楊　勇，王中江，畢　爽，張　輝，李　楊，江連洲*（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱　5000；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江　齊齊哈爾　6006；.科技部中國農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，北京　00045）

?

深黃被孢霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸工藝研究

楊勇1, 2，王中江1，畢爽1，張輝3，李楊1，江連洲1*
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030；2.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006；3.科技部中國農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，北京100045）

摘要：在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化深黃被孢霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸工藝，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：接種量15.66%，發(fā)酵溫度28.29℃，發(fā)酵時間6.58 d，發(fā)酵pH 5.96。花生四烯酸產(chǎn)量為3.12 g·L-1，在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，可提高產(chǎn)量，同時減少接種量，縮短發(fā)酵時間，降低生產(chǎn)成本。

關(guān)鍵詞：深黃被孢霉；突變菌株；發(fā)酵；花生四烯酸

楊勇,王中江,畢爽,等.深黃被孢霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸工藝研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016, 47(1): 45-50.

Yang Yong, Wang Zhongjiang, Bi Shuang, et al. Research on preparation technology for arachidonic acid by fermentation of Mortierella isabellina mutant strain[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 45-50. (in Chinese with English abstract)

花生四烯酸（ARA）含有4個雙鍵，其中第1個雙鍵是在甲基端起第6個和第7個碳原子間發(fā)生去飽和反應(yīng)形成，屬于ω-6系列多不飽和脂肪酸[1]，對人體生長發(fā)育具有重要作用。ARA具有抗氧化、抗炎癥、抗癌、降血脂、抑制血小板聚集等多種生物活性[2-3]，已在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4]。目前，制備ARA方法很多，最有效方法是微生物發(fā)酵制備法，而被孢霉、高山被孢霉主要用于工業(yè)化生產(chǎn)菌株。被孢霉屬真菌在制備ARA上具有較大優(yōu)勢，因其具有良好生長活力、易于擴培及強生產(chǎn)能力逐漸成為發(fā)酵制備ARA主要真菌菌株[5]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸最早始于1979年，Penicillium cyaneu菌體內(nèi)富含花生四烯酸[6]。周蓬蓬等通過誘變原始產(chǎn)花生四烯酸菌株獲得高山被孢霉T105和高山被孢霉M20等高產(chǎn)菌株[7]。于長青等利用深黃被孢霉高產(chǎn)花生四烯酸菌株紫外誘變原生質(zhì)體育種獲得生長活力較強，產(chǎn)花生四烯酸能力強菌株[8]。

深黃被孢霉是絲狀真菌，在含有碳水化合物碳源培養(yǎng)基中發(fā)酵時，菌體內(nèi)發(fā)酵合成油脂，含有豐富多不飽和脂肪酸，其中ARA含量較高[9]。大多數(shù)被孢霉為野生菌株，ARA產(chǎn)量低，提高ARA產(chǎn)量必須對已有菌株誘變育種，選擇具有高產(chǎn)ARA特性突變菌株。深黃被孢霉突變菌株用于制備花生四烯酸發(fā)酵工藝研究鮮見報道。本試驗對深黃被孢霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸工藝進行研究，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝，為花生四烯酸生產(chǎn)及加工提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗原料

深黃被孢霉As3.3410：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供；馬鈴薯：市售；七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、檸檬酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋（購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HGCE-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；GC9900型氣相色譜儀（購自上?？苿?chuàng)色譜儀器有限公司）。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)基制備

PDA斜面培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮后切碎，加一定量蒸餾水使馬鈴薯濃度為20%，蒸煮30 min后過濾。向馬鈴薯浸提液中加入七水硫酸鎂0.15%、磷酸二氫鉀0.3%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%，調(diào)pH為6.0，121℃高壓滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10%、酵母膏0.3%、磷酸二氫鉀0.2%、檸檬酸鈉0.2%、硫酸鎂0.05%，調(diào)pH為6.0，121℃高壓滅菌15 min。

1.3.2突變菌株制備

將深黃被孢霉As3.3410接種于PDA斜面培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7 d，待孢子大量生成用無菌水清洗，并溶于生理鹽水中，使活菌數(shù)達到105cfu·mL-1制得菌懸液，在紫外光功率20 W下紫外誘變45 s得到一次突變菌株As3.3410-UV4，在微波功率400 W下微波誘變40 s，經(jīng)紫外和微波兩次誘變后，得到穩(wěn)定高產(chǎn)ARA二次突變菌株As3.3410-UV4-MW56。

