張 濤，尹亞軍，路宏朝，王 令

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

漢中黑稻黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)的遺傳變異分析

張 濤，尹亞軍，路宏朝，王 令

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR和測(cè)序拼接獲得漢中地區(qū)8個(gè)黑稻品種黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)編碼區(qū)序列,在NCBI中用BLAST分析首次發(fā)現(xiàn)該基因位于水稻4號(hào)染色體。發(fā)現(xiàn)8種黑稻和普通秈稻F3H序列完全相同,與粳稻相比較，則存在4個(gè)突變位點(diǎn)，導(dǎo)致2個(gè)氨基酸突變?；贔3H序列信息的進(jìn)化樹(shù)表明黑稻與秈稻、粳稻、小麥、玉米的親緣關(guān)系較近；遺傳距離和同源性分析表明F3H基因較為保守，是一個(gè)古老的基因，可用于種屬的鑒定分析。F3H蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),黑稻與其它禾本科植物存在一定差異，蛋白三維結(jié)構(gòu)及相關(guān)位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)粳稻和黑稻無(wú)明顯差異，初步認(rèn)為黑稻F3H序列變異可能與花青素的合成無(wú)關(guān)，需要在其表當(dāng)量與花青苷和成合成與沉積的關(guān)系方面開(kāi)展進(jìn)一步研究。

黑稻；黃烷酮3-羥化酶；序列分析；遺傳變異

水稻是主要的糧食作物，存在秈稻和粳稻2個(gè)變種，秈稻和粳稻中有部分群體的果皮層、種皮和米粒表現(xiàn)為黑色，研究發(fā)現(xiàn)黑色與花青素含量和結(jié)構(gòu)有關(guān)，這一群體被稱(chēng)為黑稻，是稻種資源庫(kù)中極具特色而又名貴的類(lèi)群[1]。由于稻米中富含天然花青素和較多的蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素，因而具有較高的營(yíng)養(yǎng)保健功能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，備受人們關(guān)注[2]。學(xué)者對(duì)于水稻中花色素苷的合成機(jī)制進(jìn)行了大量研究，以期揭示其代謝調(diào)控機(jī)理，為水稻的育種和種質(zhì)資源保護(hù)提供指導(dǎo)與借鑒[3-4]。

植物色素是天然色素主要來(lái)源，其合成機(jī)制已經(jīng)開(kāi)展了較為廣泛和深入研究，現(xiàn)有結(jié)果表明花青素合成主要通過(guò)苯丙氨酸途徑，大致可以分為3個(gè)階段：①由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA；②由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫黃酮醇；③由二氫黃酮醇到各種花青素的合成，進(jìn)一步反應(yīng)生成各種花青苷[5]。盡管有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)控制水稻種皮著色的Pb基因位于水稻第4染色體上，紫色種皮對(duì)白色種皮呈顯性[6]，但對(duì)于水稻中普通稻和黑稻之間花青素合成與沉積的分子生物學(xué)機(jī)制尚未闡述清楚，難以在育種中加以推廣應(yīng)用。

表1 F3H基因序列目錄

表2 引物序列目錄

本研究基于植物花青素合成機(jī)制的研究，選擇在花青素合成第二階段發(fā)揮作用的黃烷酮3-羥化酶(F3H，F(xiàn)lavanone 3-Hydroxylase)為靶基因，對(duì)漢中地區(qū)主要種植的8個(gè)黑稻品種進(jìn)行遺傳變異分析，研究F3H基因同時(shí)，基于該位點(diǎn)探索水稻的遺傳分化，為水稻的起源與進(jìn)化提供相關(guān)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及DNA提取

本研究以陜西漢中地區(qū)種植的黑寶(HB)，黑豐(HF)，黑帥(HS)，黑米A(HMA)，黑米B(HMB)，黑優(yōu)粘(HYZ)，培811(P811)，云黑(YH)等8個(gè)黑稻品種為材料，該8個(gè)品種均為秈稻，由陜西省水稻研究所提供。種子在調(diào)溫調(diào)濕箱中進(jìn)行萌發(fā)，取水稻其嫩葉葉尖，按照改良的CTAB法提取基因組DNA[7]。

1.2 引用序列和引物序列

由網(wǎng)站http:/ /www.ncbi.com查得不同植物F3H基因序列(表1)，通過(guò)BLAST在NCBI中檢索到粳稻的F3H序列，采用軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增F3H序列的引物(表2)，引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序

