郭　穎，郭建華，符　航，田芝瑜，羅　強(qiáng)，劉　芳，張林西

( 1．河北北方學(xué)院病理教研室，河北張家口　075000;2．張家口市宣化皇城醫(yī)院功能科，河北宣化　075100; 3．河北北方學(xué)院，河北張家口　075000;4．河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口　075000)

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青蒿琥酯對(duì)人大腸癌Lovo細(xì)胞侵襲影響的初步研究

郭穎1，郭建華2，符航3，田芝瑜3，羅強(qiáng)4，劉芳4，張林西4

( 1．河北北方學(xué)院病理教研室，河北張家口075000;2．張家口市宣化皇城醫(yī)院功能科，河北宣化075100; 3．河北北方學(xué)院，河北張家口075000;4．河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口075000)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào): R284．1; R329．24; R735．340．22; R977. 6

摘要:目的觀察青蒿琥酯對(duì)大腸癌細(xì)胞的侵襲作用，并探討其作用機(jī)制。方法采用不同濃度的青蒿琥酯( 20、80、160 μmol·L－1)作用于人大腸癌Lovo細(xì)胞，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)Lovo細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響; Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)Lovo細(xì)胞侵襲的影響; Western blot方法分別檢測(cè)Lovo細(xì)胞內(nèi)HMGB1和MMP-2蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。結(jié)果青蒿琥酯能有效抑制Lovo細(xì)胞的增殖和侵襲能力，且呈劑量依賴性( P＜0. 01)。與對(duì)照組相比，不同濃度青蒿琥酯處理組HMGB1和MMP-2蛋白表達(dá)逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。結(jié)論青蒿琥酯可明顯抑制大腸癌Lovo細(xì)胞侵襲，其機(jī)制可能與抑制HMGB1蛋白，下調(diào)MMP-2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:青蒿琥酯;大腸癌;增殖;侵襲; HMGB1;MMP-2

青蒿琥酯( artesunate，ART)作為一種高效、低毒的抗瘧藥已廣為人知，近來(lái)又有研究發(fā)現(xiàn)，ART還有抗腫瘤功效，但其作用機(jī)制尚未明確。而侵襲和轉(zhuǎn)移是大腸癌患者死亡的主要原因，近年研究發(fā)現(xiàn)，包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高遷移率族蛋白( high mobility group protein，HMG蛋白)過(guò)表達(dá)，有可能通過(guò)激活下游基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)來(lái)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ART干預(yù)大腸癌Lovo細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HMGB1和侵襲遷移相關(guān)基因MMP-2表達(dá)情況，來(lái)探討其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1．1主要材料人大腸癌Lovo細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心，青蒿琥酯購(gòu)于桂林南藥股份有限公司(批號(hào)H10930195)。培養(yǎng)基F12K購(gòu)于Sigma公司; BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)于Pierce公司; Transwell小室購(gòu)于Coster公司;基底膜膠( Matrigel)購(gòu)于BD公司; HMGB1抗體、MMP-2抗體、β-actin抗體均購(gòu)于Santa Cruz公司。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)人大腸癌Lovo細(xì)胞株采用F12K培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于含5% CO2的37℃溫箱中，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用不同濃度( 20、80、160 μmol·L－1)的青蒿琥酯處理Lovo細(xì)胞，不加藥物組為陰性對(duì)照，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1．2．2軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法［1］，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞5 000個(gè)，接種于含下層5 g·L－1瓊脂糖和上層3. 5 g·L－1瓊脂糖的6孔板中，37℃和5% CO2實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)14 d后，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞集落抑制率。集落抑制率/% = ( 1－給藥組集落數(shù)/對(duì)照組集落數(shù))×100%

1．2．3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法［2］進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。Transwell小室的上室底部為孔徑8 μm的聚碳酸酯膜，膜上鋪勻1∶4稀釋的基底膜膠( matrigel)。下室加預(yù)先制備的Lovo細(xì)胞培養(yǎng)上清液600 μL，上室加入100 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)液，然后按照1×105個(gè)細(xì)胞的密度在上室加入ART ( 20、80、160 μmol·L－1)處理后的細(xì)胞懸液30 μL，每組4個(gè)復(fù)孔。37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，取出濾膜，用棉簽擦盡膜上Matrigel及未穿過(guò)的細(xì)胞，甲醇固定5 min，HE染色。光鏡200倍，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取每個(gè)視野的平均數(shù)表示腫瘤細(xì)胞侵襲能力。

1．2．4 HMGB1和MMP-2蛋白水平檢測(cè)提取各組Lovo細(xì)胞總蛋白，對(duì)蛋白定量后進(jìn)行常規(guī)Western blot法檢測(cè)各組蛋白水平，與內(nèi)參照β-actin的測(cè)定結(jié)果相對(duì)比，利用Kodak Digital Science ID Image Analysis Software ( Eastman Kodak Company，USA)測(cè)定各條帶凈灰度值。

1．2．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)計(jì)量單位，用±s表示，樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析( one way ANOVA)。

