彭　志，盧芳國，屈金艷，李　玲，范伏元*，那婧婧，李湘蘭（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙4008；.湖南安邦制藥有限公司，湖南長沙40008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙40007）

?

銀黃清肺膠囊含藥血清體外抗呼吸道合胞病毒實驗研究

彭志1，盧芳國2，屈金艷3，李玲2，范伏元3*，那婧婧1，李湘蘭1
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南安邦制藥有限公司，湖南長沙410008；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

〔摘要〕目的研究銀黃清肺膠囊含藥血清體外抑制呼吸道合胞病毒（RSV）的作用。方法采用觀察CPE及MTT法，觀察在銀黃清肺膠囊含藥血清干預(yù)下，感染RSV Hep-2細胞的CPE及光密度值，從而比較不同給藥方式（預(yù)防給藥、治療給藥、直接殺滅）及不同藥物劑量下銀黃清肺膠囊對RSV的抑制作用。結(jié)果在三種給藥方式中，與相應(yīng)濃度空白血清比較，各濃度銀黃清肺膠囊與利巴韋林片含藥血清OD值均明顯增高（P＜0.05）；其中稀釋度為3.13%的利巴韋林片含藥血清和稀釋度為6.25%的銀黃清肺膠囊含藥血清相比本組其他濃度含藥血清OD值均明顯增高（P＜0.05）。結(jié)論銀黃清肺膠囊含藥血清對RSV有直接滅活作用，對RSV侵入Hep-2細胞有阻斷作用，對RSV在Hep-2細胞內(nèi)增殖有抑制作用。其中稀釋度為3.13%的利巴韋林含藥血清和稀釋度為6.25%的銀黃清肺膠囊含藥血清相比本組其他濃度含藥血清體外抗RSV活性強。

〔關(guān)鍵詞〕呼吸道合胞病毒；銀黃清肺膠囊；含藥血清；抗病毒；葶藶子；炙麻黃；苦杏仁

Experimental Research of Yinhuang Qingfei Capsules Containing Serum on the Respiratory Syncytial Virus in Vitro

PENG Zhi1，LU Fangguo2，QU Jinyan3，LI Ling2，F(xiàn)AN Fuyuan3*，NA Jingjing1，LI Xianglan1
（1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. Hunan Anbang Pharmaceutical Co. Ltd., Changsha, Hunan 410208, China; 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China）

〔Abstract〕Objective To study Yinhuang Qingfei capsules containing serum on the respiratory syncytial virus in vitro. Methods The cytopathic effect（CPE）and optical density（OD）of respiratory syncytial virus（RSV）infection Hep-2 cells, which were intervened by Yinhuang Qingfei capsules, were by CPE and MTT methods. The inhibition effects of Yinhuang Qingfei capsules on RSV with different doses and different administration methods（drug prevention, treatment, directly kill）were observed. Results Compared with the corresponding concentration of blank serum, the serum OD values in Yinhuang Qingfei capsule and ribavirin tablets containing serum groups were significantly increased（P＜0.05）; Compared with other oncertrations of the same groups, the OD valiues of ribavirin with 3.125%dilution and Yinhuang Qingfei with 6.125%dilution were increased obviuosly（P＜0.05）. Conclusion Yinhuang Qingfei capsule showed directly inactivation effect on RSV, blocking effect on RSV invade Hep-2 cells, proliferation inhibition on RSV in Hep-2 cell, and the ribavirin with 3.125%dilution and Yinhuang Qingfei with 6. 25%dilution showed strongest anti-RSV effect in vitro.

〔Keywords〕respiratory syncytial virus, Yinhuang Qingfei capsule; drug serum; antiviral; pepperweed seed; prepared ephedra; bitter almond kernel

