李若林，李衍芳，劉 芳，楊 文，逯冉冉，鐘珊珊，朱 喆，王小倩，俞英欣，任 明，戚曉昆

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復方曲肽對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

李若林，李衍芳，劉 芳，楊 文，逯冉冉，鐘珊珊，朱 喆，王小倩，俞英欣，任 明，戚曉昆

[摘要]目的 研究復方曲肽對大鼠缺血再灌注損傷的保護作用。方法 將雄性SD大鼠隨機分為正常對照(normal control，NC)組、大腦中動脈閉塞再灌注(middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCAO/R)組及MCAO/R+復方曲肽[MCAO/R+(troxerutin and cerebroprotein，TC)]組3組(每組10只)。缺血1 h再灌注23 h后，各組取6只動物接受神經(jīng)功能評分后進行MRI檢查，隨后處死行2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色檢測腦梗死體積；各組另4只動物處死，免疫蛋白印跡檢測缺血半暗帶中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase 1)、Caspase 3及Caspase 8的表達。結果 MCAO/R組術后動物均出現(xiàn)了腦梗死病灶及神經(jīng)功能的損傷，復方曲肽治療可減小腦梗死體積并改善神經(jīng)功能。MCAO/R組缺血半暗帶中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達顯著高于NC組(P＜0.05)，MCAO/R+TC組Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達低于MCAO/R組(P＜0.05)。結論 復方曲肽對缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，其機制與復方曲肽抑制細胞凋亡相關基因表達從而達到抗凋亡作用有關。

[關鍵詞]腦缺血；復方曲肽；細胞凋亡；2，3，5-三苯基氯化四氮唑

[作者單位]261053山東濰坊，濰坊醫(yī)學院(李若林，李衍芳，劉 芳，楊 文，逯冉冉，鐘珊珊，朱 喆，王小倩)；100048北京，海軍總醫(yī)院神經(jīng)內科(俞英欣，任 明，戚曉昆)

急性缺血性卒中是臨床上常見病、多發(fā)病。其患病率、病死率、致殘率非常高，嚴重影響患者的生活質量[1]。盡管對其損傷機制的研究很多，但缺血再灌注性腦損傷的機制仍有爭議。研究表明，細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷關系密切，是在基因調控下通過多種復雜途徑介導完成的[2]，且在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。復方曲肽注射液是由曲克蘆丁、活性多肽、多種氨基酸及神經(jīng)節(jié)苷脂組成的復方制劑。曲克蘆丁具有抑制紅細胞和凝血因子聚集的作用，防止血栓形成，同時能增加血中氧的含量，改善微循環(huán)[4]；多肽和氨基酸物質能夠促進腦內蛋白的合成，改善神經(jīng)元物質代謝，起到營養(yǎng)和保護神經(jīng)的作用[5-6]。但其腦保護作用是否與其抑制腦缺血后的神經(jīng)細胞凋亡有關鮮見報道。

本實驗在構建大鼠大腦中動脈閉塞再灌注(middle cerebralarteryocclusion reperfusion，MCAO/R)模型的基礎上，采用神經(jīng)行為學評分、MRI、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色、免疫印跡方法，觀察復方曲肽對MCAO/R大鼠神經(jīng)行為學、腦梗死體積、凋亡因子表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性清潔級SD大鼠30只[青島大任富城畜牧公司，SCXK-(魯)-2014-0007]，體質量220～250 g，置于室溫(25±2)℃分籠飼養(yǎng)，均自由進食、飲水，光照∶黑暗/12 h∶12 h。

1.1.2主要試劑 TTC；兔抗半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase 1)、Caspase 3及Caspase 8(BBI生命科學有限公司)；辣根過氧化物酶-羊抗兔二抗(武漢博士德生物有限公司)；復方曲肽注射液(吉林步長制藥有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 動物隨機分為正常對照(normal control，NC)組、MCAO/R組和MCAO/R+復方曲肽(troxerutinand cerebroprptein，TC)組3組(每組10只)。10倍生理鹽水稀釋復方曲肽注射液，模型動物按2 mL/100 g腹腔注射稀釋復方曲肽注射液，大腦中動脈閉塞后同時給藥。各組取6只動物行MRI、TTC染色測量腦梗死體積，各組另4只檢測Caspase 1、Caspase 3及Caspase 8表達。

1.2.2MCAO模型制備 10%水合氯醛(0.4 mL/ 100 g)麻醉大鼠，腹面向上，頸部備皮并消毒。取頸正中切口，鈍性分離右側頸總動脈及頸內外動脈，結扎頸外動脈，動脈夾夾閉頸總動脈，于頸總動脈游離端剪一小口，并在小口下系一松結。將制備好的線栓經(jīng)該切口順頸總動脈插入，使之與頸內動脈走行平行。將線栓順頸內動脈走向，輕柔緩慢推進，感到有輕度阻力為止，進線深度1.8～2.0 cm，系緊預先打好的松結，術中保持體溫37℃，1 h后拔出線栓，恢復灌注23 h后進行其他評估，術后單獨飼養(yǎng)。