PCR反應(yīng)總體系為25 μl：10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP (10 mM)0.5 μl，上下游引物 (10 pmol)各1.2 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，DNA模板 (50 ng/μl)1.2 μl，超純水18.2 μl。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用DNAMAN對(duì)不同黑稻品種和粳稻F3H基因序列進(jìn)行拼接和比對(duì)；以不同物種F3H基因的序列信息為基本數(shù)據(jù)，通過(guò)MEGA5.0進(jìn)行了物種的聚類(lèi)分析；在www.expasy.org網(wǎng)站進(jìn)行了水稻F3H蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和理化性質(zhì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑稻F3H基因序列比對(duì)分析

本研究發(fā)現(xiàn)NCBI沒(méi)有直接標(biāo)注水稻F3H數(shù)據(jù)信息，以其他禾本科植物的F3H序列為參照，通過(guò)BLAST檢索到NCBI中粳稻4號(hào)染色體的3個(gè)外顯子序列(55313..55654，55732..56160，57637..57999，反向互補(bǔ))與禾本科F3H同源性很高，初步確定該基因?yàn)榫綟3H,同時(shí)也得到了秈稻F3H的序列。水稻F3H的編碼序列全長(zhǎng)1134 bp，其中外顯子1長(zhǎng)363 bp，外顯子2長(zhǎng)429 bp，外顯子3長(zhǎng)342 bp。基于秈稻F3H序列設(shè)計(jì)了水稻F3H擴(kuò)增的PCR引物，最終獲得了漢中地區(qū)選育、栽培的8個(gè)黑稻品種的F3H序列，8種黑稻F3H序列完全相同，以黑稻來(lái)代表8種黑稻(Br，Black rice)。通過(guò)黑稻與秈稻、粳稻的F3HmRNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，黑稻與秈稻之間無(wú)差異，與粳稻比較則存在4個(gè)變異位點(diǎn)(圖1)。這4個(gè)位點(diǎn)的變異分別為編碼區(qū)666位的T/G轉(zhuǎn)換，772位的C/G顛換，899位的T/G轉(zhuǎn)換，942位的G/A轉(zhuǎn)換(圖2)。結(jié)果表明F3H基因可以作為秈稻與粳稻亞種之間鑒定分析的一個(gè)候選基因，但是突變位點(diǎn)的變異不影響花青素的合成。

圖1 F3H序列比對(duì)Fig.1 The sequence alignment of F3H

圖2 F3H序列SNPsFig.2 The SNPs of F3H

2.2 不同物種F3H基因的聚類(lèi)分析

探索黑稻、秈稻和粳稻的起源與分化也是水稻科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題，F(xiàn)3H是一個(gè)較為保守的古老基因，其在不同物種間的遺傳變異可以作為系統(tǒng)進(jìn)化研究的一個(gè)參考位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以F3H的序列信息為基礎(chǔ)，通過(guò)近鄰相接法(NJ，neighbor-joining method)進(jìn)行8個(gè)漢中黑稻和其他物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建(圖3)，來(lái)探討以F3H序列為參考來(lái)進(jìn)行不同物種系統(tǒng)進(jìn)化研究的可行性。研究分析發(fā)現(xiàn)，漢中8個(gè)黑稻品種與秈稻聚為一類(lèi)，然后與粳稻聚為一個(gè)稻屬的大類(lèi)。稻屬植物與玉米、小麥等禾本科植物聚在一個(gè)分支，荔枝和龍眼形成一個(gè)分支，其他不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系能夠清楚區(qū)分，這一研究結(jié)果表明F3H可用以鑒定不同屬間和種間的進(jìn)化關(guān)系，但不能清楚的進(jìn)行種內(nèi)品種間的親緣關(guān)系分析。

2.3 不同植物F3H基因mRNA序列的同源性和遺傳距離比較分析

為清楚闡明黑稻、水稻與不同物種間的親緣關(guān)系，本研究計(jì)算了不同物種間的同源性和遺傳距離(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑稻與秈稻完全相同，粳稻和秈稻、黑稻的同源性為99.6 %，與禾本科的小麥﹑玉米相比，同源性分別為84.9 %、83.8 %，水稻與其他植物同源性均在66.7 %以上。水稻與小麥的遺傳距離為0.152～0.153，和玉米遺傳距離為0.162～0.163，水稻與小麥的親緣關(guān)系較玉米近一些。不同植物之間的同源性都在65.1 %(柑橘和玉米)以上,遺傳距離都在0.349(柑橘和玉米) 以內(nèi)，數(shù)據(jù)表明F3H序列相對(duì)保守，是一個(gè)比較原始的基因，對(duì)于植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必是不可少的。由于秈稻、黑稻與小麥和玉米的親緣關(guān)系相對(duì)于粳稻要稍近一些，可以基于該結(jié)果判斷秈稻和本研究的黑稻比粳稻要古老一些，更接近于水稻祖先。