1.3.3生產(chǎn)ARA發(fā)酵工藝單因素試驗

將突變菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7 d，待孢子大量生成用無菌水清洗，并溶于生理鹽水中，使活菌數(shù)達到105cfu·mL-1制得菌懸液。將菌懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)ARA。基本發(fā)酵工藝參數(shù)為：接種量18%，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間6 d，發(fā)酵pH 6。在其他條件不變情況下，以生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量為指標，選取接種量為14%、16%、18%、20%、22%，發(fā)酵溫度為24、26、28、30和32℃，發(fā)酵時間為4、5、6、7和8 d，發(fā)酵pH為5、6、7、8、9，進行單因素試驗，每個水平重復(fù)3次取平均值。

1.3.4生產(chǎn)ARA發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗，利用Design-Expert軟件對試驗過程優(yōu)化，以ARA產(chǎn)量R（g·L-1）為響應(yīng)值，選擇接種量A（%）、發(fā)酵溫度B（℃）、發(fā)酵時間C（d）和發(fā)酵pH D為影響因素，每個因素設(shè)定5個水平試驗。其因素水平編碼見表1。

表1因素水平編碼Table 1 Factor levels coding table

1.3.5生物量測定

采用細胞干質(zhì)量法[10]測定生物量。將發(fā)酵液離心后棄上清液，得到菌體沉淀物水洗2次后，放入鋁盒于70℃烘箱中烘干至恒重得到干菌體，稱干重，生物量計算公式如下：

生物量（g·L-1）=菌體干重（g）/發(fā)酵液體積（L）

1.3.6油脂產(chǎn)量測定

采用索氏抽提法對發(fā)酵液進行微生物油脂提取[11]。將干菌體用研缽磨成粉，取2 g于索氏抽提器中用乙醚80℃提取6 h，回收乙醚，100℃下1 h烘干，稱干重。

油脂產(chǎn)量（g·L-1）=油脂干重（g）/發(fā)酵液體積（L）

1.3.7 ARA產(chǎn)量測定

采用氣相色譜測定ARA含量[12]。樣品處理：取微生物油脂25 mg于容量瓶中，加入體積分數(shù)1%硫酸-甲醇混合液5 mL，于70℃水浴中加熱2 h，然后加入5 mL正己烷清洗1次，合并上清液，放入10 mL離心管中，加入少量無水Na2SO4去除水分，靜置4 h后進樣。

氣相色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細管柱FFAP（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；柱初溫為100℃，以8℃·min-1升溫至240℃，然后恒溫至完成分析；汽化室溫度為250℃；載氣體積流量為48 mL·min-1；氫氣體積流量為42 mL·min-1；空氣體積流量為261 mL·min-1；尾吹體積流量為34 mL·min-1；進樣量為4 μL。ARA產(chǎn)量為1 L發(fā)酵液中干菌體所含ARA質(zhì)量（g）。

1.3.8統(tǒng)計分析

采用SPSS V 17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，采用Origin 8.0軟件作圖，采用Design-Expert軟件中心組合設(shè)計進行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵菌株選擇

由圖1可知，深黃被孢霉As3.3410、一次突變菌株As3.3410-UV4和二次突變菌株As3.3410-UV4-MW56對發(fā)酵制備油脂具有不同影響。不同菌株發(fā)酵制備油脂優(yōu)劣性比較為：As3.3410-UV4-MW56>As3.3410-UV4>As3.3410。不論從生物量角度、油脂產(chǎn)量角度還是ARA產(chǎn)量角度分析，最優(yōu)菌株均為二次突變菌株As3.3410-UV4-MW56，為高產(chǎn)ARA菌株，且具有較高穩(wěn)定性。因此，選擇二次突變菌株As3.3410-UV4-MW56為發(fā)酵制備ARA最佳菌株。

圖1深黃被孢霉突變菌株對發(fā)酵制備ARA影響Fig. 1 Effect of Mortierella isabellina mutant strain on fermentation production of ARA

2.2發(fā)酵工藝單因素試驗

2.2.1接種量對誘變菌株發(fā)酵制備ARA影響

由圖2可知，隨接種量增加，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量呈先增后降趨勢，接種量為18%時，生物量和油脂產(chǎn)量最大；接種量為16%時，ARA產(chǎn)量最大。接種量增加會使參與發(fā)酵活菌數(shù)增加，在一定范圍內(nèi)可提高生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量；當接種量過大時，由于營養(yǎng)物質(zhì)含量一定，不能滿足菌體生長需要，且抑制菌體繁殖，導(dǎo)致生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量均下降，影響ARA制備。因此選取接種量為16%。

圖2接種量對突變菌株發(fā)酵制備ARA影響Fig.2 Effect of inoculum concentration on fermentation production of ARA by mutant strain

