。

表3黃鱔群體間遺傳距離（對角線上）和遺傳分化系數(shù)Fst值（對角線下）Table 3　 Paired genetic distances between populations (above diagonal) and genetic differentiation index (Fst) (below diagonal) of M. albus based on COI sequences

表4黃鱔群體間分子變異分析（AMOVA）Table 4　 Analysis of molecular variance (AMOVA) among populations of M. albus

以群體間K-2P遺傳距離矩陣構(gòu)建的群體間系統(tǒng)樹（NJ tree）如圖2，與單倍型系統(tǒng)樹、單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果一致：黃鱔6個(gè)地理群體聚為兩大進(jìn)化枝，而當(dāng)涂（DT）、繁昌（FC）和懷寧（HN）群體在各自進(jìn)化枝內(nèi)具一定的獨(dú)立性。

圖2基于線粒體COI條形碼序列的黃鱔群體間系統(tǒng)樹Fig. 2 NJ tree of M. albus populations based on K-2P distances

2.3合鰓魚科系統(tǒng)發(fā)育分析從NCBI下載合鰓魚科三屬三種的線粒體COI序列，即黃鱔屬山黃鱔（Monopterus cuchia）、蛇胸鱔屬穴棲蛇胸鱔（Ophisternon aenigmaticum）和合鰓魚屬合鰓魚（Synbranchus marmoratus），登錄號分別為：FJ459509、EU751878、AP004439。結(jié)合上文

中黃鱔COI同源序列片段，采用MEGA4.0軟件K-2P模型計(jì)算4種黃鱔間平均遺傳距離（見表5）。

基于表5遺傳距離構(gòu)建合鰓魚科間4種魚類的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ法）（見圖3）。分子系統(tǒng)樹顯示，黃鱔與同屬的山黃鱔聚為一支，并與穴棲蛇胸鱔和合鰓魚聚為一支。

表5 4種合鰓魚科魚類平均遺傳距離Table 5　 Average genetic distance among four Synbranchidae fishes in the study

圖3合鰓魚科4種魚類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Molecular phylogenetic tree (NJ-tree) of four Synbranchidae fishes based on COI sequences

3討論與結(jié)論

3.1黃鱔群體遺傳分化

遺傳分化系數(shù)（Fst）是表觀群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)，F(xiàn)st值越大群體間分化程度越高，F(xiàn)st=0~0.05時(shí)為無分化，0.05~0.15為中度分化，0.15~0.25為高度分化[20]。本研究中6個(gè)群體間總Fst值為0.6845，表明黃鱔群體間存在顯著遺傳分化。由圖1可見，6個(gè)黃鱔群體分為兩大類群，其中類群Ⅰ兩群體間Fst=0.511；類群Ⅱ僅懷寧群體與其他三群體間有遺傳分化，即Fst值（0.359、0.476、0.513）大于0.05。單倍型分子系統(tǒng)樹中40種單倍型分屬于兩遺傳譜系，構(gòu)成兩類群間主要遺傳差異，其中兩譜系單倍型間最小序列差異率為1.65%，最大高達(dá)4.06%。兩譜系單倍型間最小遺傳距離0.01994、最大遺傳距離0.04054，而6個(gè)群體兩兩間平均遺傳距離為0.00268~0.03027。均高于一般淡水魚類COI序列的地理群體間遺傳差異，甚至高于一些魚類近緣種間的COI差異[21-23]。如毛云濤等選擇線粒體COI基因作為分子標(biāo)記研究沙鰍亞科魚類（Botiinae）的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[24]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙鰍亞科魚類種內(nèi)平均遺傳距離為0.002±0.000，種間平均遺傳距離為0.148±0.008。說明該區(qū)黃鱔具有較高的遺傳異質(zhì)性。

群體分化是物種分化的初期表現(xiàn)，研究群體分化對于理解物種分化過程與機(jī)制具有重要作用。隔離是群體分化重要影響因素之一。研究中6個(gè)黃鱔群體間地理距離比較短，通過長江及其支流相通，顯示遺傳差異大，與各群體所處小流域有關(guān)。類群Ⅰ中兩群體分屬于長江南岸支流青衣江和漳河，而類群2則距長江干流較近（除懷寧群體外其余3群體的具體采樣地均距長江干流< 5 km），除貴池外均位于長江北岸（貴池采樣點(diǎn)距長江干流直線距離<1 km），由于懷寧群體采樣地距長江干流較遠(yuǎn)（>20 km）、受菜子河水系影響且地處其余3群體中間位置，形成既與其他三群體遺傳距離較近又有區(qū)別的遺傳分布格局。由于黃鱔營穴居性生活、遷移能力較弱，致使不同群體間難以基因交流，長期地理隔離導(dǎo)致黃鱔群體間積累較大遺傳差異，形成顯著遺傳分化。