圖3 基于F3H基因序列的聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis based on F3H sequence

種屬粳稻Ja秈稻In黑稻Br小麥Wh玉米Co葡萄Gr龍眼Lo荔枝Li蕎麥Bw蘋(píng)果Ap柑橘Ci粳稻Ja-99.6%99.6%84.7%83.7%71.5%71.5%69.6%69.3%68.6%66.8%秈稻In0.004-100%84.9%83.8%71.6%71.4%69.6%69.3%68.6%66.7%黑稻Br0.0040.000-84.9%83.8%71.6%71.4%69.6%69.3%68.6%66.7%小麥Wh0.1530.1510.151-84.4%70.1%70.0%68.3%67.2%67.6%65.7%玉米Co0.1630.1620.1620.156-70.8%70.6%68.9%67.9%68.4%65.1%葡萄Gr0.2850.2840.2840.2990.292-79.6%78.4%75.8%77.7%77.6%龍眼Lo0.2850.2860.2860.3000.2940.204-97.0%78.3%80.0%83.4%荔枝Li0.3040.3040.3040.3170.3110.2160.030-77.2%79.2%83.3%蕎麥Bw0.3070.3070.3070.3280.3210.2420.2170.228-74.7%75.0%蘋(píng)果Ap0.3140.3140.3140.3240.3160.2230.2000.2080.253-77.6%柑橘Ci0.3320.3330.3330.3430.3490.2240.1660.1670.2500.224-

表4 F3H蛋白理化性質(zhì)

2.4 禾本科F3H蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與功能預(yù)測(cè)分析

稻屬植物F3H由377個(gè)氨基酸組成，研究發(fā)現(xiàn)秈稻和黑稻F3H mRNA序列在編碼區(qū)有4個(gè)突變位點(diǎn)，其中722位的C/G顛換引起的第241位的丙氨酸(Ala)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，899位的T/G轉(zhuǎn)換遺傳變異引起第300位氨基酸甲硫氨酸(Met)突變?yōu)榫彼?Arg)。為了進(jìn)一步分析2個(gè)位點(diǎn)氨基酸的變化可能引起的理化性質(zhì)和功能變化，在www.expasy.org上對(duì)不同植物F3H的部分理化性質(zhì)及三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析(表4、圖4)。比較發(fā)現(xiàn)禾本科4種植物F3H蛋白為370～380個(gè)氨基酸；在理論等電點(diǎn)上，秈稻、黑稻為5.80，高于粳稻，低于小麥、玉米；總疏水性上，秈稻、黑稻低于粳稻，高于小麥、玉米；不穩(wěn)定性上，秈稻、黑稻高于粳稻，低于小麥、玉米；在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上，粳稻與秈稻和漢中黑稻無(wú)明顯差異存在。通過(guò)NetPhos2.0、NetOGlyc3.0、NetNGlyc1.0程序?qū)竞投i稻及黑稻F3H的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)、O連接糖基化位點(diǎn)、N連接糖基化位點(diǎn)均無(wú)差異。

3 討 論

花青素是一種帶有氧正離子的天然色素，具有很強(qiáng)的抗氧化性，能清除體內(nèi)積累的自由基，對(duì)很多疾病有一定的緩解作用[8]，因而備受關(guān)注。目前，關(guān)于黑稻花青素的研究主要集中在花青素的提取、功能活性及開(kāi)發(fā)利用方面[9-12]，而關(guān)于黑稻花青素合成的分子調(diào)控機(jī)制研究相對(duì)較少?；ㄇ嗨氐暮铣赏緩绞茉S多結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因影響，結(jié)構(gòu)基因主要包括苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羥化酶、查爾酮合成酶、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶、花青素合成酶等[13]。F3H在花青素合成中負(fù)責(zé)催化4,5,7-三羥基黃烷酮C3位的羥化，生成二氫黃酮醇，對(duì)花色的形成具有重要作用[14]。目前研究表明植物F3H基因均有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，編碼350～380個(gè)氨基酸[15]。已經(jīng)有學(xué)者報(bào)道一些植物中果色及花色突變體的F3H 表達(dá)水平存在差異，表明 F3H 在花青素合成代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16-17]。A.Zuker等利用反義RNA技術(shù)抑制香石竹F3H表達(dá)，使花色發(fā)生不同程度的改變，花瓣顏色變淺，甚至出現(xiàn)了白色[18]。F.Jiang等在草莓中反義抑制F3H的表達(dá)，阻斷了花青素合成，進(jìn)而影響果實(shí)中花青素積累[19]。L.Jaakola等發(fā)現(xiàn)正常藍(lán)莓成熟過(guò)程中，F(xiàn)3H大量表達(dá)，花青素含量急劇增加，果實(shí)由綠色經(jīng)紅色變成黑紫色，但在白色和紅色突變體果實(shí)中基本檢測(cè)不到F3H的表達(dá)[20]。因此，本研究以黃烷酮3-羥化酶(F3H)作為黑稻花青素合成的一個(gè)候選基因來(lái)分析，探索該基因的變異是否與黑稻中花青素沉積有一定的關(guān)系。