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）主要引起嬰幼兒下呼吸道感染，即喘息性毛細支氣管肺炎，較大兒童和成人主要引起上呼吸道感染。有文獻報道，90%以上的毛細支氣管炎和多數(shù)病毒性肺炎由RSV引起[1]。RSV的傳染性很強，且感染后不能獲得持久免疫力，因此，重復(fù)感染十分常見[2]。由于RSV致病機制復(fù)雜，尚無安全有效的RSV疫苗問世，現(xiàn)RSV感染缺乏有效的預(yù)防和治療措施，美國FDA迄今共批準過兩個用于治療RSV感染的藥物，即利巴韋林及RSV特異性免疫球蛋白，但由于利巴韋林毒副作用的爭議及RSV特異性免疫球蛋白昂貴的價格使其在臨床上的推廣應(yīng)用受到限制，目前RSV感染仍以支持療法為主。近年來對中藥及中藥復(fù)方的研究顯示，中藥治療體內(nèi)外病毒感染性疾病療效確切，毒副作用小，作用靶點多，耐藥發(fā)生率低，有獨特不可替代的優(yōu)勢[3-5]。銀黃清肺膠囊是由葶藶子、炙麻黃、苦杏仁、浙貝母等藥物組成的中藥復(fù)方，具有清肺化痰，止咳平喘功效，臨床用于治療喘息性毛細支氣管炎急性發(fā)作療效顯著，為探討其作用機制，本文將其體外抗RSV實驗結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物銀黃清肺膠囊由湖南安邦制藥有限公司生產(chǎn)，批號：121202，規(guī)格：0.15 g/粒。因成人口服用藥劑量為1.35 g/d，按成人體質(zhì)量60 kg，實驗大鼠體質(zhì)量240 g換算，參照常用實驗大鼠與人的體表面積比值（R）表計算，每只大鼠每日給藥劑量為0.15 g（即大鼠給藥量為0.66 g/kg）。利巴韋林片由江西江仁藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：0601001，規(guī)格：0.1 g/片。成人口服用藥劑量為0.45 g/d，參照常用實驗大鼠與人的體表面積比值（R）表計算，每只大鼠每日給藥劑量為0.05 g（即大鼠給藥量為0.22 g/ kg）。用蒸餾水充分溶散，制成混懸液待用。

1.1.2病毒及細胞RSV購自湘雅中心實驗室，Hep-2細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3實驗動物SPF級大鼠，雌雄各半，（220± 20）g，購自湖南斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2013-0005，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室，室內(nèi)清潔，自然采光，通風良好。

1.1.4試劑及設(shè)備DMEM干粉、胎牛血清均購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素均購自碧云天公司；L-谷胺酰胺購自Amresco公司；MTT（細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒）、胰酶消化液均購自碧云天公司；二甲基亞砜、臺盼藍Trypan Blue均購自Sigma公司；DG5033A酶標儀（南京華東電子集團醫(yī)療設(shè)備有限責任公司）；XDS-100倒置熒光電子顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備[6]24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為銀黃清肺膠囊組，利巴韋林組，空白組3組，每組8只。銀黃清肺膠囊組、利巴韋林組分別以0.66、0.22 g/kg的劑量灌胃，空白組每天灌胃等體積蒸餾水。每天2次，連續(xù)7 d，在第8天末次給藥1 h后，予10%水合氯醛麻醉，3 min后經(jīng)腹主動脈采血，靜置30 min后，1 000 r/min，離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，56℃水浴滅活補體30 min，于超凈工作臺分裝，置于-20℃冰箱凍存。

1.2.2RSV感染性的測定實驗用組織培養(yǎng)感染量（100TCID50）測定藥物對病毒的作用。用細胞維持液將病毒做連續(xù)10倍稀釋，稀釋病毒液成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共10個稀釋度。將生長良好的Hep-2細胞調(diào)整濃度至1×105個/mL，每孔100 μL，接種于細胞培養(yǎng)96孔板內(nèi)，待細胞長成單層后，棄去細胞培養(yǎng)液，接種遞次稀釋的病毒液，每個濃度接種3復(fù)孔，每孔100 μL，同時設(shè)置正常細胞對照組（只加維持液），每孔100 μL，再置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去含病毒的維持液，病毒感染孔及正常對照孔均加入正常細胞維持液，每孔100 μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鏡下觀察細胞形態(tài)，連續(xù)5 d。記錄各孔細胞病變（CPE）程度。判定CPE指標[7]：“0”表示無明顯CPE，“l(fā)”表示CPE為l%～25%，“2”表示CPE為26%～50%，“3”表示CPE為5l%～75%，“4”表示CPE為76%～100%。用Reed-Muench法計算TCID[8]。

1.2.3含藥血清對Hep-2細胞毒性測定用細胞維持液將含藥血清及空白組血清均以2倍濃度梯度稀釋成5個濃度（50%，25%，12.5%，6.25%，3.13%），待細胞長滿細胞培養(yǎng)瓶時,將細胞消化、稀釋,使細胞密度調(diào)整為1×l05個/mL，依次接種于細胞培養(yǎng)96孔板中，每孔100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞長成單層后，棄去細胞培養(yǎng)液，加入各濃度含藥血清稀釋液，每孔100 μL，每濃度3個復(fù)孔,將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，MTT法于酶標儀550 nm波長處讀取吸收度OD值，計算最大無毒濃度。

