陳澤斌，鄭 旴，夏體淵*，李 冰，徐勝光，任 禛，張永福，牛燕芬

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；3.中國科學(xué)院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

餐廚垃圾降解細(xì)菌的Biology鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

陳澤斌1,2，鄭 旴1*，夏體淵1**，李 冰3，徐勝光1，任 禛1，張永福1，牛燕芬1

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；3.中國科學(xué)院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

采用Biology和16S rDNA序列分析法對2株餐廚垃圾降解細(xì)菌進行了鑒定。菌株經(jīng)純化培養(yǎng)，提取基因組DNA，采用16S rDNA通用引物，進行了16S rDNA序列PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后進行測序，序列經(jīng)人工校對后用Megalign 7.0軟件進行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明C95可能歸屬于蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)或寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，C132歸屬于Pseudomonasputida。用Biology微生物鑒定系統(tǒng)進行了鑒定，確定C95為Ochrobactrumgrignonense，C132為Pseudomonasputida。

餐廚垃圾；降解；細(xì)菌；Biolog鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析

餐廚垃圾是指賓館飯店等餐飲業(yè)單位和企事業(yè)單位食堂以及家庭生活在食物加工和用餐過程中產(chǎn)生的食物下料和剩余食物，它是目前城市生活垃圾的主要來源，在有些城市餐廚垃圾的比例甚至高達50 %以上[1-4]。以上海為例，每天產(chǎn)生的餐廚垃圾約達1100 t，在春節(jié)期間至少還要增加50 %以上。目前餐廚垃圾的處理，主要采用填埋、焚燒、堆肥、熱解、蚯蚓床法處理，都不夠安全有效，在應(yīng)用中也存在各自的局限性[5-6]。對于如何安全有效地處理餐廚垃圾，少數(shù)發(fā)達的大城市已經(jīng)引起了足夠的重視，從環(huán)保和資源化的觀點出發(fā)，利用生物技術(shù)處理城市生活垃圾正漸漸受到了人們的青睞。

好氧降解是在通氣的條件下，以好氧微生物為主將大分子的餐廚垃圾分解為小分子的有機物，微生物吸收、利用中間的代謝產(chǎn)物合成自身的細(xì)胞物質(zhì)，生長繁殖[7-10]。垃圾中微生物種群極其豐富，尤其是含有大量對難降解污染物具有強烈降解作用的降解型微生物，是優(yōu)良的生物處理載體和復(fù)雜生物處理菌種的來源。人們已從垃圾填埋場中分離出高效纖維素分解菌、能降解DBP的菌株、具有明顯除臭效果的菌株等[11-12]。

前期研究以昆明學(xué)院潤澤苑教工餐廳的餐廚垃圾為對象，對餐廚垃圾的各組分進行了研究，采用多種培養(yǎng)基廣泛分離菌種，選取與餐廚垃圾各營養(yǎng)成分對應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基，進行定性初篩和定量復(fù)篩，通過測定液體培養(yǎng)48 h后的菌懸液OD600值比較其對蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、纖維素的分解能力，得到了2株有效降解細(xì)菌株。接下來降解細(xì)菌的鑒定工作是今后進行擴大化培養(yǎng)的必要前提。細(xì)菌的常規(guī)鑒定依賴于形態(tài)特征觀察及生理生化測定，雖然方法準(zhǔn)確可靠，但費時、費力?；?6S rDNA序列分析的分子生物學(xué)鑒定快速靈敏，但不能作為最終的鑒定依據(jù)，常用于目標(biāo)菌的初步檢測[13]。

Biology全自動微生物自動鑒定系統(tǒng)Gen III微孔板可以對微生物進行94種表型測試，其中包括：71 種碳源利用測試(圖3)和23種化學(xué)敏感性測試(圖3)。它主要根據(jù)四唑類氧化還原染料的色度變化來指示微生物對碳源的利用程度和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度。微生物在測試板上所顯示出的特定“表型指紋”被用來在種的水平上進行鑒定[14-15]。文章分別通過Biolog微生物鑒定系統(tǒng)及16S rDNA序列分析的方法對2株餐廚垃圾降解細(xì)菌進行了快速鑒定，以期為餐廚垃圾降解細(xì)菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