圖4 F3H蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three dimensional model F3H protein

由于植物體內(nèi)黃酮物質(zhì)的形成與色素的沉積是植物形成所具有的一個(gè)基本特征，所以認(rèn)為F3H基因是一個(gè)相對(duì)古老的基因，基因結(jié)構(gòu)和序列相對(duì)保守，在漫長(zhǎng)的歷史進(jìn)化中，物種遺傳分化會(huì)導(dǎo)致不同物種的F3H存在很大差異，可以作為花青苷合成和物種鑒定的一個(gè)候選基因。本實(shí)驗(yàn)首次獲得了漢中地區(qū)8個(gè)黑稻品種F3H基因mRNA序列，通過(guò)BLAST分析，將水稻F3H基因定位在4號(hào)染色體。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)黑稻品種F3H基因序列相同，且與秈稻一樣，與普通粳稻的F3H相比，存在4處突變位點(diǎn)，導(dǎo)致2處氨基酸序列改變。通過(guò)蛋白質(zhì)理化分析發(fā)現(xiàn)黑稻F3H的不穩(wěn)定性較粳稻高一些，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及磷酸化位點(diǎn)、O連接糖基化位點(diǎn)、N連接糖基化位點(diǎn)分析，兩者之間均無(wú)差異。結(jié)合其他學(xué)者關(guān)于F3H對(duì)花青素合成的研究記過(guò)，本研究認(rèn)為黑稻F3H的突變可能與酶的催化活性無(wú)關(guān)，需要進(jìn)一步研究黑稻中F3H基因表達(dá)水平對(duì)花青素合成的影響。另外，本研究基于F3H序列構(gòu)建的黑稻、秈稻、粳稻和其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明F3H基因可以作為種屬鑒定的一個(gè)候選基因，但不能準(zhǔn)確區(qū)分種內(nèi)品種間的遺傳關(guān)系。聚類(lèi)分析和遺傳距離結(jié)果發(fā)現(xiàn)秈稻、黑稻與小麥和玉米的遺傳距離稍近一點(diǎn)，可能初步判斷秈稻要比粳稻更古老一些，要確切分清兩者的進(jìn)化關(guān)系，還需擴(kuò)大范圍系統(tǒng)研究。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Genetic Variation of Flavanone 3-Hydroxylase(F3H)of Black Rice Varieties in Hanzhong

ZHANG Tao ,YIN Ya-jun, LU Hong-zhao, WANG Ling

(School of Biological Science Technology and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong Shaanxi 723100，China)

The full coding sequence of F3H was isolated from the 8 Black rice breeds in Hanzhong by PCR and sequencing. BLAST analysis found that the gene is located on the chromosome 4 of rice for the first time. The 8 black rice breeds andIndicahave the sameF3Hcoding sequence .There were 4 mutational sites betweenIndicaandJaponica, and resulting in 2 amino acid mutations. The phylogenetic tree indicated that black rice was very closely toIndica,Japonica, wheat, corn. The genetic distances and homology analysis showed that conservedF3Hgene was an ancient gene, and can be used to species identification . The physicochemical properties prediction of F3H found no significant differences between Black rice and other gramineae plants. There are no significant differences in the three dimensional structure of F3H protein and the related active site prediction of Japonica and Black rice. Therefore, it is considered that Black riceF3Hsequence variation may be unrelated to the synthesis of anthocyanins, and we need to further study on the expression level ofF3H.

Black rice; Flavanone 3-Hydroxylase; Sequence analysis; Genetic variation

1001-4829(2016)10-2257-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.001

2015-12-16

陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(2013K02-26-02)

張 濤(1978-)，男， 碩士，副教授，主要從事分子遺傳學(xué)研究，E-mail：zl780823@163.com。

S511

A