1.2.4含藥血清體外抗RSV毒性測定將各組血清（銀黃組、利巴韋林組、空白組）在最大無毒范圍內(nèi)以無血清DMEM進行2倍濃度梯度稀釋，最終各5個濃度（12.5%，6.25%，3.13%，1.56%，0.78%）。病毒攻擊量為100TCID50。選用96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長成單層后，分3種加藥方式：Ⅰ組（預(yù)防給藥組）先將各稀釋濃度的含藥血清加至已長滿細胞的96孔板,每孔100 μL，每濃度3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，加入病毒100 μL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附2 h后，吸去病毒液,用PBS液洗滌2次,加入2%胎牛血清維持液100 μL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，記錄細胞病變結(jié)果。同時設(shè)正常對照及病毒對照組，用活細胞染色計數(shù)法（MTT）于酶標儀在550 nm波長處讀取吸光度OD值，參照文獻[9]進行；Ⅱ組（治療給藥組）先將稀釋病毒液加入已長滿細胞的96孔板,每孔100 μL，每濃度3個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附2 h后，吸去病毒液，用PBS液洗滌2次，再加入各稀釋濃度的含藥血清培養(yǎng)48 h，用MTT法于酶標儀在550 nm波長處讀取吸光度OD值；Ⅲ組（直接殺滅組）將各稀釋濃度含藥血清分別與稀釋病毒液混勻后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用1 h后，加入已長滿細胞的96孔板中，每孔100 μL，每濃度3個復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用MTT法于酶標儀在550 nm波長處讀取吸光度OD值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1RSV感染性的測定

結(jié)果測得RSV的TCID50為l0-8。

2.2含藥血清對Hep-2細胞毒性測定結(jié)果

依Reed—Muench法計算出銀黃清肺膠囊含藥血清和空白組血清在檢測的濃度范圍內(nèi)對Hep2細胞無毒。利巴韋林分散片含藥血清在檢測的濃度范圍內(nèi)對Hep2細胞的最大無毒濃度為含藥血清原液的12.5%。結(jié)果見圖1。

圖1　含藥血清對Hep-2細胞毒性測定結(jié)果折線圖

2.3含藥血清體外抗RSV毒性測定

2.3.1Ⅰ組與正常對照組比較，各濃度空白對照組Hep-2細胞的OD值明顯降低（P＜0.05）；與相應(yīng)濃度的空白對照組比較，各濃度銀黃清肺膠囊含藥組血清及利巴韋林含藥血清Hep-2細胞的OD值明顯升高（P＜0.05）；稀釋度為3.13%的利巴韋林含藥血清和稀釋度為6.25%的銀黃清肺膠囊含藥血清相比本組其他濃度含藥血清OD值明顯升高（P＜0.05）?？瞻捉M的血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.053，P＞0.05）；利巴韋林片含藥血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝11.494，P＜0.05），銀黃清肺膠囊含藥血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝17.456，P＜0.01）。見表1。

表1　預(yù)防給藥含藥血清對RSV感染Hep-2細胞活性的影響?。ā纒,n＝3）

表1　預(yù)防給藥含藥血清對RSV感染Hep-2細胞活性的影響?。ā纒,n＝3）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，▲P＜0.05；組內(nèi)不同濃度兩兩比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別正常細胞對照組（小牛血清組）空白對照血清組利巴韋林含藥血清組銀黃清肺膠囊含藥血藥組血清濃度（%）12.5 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 OD值1.123±0.04 0.321±0.056* 0.323±0.031* 0.331±0.062* 0.326±0.056* 0.314±0.028* 0.621±0.076*▲＃0.654±0.046*▲＃0.861±0.049*▲＃0.661±0.055*▲＃0.582±0.045*▲＃0.581±0.065*▲＃＃0.838±0.052*▲＃＃0.664±0.053*▲＃＃0.571±0.056*▲＃＃0.512±0.031*▲＃＃

2.3.2Ⅱ組與正常對照組比較，各濃度空白對照組的Hep-2細胞的OD值明顯降低（P＜0.05）；與相應(yīng)濃度的空白對照組比較，各濃度銀黃清肺膠囊含藥組血清及利巴韋林含藥血清Hep-2細胞的OD值明顯升高（P＜0.05）；稀釋度為3.13%的利巴韋林含藥血清及稀釋度為6.25%的銀黃清肺膠囊含藥血清相比本組其他濃度含藥血清OD值明顯升高（P＜0.05）?？瞻捉M血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.256，P＞0.05）；利巴韋林片含藥血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝23.913，P＜0.05）；銀黃清肺膠囊含藥血清不同濃度Hep-2細胞OD值存在顯著差異（F＝66.866，P＜0.01）。見表2。