3.2 COI基因適于黃鱔群體遺傳學(xué)研究

線粒體基因組不同區(qū)域進(jìn)化速率存在差異，遺傳變異分析能力也不同，因此適合不同水平的進(jìn)化研究。COI基因是魚類線粒體13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一，具中度保守性，既能保證足夠變異又易被通用引物擴(kuò)增，且基本不存在插入與缺失。許多研究表明，COI基因一般適于研究魚類種間及種以上階元的分析，作為DNA條形碼廣泛用于種屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和物種鑒定[11-12, 21-24]。但在一些魚類類群中COI序列也可為同種種群間遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析提供信息[13, 25-26]。

就種下水平研究而言，COI基因蘊(yùn)含的信息量通常小于線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)。文中測序結(jié)果顯示黃鱔Cytb基因變異率僅約為COI基因的1.2倍[7]，表明COI序列較適合黃鱔群體水平的遺傳研究。劉連為等基于線粒體COI和Cytb基因序列研究北太平洋柔魚種群遺傳結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示[27]，其Cytb變異率是COI的1.6倍；而太湖新銀魚Cytb基因的變異率約為COI基因的3倍[25]。利用線粒體COI序列檢測到的魚類群體遺傳多樣性水平顯著高于基于線粒體Cytb的序列分析結(jié)果，原因是不同物種的線粒體同一區(qū)域進(jìn)化速度不同，由于選擇COI和Cytb序列為部分序列，而同一基因序列內(nèi)不同片段的進(jìn)化速率存在差異，因此同一基因的片段大小及位置影響變異率的檢測。由于所選分子標(biāo)記不同導(dǎo)致檢測多樣性水平不同，影響魚類種質(zhì)資源狀況評價(jià)準(zhǔn)確性。因此，研究比較選擇線粒體DNA不同區(qū)域多個(gè)基因，反映遺傳差異水平。

合鰓魚科3屬4種魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，4種魚類間的遺傳距離為0.1833~0.2783，可見其間遺傳距離較小。其中，同屬的黃鱔與山黃鱔、穴棲蛇胸鱔和合鰓魚分別聚為一支，然后兩屬魚類再聚為一支。但黃鱔與山黃鱔間遺傳距離卻最大（0.2783），大于各自與其他兩屬魚類的遺傳距離，即出現(xiàn)種間遺傳距離大于屬間遺傳距離現(xiàn)象。這說明合鰓魚屬與穴棲蛇胸鱔屬間的親緣關(guān)系很近，而黃鱔屬魚類遺傳變異大。由于僅選擇一個(gè)基因、少數(shù)個(gè)體難以反映真正的遺傳關(guān)系，其真實(shí)親緣關(guān)系尚需結(jié)合更多分子標(biāo)記、樣本和群體開展深入研究。

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Genetic differentiation of Monopterus albus populations from Anhui Province in Yangtze River basin based on mitochondrial COI barcode sequence

HU Yuting, JIANG He, PAN Tingshuang, LING Jun, DUAN Guoqing(Fisheries Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, China)

Abstract:In the study, partial sequences of the mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit I gene (COI) of six Monopterus albus populations, which were collected from Yangtze River basin in Anhui Province, were amplified by PCR to explore genetic differentiation. The length of COI sequences of 180 M. albus individuals were all 665 bp, 40 haplotypes were identified and 52 mutation sites were detected. The nucleotide composition of A, T, G, C was 24.7%, 28.2%, 17.1%, 30.0%, respectively; A+T content was higher than G+C content. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) indicated significant genetic differentiation among populations. The six populations could be divided into two groups based on the genetic distance and phylogenetic analysis of COI sequences, which were closely related to geographical location of each population. The molecular phylogenetic tree (NJ-tree) of Synbranchidae showed that M. albus were more closely related to Monopterus cuchia than Ophisternon aenigmaticuma and Synbranchus marmoratus. The results indicated that mitochondrial COI barcode sequence wasbook=75,ebook=80suited for the study of population genetics study.

Key words:Monopterus albus; COI barcode; genetic differentiation; Yangtze River

*通訊作者：江河，教授級高級工程師，研究方向?yàn)榈a(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail: hfjianghe@sohu. com

作者簡介：胡玉婷（1986-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)轸~類生態(tài)學(xué)。E-mail: huyuting1021@126. com

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003076）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目（13B0529）；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃鱔創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（12c0501）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（12010302056）

收稿日期：2015-08-11

中圖分類號：S917.4；Q347

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）02-0074-07