1.2.3神經(jīng)功能學評分 缺血1 h再灌注23 h后采用盲法進行神經(jīng)功能評分。依據(jù)Garcia JH評分，從大鼠自主運動、體態(tài)對稱性、前肢伸展功能、網(wǎng)屏實驗、身體雙側觸覺、雙側胡須反射6個方面評定大鼠神經(jīng)功能損傷程度，功能正常時得分最高(18 分)，功能損傷最嚴重得分最低(3分，表1)。

1.2.4MRI 神經(jīng)功能檢查結束后，各組大鼠10%水合氯醛麻醉，將大鼠頭部固定在木板上，取仰臥位，行MRI獲得缺血1 h再灌注23 h后大鼠T2加權像、T2液體衰減反轉恢復序列(fluid attenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR)和表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)。圖像處理軟件計算梗死區(qū)與對側大腦組織的信號強度比值，分析各組間的參數(shù)變化，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

1.2.5腦梗死體積 MRI后，大鼠直接斷頭取腦，TTC染色。從距額極3 mm處開始，從前往后作冠狀位連續(xù)切片，每片厚度2 mm，共6片。將大腦切片浸泡于2%的TTC溶液中，37℃恒溫避光10min，正常腦組織染為玫瑰紅色，腦梗死區(qū)不染色(白色)。將腦片浸泡于4%多聚甲醛磷酸緩沖液內，固定30 min后，腦片按腦的前后順序整齊排列，拍照保存后輸入計算機。用圖像處理軟件計算腦梗死體積，6張腦片梗死體積之和視為腦梗死體積。

表1　Garcia JH大鼠神經(jīng)功能評分標準

1.2.6Western印跡法 各組大鼠隨機取4只，10%水合氯醛深度麻醉后，斷頭處死，快速取出完整大腦，將缺血半暗帶腦組織取出，正常對照組取缺血區(qū)對應部位腦組織，分別稱重后提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法測定蛋白濃度，制備10%分離膠和5%濃縮膠，根據(jù)蛋白濃度確定上樣體積并電泳。把凝膠上蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上并將其置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉1 h后再加入一抗(Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8)孵育，4℃過夜，洗膜后加入二抗(山羊抗兔抗體)于室溫下反應2 h，洗膜后滴加電化學發(fā)光液，X線片顯影，IPP 7.0和圖像分析軟件進行灰度分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為對照。

1.3統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1腦梗死體積 缺血1 h再灌注23 h后，MCAO/ R組腦梗死體積顯著高于MCAO/R+TC組(P＜0.05，圖1、圖2)。

圖1　TTC染色腦梗死體積縮小的抽象圖

圖2　腦梗死體積變化

2.2MRI 缺血1 h再灌注23 h后MRI顯示，MCAO/ R組可見左腦出現(xiàn)高信號強度區(qū)，與周圍組織對比明顯；MCAO/R+TC組T2加權像、T2FLAIR信號強度比值降低(P＜0.05)，且ADC值升高。見圖3、圖4。

圖3　T2加權像、T2FLAIR、ADC的MRI

2.3神經(jīng)功能評分 缺血1 h再灌注23 h后，MCAO/R組神經(jīng)功能評分低于NC組(P＜0.05)，而MCAO/R+TC組神經(jīng)功能評分則高于MCAO/R組(P＜0.05)，見圖5。

2.4Western印跡法 分析缺血1 h再灌注23 h后缺血半暗帶中含Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達，結果顯示MCAO/R組缺血半暗帶中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8的表達高于NC組(P＜0.05)，而MCAO/R+TC組缺血半暗帶中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達低于MCAO/R組(P＜0.05，圖6、圖7)。

圖6　大鼠腦梗死部位組織Western印跡法分析

圖7　缺血半暗帶Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達的半定量分析

3　討論

本研究采用SD大鼠腦缺血再灌注模型，通過神經(jīng)功能評分、MRI技術、TTC染色手段，發(fā)現(xiàn)復方曲肽能減少腦梗死體積、改善大鼠神經(jīng)功能評分以及抑制腦缺血再灌注損傷誘導的神經(jīng)細胞凋亡。