2.3.3Ⅲ組與正常對照組比較，各濃度空白對照組的Hep-2細胞的OD值明顯降低（P＜0.05）；與相應(yīng)濃度的空白對照組比較，各濃度銀黃清肺膠囊含藥組血清及利巴韋林片含藥血清Hep-2細胞的OD值明顯升高（P＜0.05）；稀釋度為3.13%的利巴韋林含藥血清及稀釋度為6.25%的銀黃清肺膠囊含藥血清相比本組其他濃度含藥血清OD值明顯升高（P＜0.05）?？瞻捉M的血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.115，P＞0.05）；利巴韋林片含藥血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝22.266，P＜0.05）；銀黃清肺膠囊含藥血清不同濃度Hep-2細胞OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝60.480，P＜0.01）。見表3。

表2　治療給藥含藥血清對RSV感染Hep-2細胞活性的影響　（±s,n＝3）

表2　治療給藥含藥血清對RSV感染Hep-2細胞活性的影響?。ā纒,n＝3）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，▲P＜0.05；組內(nèi)不同濃度兩兩比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別正常細胞對照組（小牛血清組）空白對照血清組利巴韋林含藥血清組銀黃清肺膠囊含藥血藥組血清濃度（%）12.5 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 OD值1.083±0.094 0.336±0.008* 0.358±0.083* 0.333±0.040* 0.328±0.036* 0.324±0.021* 0.593±0.029*▲＃0.663±0.064*▲＃0.915±0.033*▲＃0.682±0.027*▲＃0.589±0.066*▲＃0.561±0.039*▲＃＃0.932±0.019*▲＃＃0.597±0.034*▲＃＃0.521±0.026*▲＃＃0.497±0.058*▲＃＃

表3　直接抑制給藥含藥血清對RSV感染Hep-2細胞活性的影響?。ā纒,n＝3）

表3　直接抑制給藥含藥血清對RSV感染Hep-2細胞活性的影響?。ā纒,n＝3）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，▲P＜0.05；組內(nèi)不同濃度兩兩比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別正常細胞對照組（小牛血清組）空白對照血清組利巴韋林含藥血清組銀黃清肺膠囊含藥血藥組血清濃度（%）12.5 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 12.5 6.25 3.13 1.56 0.78 OD值1.137±0.037 0.326±0.008* 0.334±0.019* 0.325±0.018* 0.330±0.024* 0.327±0.023* 0.555±0.035*▲＃0.629±0.015*▲＃0.871±0.054*▲＃0.597±0.081*▲＃0.547±0.035*▲＃0.651±0.038*▲＃＃0.876±0.042*▲＃＃0.630±0.023*▲＃＃0.599±0.038*▲＃＃0.472±0.022*▲＃＃

3　討論

既往研究發(fā)現(xiàn),在一定細胞濃度范圍內(nèi),光密度值與活細胞數(shù)成正比[10]。此次實驗結(jié)果表明：銀黃清肺膠囊含藥血清對呼吸道合胞病毒有直接滅活作用，能阻斷RSV侵入Hep-2細胞，同時能抑制呼RSV在Hep-2細胞內(nèi)增殖。其中直接滅活呼吸道合胞病毒，可能是由于其具有直接殺傷病毒作用，或者藥物成分與病毒表面某特征性部位相結(jié)合，使病毒難以進入細胞內(nèi)復(fù)制。阻斷RSV侵入可能是通過與細胞表面受體結(jié)合而實現(xiàn)，抑制RSV增殖則可能是由于抑制了病毒核酸的復(fù)制或阻斷了病毒蛋白的合成。三種給藥方式中，銀黃清肺膠囊含藥血清當稀釋度為6.25%時OD值最高，體外抗RSV活性最強,可能與高濃度組含藥血清濃度高，對細胞有一定毒性作用；低濃度組含藥血清濃度低,抗病毒效力弱有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)防治病毒性肺炎的藥物都是從以下兩方面入手的:一是作用于病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等環(huán)節(jié),直接影響病毒生活周期以抗病毒;二是修飾宿主細胞膜受體、調(diào)整機體狀態(tài),阻止病毒表達進入宿主細胞,或?qū)Σ《靖腥井a(chǎn)生的次生變化進行調(diào)整[11]。但由于銀黃清肺膠囊藥物組成較多，作用靶點多，環(huán)節(jié)復(fù)雜，其詳盡作用機制目前還不夠明確，有待進一步研究。

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（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*范伏元，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:ffy023@163.com。

〔作者簡介〕彭志，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)呼吸內(nèi)科。

〔基金項目〕國家自然基金課題（81473468，81072751）；湖南省自然科學(xué)基金項目（13JJ6062）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點項目（13A066）；湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊“感染性疾病中醫(yī)藥防治研究”資助項目；湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)類項目（2014CK1022）。

〔收稿日期〕2015-06-02

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.02.011