2.2.2發(fā)酵溫度對誘變菌株發(fā)酵制備ARA影響

由圖3可知，隨發(fā)酵溫度增加，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量逐漸增加，發(fā)酵溫度為28℃時，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量均最大，再繼續(xù)增加發(fā)酵溫度，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量反而降低。微生物生長繁殖存在最適溫度范圍，超過范圍會抑制生長，也會影響發(fā)酵性能，控制發(fā)酵溫度對生物法制備ARA極為重要，適當降低發(fā)酵溫度利于產(chǎn)物合成。綜合考慮，選取發(fā)酵溫度為28℃。

圖3發(fā)酵溫度對突變菌株發(fā)酵制備ARA影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on fermentation production of ARA by mutant strain

2.2.3發(fā)酵時間對誘變菌株發(fā)酵制備ARA影響

由圖4可知，隨發(fā)酵時間延長，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量增加，當發(fā)酵時間延長到6 d時，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量趨于平緩，且不再隨發(fā)酵時間延長而增加。發(fā)酵初期，菌體細胞能利用發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)快速生長繁殖，使生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量增加，但當發(fā)酵時間過長時，菌體細胞發(fā)生自溶或菌絲體不再生長，對發(fā)酵制備ARA造成不利影響。綜合考慮，選取發(fā)酵時間為6 d。

2.2.4發(fā)酵pH對誘變菌株發(fā)酵制備ARA影響

由圖5可知，隨發(fā)酵pH增加，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量呈先增后降趨勢，隨后逐漸趨于平緩，發(fā)酵pH為6時，生物量、油脂產(chǎn)量和ARA產(chǎn)量均達到最大。微生物生長繁殖具有最適pH范圍，超過范圍會抑制生長，也影響發(fā)酵性能；菌體在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量有機酸，使pH下降，超過最適范圍，影響菌體發(fā)酵制備ARA，通過人為控制pH保證菌體正常發(fā)酵。綜合考慮，選取發(fā)酵pH為6。 2.3發(fā)酵工藝優(yōu)化

圖4發(fā)酵時間對突變菌株發(fā)酵制備ARA影響Fig. 4 Effect of fermentation time on fermentation production of ARA by mutant strain

圖5發(fā)酵pH對突變菌株發(fā)酵制備ARA影響Fig. 5 Effect of fermentation pH on fermentation production of ARA by mutant strain

試驗采用響應(yīng)曲面法過程優(yōu)化，采用統(tǒng)計軟件Design-Expert試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理。以接種量A （%）、發(fā)酵溫度B（℃）、發(fā)酵時間C（d）和發(fā)酵pH D分別代表自變量，以ARA產(chǎn)量R（g·L-1）為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。試驗號1~24為析因試驗，25~36為12個中心試驗，用以估計試驗誤差。

表2試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and result

利用Design-Expert軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得ARA產(chǎn)量R對自變量接種量A、發(fā)酵溫度B、發(fā)酵時間C和發(fā)酵pH D二次多項回歸模型方程為：

R=2.98-0.13A + 0.031B + 0.074C + 0.066D + 0.076AB-0.0037AC + 0.19AD + 0.29BC-0.27BD + 0.026CD-0.20A2-0.34B2-0.13C2-0.33D2

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，方程因變量與自變量之間線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著（P<0.0001），失擬項不顯著（P>0.05），且該模型R2=95.39%，R2Adj=92.32%，模型與試驗擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)理論推測。由F檢驗可得到因子貢獻率為：A>C>D>B，即接種量>發(fā)酵時間>發(fā)酵pH>發(fā)酵溫度。交互項BC、BD交互作用顯著，兩因素交互作用（顯著項）對ARA產(chǎn)量影響響應(yīng)面分析見圖6。

由圖6可知，不同因素交互作用對ARA產(chǎn)量產(chǎn)生影響。兩因素交互作用可反映響應(yīng)值變化規(guī)律，同時影響響應(yīng)值變化程度。ARA產(chǎn)量隨發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH增加，呈先增后減趨勢；隨發(fā)酵時間延長增加到一定值后趨于平衡，與單因素試驗結(jié)果一致。

圖6兩因素交互作用(顯著項)對ARA產(chǎn)量影響響應(yīng)面Fig.6 Effect of interaction between two factors (significantly) on ARA yield

通過分析軟件Design-Expert尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為：A、B、C和D對應(yīng)編碼值分別為-0.34、0.29、0.58和-0.09，ARA產(chǎn)量有最大值3.03 g·L-1。理論最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：接種量15.66%，發(fā)酵溫度28.29℃，發(fā)酵時間6.58 d，發(fā)酵pH 5.96。為驗證模型預(yù)測準確性，在響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，重復(fù)3次驗證試驗取平均值，優(yōu)化ARA產(chǎn)量平均值為3.12 g·L-1，與理論值3.03 g·L-1較接近，說明響應(yīng)值試驗值與回歸方程理論值吻合良好。最終確定深黃被孢霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸最優(yōu)工藝條件為：接種量15.66%，發(fā)酵溫度28.29℃，發(fā)酵時間6.58 d，發(fā)酵pH 5.96。