餐廚垃圾降解細(xì)菌C95和C132為2014年從昆明學(xué)院潤澤苑教工餐廳的餐廚垃圾分離篩選所得，保存于昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院植物生產(chǎn)試驗中心實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基用于供試菌株的復(fù)壯和純化培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基用于提取DNA前的液體培養(yǎng)，BUG + B培養(yǎng)基用于Biology鑒定中菌株的培養(yǎng)。

1.3 試劑和PCR引物

BUG + B培養(yǎng)基、GEN III微孔板(MicroPlate)、濁度儀、8 通道電動移液器等均購自Biology公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；Taq酶、dNTP、GoldView購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。細(xì)菌16S rDNA擴增通用引物[16]由上海桑尼生物科技有限公司合成(正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1492R:5’-AAGGAGGTGATCCACCC-3’)。

1.4 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取細(xì)菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。PCR反應(yīng)體系(50 μl)組成：10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[16](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (約50 g/L) 1μl，Taq酶2.5 U，雙蒸水35.5 μl。PCR擴增按Sambrook方法進行[17]。擴增產(chǎn)物經(jīng)TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定。將測得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)進行同源性搜索[18]，下載相似序列作為參比序列。用Megalign 7.0軟件，將這些序列用Clustal W法進行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 Biology鑒定

試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性應(yīng)用技術(shù)國家工程研究中心完成。試驗程序按Biology公司GEN III的操作指南進行[19]，所有菌株在Biology推薦的培養(yǎng)基(BUG + B)上33 ℃培養(yǎng)24 h。按照操作規(guī)程將微生物細(xì)胞濃度調(diào)至90 %～98 %(T為Biology濁度儀所測得的透光率)，將菌懸液倒入V型加樣槽中，用8通道電動移液器按每孔100 μl的量將菌懸液按順序加入微孔板的所有孔中，33 ℃黑暗培養(yǎng)，24 h后記錄結(jié)果。所有菌株均采用OmniLog讀數(shù)儀讀板，讀數(shù)結(jié)果直接與數(shù)據(jù)庫進行比較獲得鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

將C95和C132在NA培養(yǎng)基復(fù)壯純化(圖1)，挑取單菌落在LB培養(yǎng)基中28 ℃液體培養(yǎng)12 h后，分別提取細(xì)菌基因組DNA，用通用引物27F/1492R對2株細(xì)菌的16S rDNA進行PCR擴增，得到1.5 kb的PCR產(chǎn)物，送測序后，將序列提交到GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，C95和C132登錄號分別為KP771804和KP771807。將其與12個相似參比菌株的16S rDNA序列(表1)進行多重序列對齊后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)和系統(tǒng)發(fā)育進化距離圖(圖3)。結(jié)果顯示，C95與KF844052Ochrobactrumpseudogrignonense、KJ784477Stenotrophomonasmaltophilia、FJ266319Ochrobactrumanthropi、AB680343Ochrobactrumsp.聚于同一系統(tǒng)發(fā)育分支，同源性均為100.0 %；C132與FJ588702Pseudomonasfluorescens聚于同一系統(tǒng)發(fā)育分支，同源性為99.9 %。通過分子生物學(xué)方法尚無法確定C95的分類地位，C95可能歸屬于蒼白桿菌屬 (Ochrobactrum)，也可能歸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)；將C132確定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

a:C95；b:C132圖1 供試菌株在NA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征Fig.1 The morphology of strains on NA culture medium

種類Species菌株名稱Strainsname登錄號Accessionnumber國家CountryPseudomonasputidaKF715AB109776JapanPseudomonassp.BSw10041NFJ416144ChinaPseudomonasfluorescensHDY-8FJ588702ChinaOchrobactrumpseudogrignonenseNG-T7KF844052ChinaOchrobactrumsp.-AB680343JapanStenotrophomonasmaltophiliaRJ14KJ784477IndiaOchrobactrumanthropiRFNB9FJ266319KoreaOchrobactrumthiophenivoransNf17nrRHQ406743MexicoOchrobactrumgrignonenseIHBB1375GU186118IndiaOchrobactrumpituitosumSPT1-119aKF580852ChinaOchrobactrumrhizosphaeraePR17NR_042600USAOchrobactrumcytisiA6KF439830China

標(biāo)尺為核酸替換率bar-subsitutions per nucleotide position圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖3 系統(tǒng)發(fā)育進化距離Fig.3 Sequence distance based on 16S rDNA full-length sequence