大鼠神經(jīng)功能評分的改善及梗死體積的減少，可能與曲克蘆丁改善神經(jīng)元代謝，影響其呼吸鏈，激活腦內神經(jīng)遞質和酶的活性，改善腦細胞缺血狀態(tài)有關[7-8]。但本研究顯示，該藥的神經(jīng)保護作用與其對缺血再灌注損傷誘導的神經(jīng)細胞凋亡的抑制有關。本實驗結果顯示，大鼠大腦中動脈閉塞1 h再灌注23 h后，缺血腦組織Caspase 3、Caspase 8水平顯著升高，提示腦缺血再灌注損傷可強烈誘導神經(jīng)細胞凋亡。已經(jīng)有研究報道，腦缺血損傷所致的神經(jīng)細胞凋亡由Caspases激活所決定，腦缺血損傷可誘導線粒體釋放細胞色素C、凋亡誘導因子促凋亡因子，破壞電子傳遞、氧化磷酸化和ATP，激活Caspase 8，繼而激活Caspase 3，引起“瀑布式”連鎖反應，最終引起神經(jīng)細胞凋亡[9]。已有證據(jù)表明[10]，抑制Caspase 3的活化可以減輕以細胞凋亡為主要機制的缺血后細胞損害，增加存活神經(jīng)元數(shù)量，縮小腦梗死體積，并最終改善神經(jīng)功能。

另外，在神經(jīng)細胞中，Caspase 1可以通過激活Caspase 6引起細胞凋亡[11]；Caspase 1還可參與白介素(interleukin，IL)-1β及IL-18的活化，繼而誘導IL-6、IL-8的發(fā)生，從而引起細胞因子的釋放，促進組織破壞。

本實驗中，MCAO/R+TC組腦組織Caspase 1的表達較MCAO/R降低，從而證實復方曲肽注射液能夠減少缺血再灌注損傷所引起的神經(jīng)細胞凋亡。其機制可能與曲克蘆丁消除炎癥反應，減少炎癥介質的釋放，從而降低凋亡因子的表達有關。這與先前研究報道[12]的曲克蘆丁可用于治療梗死及腦血管疾病，其機制可能與其消除局部炎癥反應有關相一致。并且已有研究證實，曲克蘆丁顯著抑制血小板黏附到紅細胞，抑制血小板激活因子，保護內皮細胞而起到抗血栓的作用[13]。

本研究證實，復方曲肽注射液對腦缺血損傷所致凋亡相關基因表達有較明顯的干預作用，由于促凋亡基因活性下降，細胞凋亡受到抑制，是這種藥物發(fā)揮腦缺血損傷保護作用的途徑之一。復方曲肽注射液通過對凋亡因子的下調作用進而有效緩解腦缺血損傷所致的神經(jīng)元凋亡，該發(fā)現(xiàn)為腦缺血的臨床用藥治療提供了一定的理論依據(jù)。

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Neuroprotective effects of troxerutin and cerebroprotein against neuronal damage induced by cerebral ischem ia

LIRuolin1，LIYanfang1，LIU Fang1，YANGWen1，LU Ranran1，ZHONG Shanshan1，ZHU Zhe1，WANG Xiaoqian1，YU Yingxin2，REN Ming2，QIXiaokun2
(1.Weifang Medical University，Weifang Shandong 261053，China；2.Department of Neurology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

[Abstract]Objective To investigate the neuroprotective effects of troxerutin and cerebroprotein against neuronal damage induced by cerebral ischmia injury.M ethods Male SD rats were divided into 3 groups(n=10):normal control group(NC)，middle cerebral artery occlusion reperfusion(MCAO/R)group，MCAO/R+(troxerutin and cerebroprotein，TC)group(MCAO/R+TC). One hour after ischemia and 23 hours after reperfusion，6 rats in each group were evaluated by neural function test and magnetic resonance imaging(MRI)，and then sacrificed for determining the cerebral infarction volumewith 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining；the remaining 4 rats in each group were sacrificed，and the protein levels of Caspase 1，Caspase 3，Caspase 8 in the ischemia penumbrawere determined byWestern Blotting.Results After MCAO/R，cerebral infarction and neurological deficitweremanifested.Troxerutin and cerebroprotein was proved to be effective in improving neurological functions and decreasing infarction on MCAO/R animals.Compared with MCAO/R groups，the expression of Caspase 1，Caspase 3，Caspase 8 in NC groupswere decreased significantly(P＜0.05).Conclusion Troxerutin and cerebroprotein has protective effect against injury induced by cerebral ischemia reperfusion，which is related to their role in inhibiting the neuronal apoptosis.

[Key words]Cerebral ischemia；Troxerutin and cerebroprotein；Cell apoptosis；2，3，5-triphenyltetrazolium chloride

(收稿日期:2015-12-26 本文編輯:馮 博)

[通訊作者]戚曉昆，E-mail:bjqxk@sina.com

doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2016.01.003

[中圖分類號]R743.31

[文獻標志碼]A

[文章編號]2095-3097(2016)01-0009-05