3結(jié)論

采用紫外和微波兩次誘變得到突變菌株As3.3410-UV4-MW56為最佳菌株，接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH影響突變菌株發(fā)酵制備油脂。在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法確定深黃被孢霉突變菌株發(fā)酵制備花生四烯酸最優(yōu)工藝條件為：接種量15.66%，發(fā)酵溫度28.29℃，發(fā)酵時間6.58 d，發(fā)酵pH 5.96。在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，ARA產(chǎn)量為3.12 g·L-1。

[參考文獻]

[ 1 ]姚昕,秦文,齊春梅,等.花生四烯生理活性及其應(yīng)用[J].糧油加工與食品機械, 2004(5): 57-59.

[ 2 ] de Vrieze E, Moren M, Metz J R, et al. Arachidonic acid enhanc?es turnover of the dermal skeleton: Studies on zebrafish scales[J]. PLoS One, 2014, 9(2): 897-905.

[ 3 ] Castellino F J, Chapman M P, Donahue D L, et al. Traumatic brain injury causes platelet adenosine diphosphate and arachidonic ac?id receptor inhibition independent of hemorrhagic shock in hu?mans and rats[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2014, 76(5): 1169-1176.

[ 4 ] Brown M, Roulson J A, Hart C A, et al. Arachidonic acid induc?tion of rho-mediated transendothelial migration in prostate cancer [J]. Br J Cancer, 2014, 110(8): 2099-2108.

[ 5 ]王嘯,邱樹毅.微生物發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸研究進展[J].中國油脂, 2004, 29(9): 37-40.

[ 6 ]符嫦娥,韓偉,卞進發(fā),等.花生四烯研究進展[J] .云南化工, 2004(5): 31-34.

[ 7 ]周蓬蓬,余龍江,李為,等. YAG激光照射對高山被孢霉花生四烯產(chǎn)量影響[J].激光生物學(xué)報, 2002(5): 372-376.

[ 8 ]于長青,李麗娜.深黃被孢霉高產(chǎn)花生四烯酸菌株紫外誘變原生質(zhì)體育種[J].微生物學(xué)報, 2009(1): 44-48;

[ 9 ]姚笛,于長青,楊健,等.深黃被孢霉的脫飽和酶活性與花生四烯酸產(chǎn)量關(guān)系[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2009(11): 24-26.

[10]劉淑君,楊文博,施安輝.高產(chǎn)油脂酵母選育及搖瓶發(fā)酵條件研究[J].微生物學(xué)通報, 2000, 27(2): 93-97.

[11]國家糧食儲備局西安油脂科學(xué)研究設(shè)計院,陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所,中糧黃海糧油工業(yè)(山東)有限公司. GB/T 17377-2008動植物油脂脂肪酸甲脂氣相色譜分析[S].北京:中國標準出版社, 2009.

[12]程志青,吳惠勤. GC/MS法快速測定食用植物油中脂肪酸含量[J].分析測試通報, 1989, 8(6): 11-14.

Research on preparation technology for arachidonic acid by fermentation of Mortierella isabellina mutant strain

YANG Yong1,2, WANG Zhongjiang1, BI Shuang1, ZHANG Hui3, LI Yang1, JIANG Lianzhou1(1. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province, School of Food and Bioengineering, Qiqihar University, Qiqihar Heilongjiang 161006, China; 3. Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China, China Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China)

Abstract:On the basis of single factor experiment, technological parameters of preparation for arachidonic acid by Mortierella isabellina mutant strain were determined by response surface methodology to optimize fermentation conditions as following: inoculum size was 15.66%, fermentation temperature was 28.29℃, fermentation time was 6.58 d, fermentation pH was 5.96. In the best fermentation process conditions, ARA yield was 3.12 g·L-1, which enhanced yield. At the same time, inoculum size was decreased, fermentation time was shortened, and production cost was reduced.

Key words:Mortierellaisabellina; mutant strain; fermentation; arachidonic acid

*通訊作者：江連洲，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為糧油加工。E-mail: jlzname@163.com

作者簡介：楊勇（1979-），男，副教授，博士研究生，研究方向為糧油加工與食品安全。E-mail: yangyong7904@163.com

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金項目（C201331）

收稿日期：2015-11-10

中圖分類號：TS201.1

文獻標志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）01-0045-06