2.2 Biology鑒定結(jié)果

GenIII Microplate測試布局見圖4，2株餐廚垃圾降解細(xì)菌在GenIII鑒定板上的測試表現(xiàn)見圖5。以A1孔為陰性對照對GenIII微孔板1～9列中的碳源利用情況進行測試。所有視覺上看起來與A1孔類似的反應(yīng)定義為“陰性”反應(yīng)(-)，看起來成紫色(深于A1)的定為“陽性”反應(yīng)(+)?？字兴@的顏色非常淺，或者有紫色的小色斑，或者有菌塊或其他塊狀物，則將其判定為“邊界值”()。以A-10孔為陽性對照對列10～12進行化學(xué)敏感性測試，所有顏色不到A10孔一半，且容易被該化學(xué)物質(zhì)抑制的反應(yīng)被定為“陰性”反應(yīng)(-)，顯紫色或接近紫色(與A10孔類似)的反應(yīng)被定為“陽性”反應(yīng)(+)。統(tǒng)計結(jié)果見表2。

圖4 GEN Ⅲ微孔板布局Fig.4 The layout of GenIII microplate

a-C95；b-C132圖5 供試菌株在GEN Ⅲ鑒定板上的表現(xiàn)Fig.5 The performance of strains on GenIII microplate

微孔編號MicroporeNo.碳源CarbonsourcesC95C132A1陰性對照--A2糊精+A3D-麥芽糖+-A4D-海藻糖-A5D-纖維二糖-A6龍膽二糖\A7蔗糖-A8松二糖+-A9水蘇糖-A10陽性對照++A11pH6++A12pH5-+B1蜜三糖,棉子糖-B2α-D-乳糖-B3蜜二糖\B4β-甲酰-D-葡糖苷-B5D-水楊苷-B6N-乙酰-D-葡糖胺+-B7N-乙酰-β-D-甘露糖胺-B8N-乙酰-D-半乳糖胺+-B9N-乙酰神經(jīng)氨酸-B101%NaCl++B114%NaCl++B128%NaCl--C1α-D-葡糖++C2D-甘露糖+C3D-果糖+C4D-半乳糖+C53-甲酰葡糖\C6D-果糖+C7L-果糖+C8L-鼠李糖+C9肌苷+C10乳酸鈉++C11梭鏈孢酸-+C12D-絲氨酸-+D1D-山梨醇+-D2D-甘露醇+-D3D-阿拉伯醇+-D4肌醇++D5甘油+

續(xù)表2 Continued table 2

微孔編號MicroporeNo.碳源CarbonsourcesC95C132D6D-葡糖-6-磷酸-D7D-果糖-6-磷酸\D8D-天冬氨酸-D9D-絲氨酸\D10醋竹桃霉素++D11利福霉素SV++D12二甲胺四環(huán)素--E1明膠-E2氨基乙酰-L-脯氨酸-E3L-丙氨酸++E4L-精氨酸++E5L-天冬氨酸++E6L-谷氨酸++E7L-組胺++E8L-焦谷氨酸-E9L-絲氨酸++E10林肯霉素,潔霉素++E11鹽酸胍++E12硫酸四癸鈉+F1果膠-F2D-半乳糖醛酸+F3L-半乳糖醛酸內(nèi)酯+F4D-葡糖酸+F5D-葡糖醛酸++F6葡糖醛酰胺+F7粘酸;粘液酸+F8奎寧酸+F9糖質(zhì)酸+F10萬古霉素++F11四唑紫++F12四唑藍++G1p-羥基-苯乙酸-+G2丙酮酸甲酯\G3D-乳酸甲酯-G4L-乳酸++G5檸檬酸-+G6α-酮-戊二酸++G7D-蘋果酸++G8L-蘋果酸++G9溴-丁二酸+G10萘啶酮酸-+G11氯化鋰+

續(xù)表2 Continued table 2

微孔編號MicroporeNo.碳源CarbonsourcesC95C132G12亞碲酸鉀++H1吐溫40\H2γ-氨基-丁酸++H3α-羥基-丁酸\H4β-羥基-D,L丁酸\H5α-酮-丁酸\H6乙酰乙酸+H7丙酸++H8乙酸++H9甲酸\H10氨曲南+H11丁酸鈉-H12溴酸鈉-

表3 供試菌株經(jīng)Biology GEN III 微孔板鑒定結(jié)果

2個供試菌株的Biolog鑒定結(jié)果見表3，其中相似性(SIM)和位距(DIS)是2個重要的參數(shù)，表示測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫相應(yīng)數(shù)據(jù)的匹配程度。SIM值越接近于1，鑒定結(jié)果的可靠性越強。通常在SIM值大于0.5時，就可以確定菌株的分類地位。從表3可以看出，2個供試菌株均得到了準(zhǔn)確鑒定，均為革蘭氏陰性菌，C95為Ochrobactrumgrignonense，C132為Pseudomonasputida，相似性分別為0.624和0.612。

3 討 論

采用Biolog鑒定和16S rDNA序列分析法對2株餐廚垃圾降解細(xì)菌進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)分子生物學(xué)方法有局限性，從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)來看，C95與KF844052Ochrobactrumpseudogrignonense、KJ784477Stenotrophomonasmaltophilia、FJ266319Ochrobactrumanthropi、AB680343Ochrobactrumsp.聚于同一系統(tǒng)發(fā)育分支，同源性均為100.0 %，表明通過分子生物學(xué)方法尚無法確定C95的分類地位，C95可能歸屬于蒼白桿菌屬 (Ochrobactrum)，也可能歸屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，結(jié)合Biology鑒定結(jié)果，才將C95鑒定為Ochrobactrumgrignonense。由此可見，基于16S rDNA的分子生物學(xué)鑒定方法并不能完全作為細(xì)菌鑒定的依據(jù)，還有許多細(xì)菌不能用這種方法區(qū)分開。它在屬的水平上效果是比較好的，鑒定到種還需要其他生理生化方法和寄主分析來縮小鑒定范圍。Biology 細(xì)菌鑒定系統(tǒng)可以將細(xì)菌鑒定到種的水平[20]。兩者相互驗證，互相補充。隨著Biology 數(shù)據(jù)庫的增大和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，其鑒定結(jié)果會更加簡便與準(zhǔn)確，GEN III微孔板在細(xì)菌的鑒定和分類中具有廣闊的應(yīng)用前景。

C95和C132分別歸屬于Ochrobactrumgrignonense和Pseudomonasputida2類細(xì)菌都曾被報道具有降解活性，Pseudomonasputida可降解萘、苯酚、磷[21-23]；Ochrobactrum屬細(xì)菌可降解煙堿、石油、潤滑油、苯胺、喹啉、百菌清[24-26]，其生物學(xué)特性及對溫度、pH等條件是否具有比較廣泛的適應(yīng)性將是下一步研究的重點。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Biology Identification and Phylogenetic Analysis of Efficient Bacteria for Aerobic Degradation on Kitchen Waste

CHEN Ze-bin1,2, ZHENG Xu1*, XIA Ti-yuan1**, LI Bing3, XU Sheng-guang1, REN Zhen1, ZHANG Yong-fu1, NIU Yan-fen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China;2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China;3.Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

2 strains of efficient bacteria for the aerobic degradation on kitchen waste were identified by biology microbes identification system and 16S rDNA gene sequence analysis. After the genomic DNA was extracted, the sequences of 16S rRNA gene were amplified by PCR with the bacterium universal primers and the purified PCR products were directly sequenced. The corrected sequences were aligned with Megalign 7.0 and the phylogenetic tree was constructed. The results of phylogenetic analysis showed that the C95 belonged toOchrobactrumorStenotrophomonas; C132 belonged toPseudomonasputida. The results of biology tests showed that the 2 strains wereOchrobactrumgrignonenseandPseudomonasputida,respectively.

Kitchen waste; Degradation; Bacteria; Biology identification; Phylogenetic analysis

1001-4829(2016)10-2488-08

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.043

2015-03-29

云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心項目(TSNY0201)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2014Y390)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項目(2013FD040)；昆明學(xué)院人才引進項目(YJL14005)；昆明學(xué)院人才引進基金項目(YJL12010)；昆明學(xué)院校立重點基金項目(XJL12020)；昆明學(xué)院大學(xué)生科研項目(XJD15054)；云南中煙品牌省內(nèi)原料產(chǎn)地生態(tài)與主栽品種合理布局研究項目；云南省高校優(yōu)勢特色重點學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項目資助(05000511311)；昆明市農(nóng)業(yè)局滇池流域農(nóng)業(yè)面源污染綜合防控對策研究(2016JC01)

陳澤斌(1985-)，男，云南昆明人，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物的教學(xué)及科研工作，E-mail:zbchenkmu@163.com，*為共同第一作者，**為通訊作者，E-mail:xiatiyuan@sohu.com。

S182

A