2　結(jié)果

2．1青蒿琥酯對(duì)大腸癌Lovo細(xì)胞軟瓊脂集落形成的影響人大腸癌Lovo細(xì)胞可自發(fā)形成集落。經(jīng)青蒿琥酯處理48 h后發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯處理組( 20 μmol·L－1)即出現(xiàn)Lovo細(xì)胞集落生成減少;與對(duì)照組相比，青蒿琥酯由低到高濃度處理組集落形成抑制率分別為( 38. 01±5. 12) %、( 53. 05±2. 92) %和( 69. 37±1. 84) %，呈劑量依賴性( P＜0. 01，F(xiàn)ig 1)。

Fig 1 Influence of soft-agar colony formation of the artesunate on Lovo cells ( n =5)

2．2青蒿琥酯對(duì)大腸癌Lovo細(xì)胞侵襲的影響與對(duì)照組比較，隨青蒿琥酯濃度增高，Lovo細(xì)胞穿過(guò)濾過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)分別為30. 33±2. 52、15. 67± 1. 53，8. 00±1. 00，呈明顯下降趨勢(shì)，與對(duì)照組( 47. 00±2. 00)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01，F(xiàn)ig 2)。

Fig 2 Effect of artesunate on invasion of Lovo cells detected by Matrigel contained transwell chamber assay ( n =5)

2．3青蒿琥酯對(duì)Lovo細(xì)胞HMGB1和MMP-2蛋白表達(dá)的影響青蒿琥酯處理細(xì)胞后，于48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，處理組HMGB1和MMP-2蛋白水平均隨濃度升高而降低( Tab 1，F(xiàn)ig 3)。

Tab 1 Expressions of HMGB1 and MMP2 in Lovo cells treated with different concentrations of artesunate( n =3)

Fig 3 Effects of artesunate on expression of HMGB1 and MMP-2 in Lovo cells

3　討論

ART作為一種中藥提取成分，廣泛應(yīng)用于抗瘧治療，近幾年，人們發(fā)現(xiàn)它也有抗腫瘤功效，但對(duì)腫瘤的抑制作用研究仍不深入。大腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，20%的患者在診斷時(shí)就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，另外早期診斷為大腸癌的患者，有半數(shù)最終也發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］，所以控制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移刻不容緩。大多數(shù)正常的真核細(xì)胞(除成熟紅細(xì)胞外)，只有黏附在特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能存活，稱為錨著依賴性( anchorage dependence)。而腫瘤細(xì)胞其惡性程度可以利用其錨著不依賴性檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)移動(dòng)能力。軟瓊脂中的克隆形成率則反映細(xì)胞的群體依賴性和增殖能力，是反映腫瘤細(xì)胞的惡性度的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，軟瓊脂形成集落的多少與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)［4］。癌細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)，軟瓊脂上形成的集落數(shù)目越多且集落體積越大［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度的青蒿琥酯處理后，軟瓊脂集落數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性( P＜0. 01)，提示青蒿琥酯可在某種程度上抑制大腸癌細(xì)胞的惡性增殖能力。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是通過(guò)侵襲細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)［6］。目前常用的基質(zhì)膠matrigel主要成分由層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等，與細(xì)胞外基質(zhì)的成分非常相近，能有效地模擬腫瘤細(xì)胞在體外的侵襲過(guò)程。黃偉煒等［7］以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8為模型，采用軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可明顯抑制結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的侵襲，其抑制作用與減少腫瘤新生血管有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌Lovo細(xì)胞有較強(qiáng)的侵襲能力，而經(jīng)過(guò)青蒿琥酯處理后，穿過(guò)聚碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性減少( P＜0. 01)，提示青蒿琥酯可抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲能力，本研究進(jìn)一步從降解細(xì)胞外基質(zhì)的途徑探討青蒿琥酯侵襲抑制機(jī)制。

基質(zhì)金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中占重要位置［8］。其中MMP-2是該家族的重要成員之一，在許多腫瘤如肝細(xì)胞癌［9］、子宮內(nèi)膜癌［10］、肺癌［11］、結(jié)腸癌［12］、胃癌［13］等組織中過(guò)表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)很低或不表達(dá)也得到證實(shí)。近來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MMP-2基因作為腫瘤標(biāo)志物，與某些癌細(xì)胞侵襲有關(guān)，在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后發(fā)揮作用［14］。高遷移率族蛋白B1 ( high mobility group protein B1，HMGB1)因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移率而得名。研究發(fā)現(xiàn)HMGB1通過(guò)與晚期PAGE結(jié)合，激活MAPK、p38、JNK等信號(hào)通路，引起MMPs等腫瘤相關(guān)因子的激活［15］，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)與HMGB1的高表達(dá)密切相關(guān)［16］。本研究以不同濃度青蒿琥酯處理大腸癌Lovo細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)HMGB1和MMP-2蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯處理組HMGB1和MMP-2蛋白水平均明顯下調(diào)，提示青蒿琥酯影響HMGB1與相應(yīng)受體結(jié)合，抑制細(xì)胞核外的相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致MMP-2表達(dá)下降，阻礙細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減少細(xì)胞向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的可能性。

綜上所述，青蒿琥酯在體外培養(yǎng)中證實(shí)能抑制大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，有可能成為一個(gè)有較好前景的抗腫瘤中成藥，其抑制侵襲作用通過(guò)何種信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步研究。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)在河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心完成。)

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Preliminary of research of effect of artesunate on invasion of human colon cancer Lovo cells

GUO Ying1，GUO Jian-hua2，F(xiàn)U Hang3，TIAN Zhi-yu3，LUO Qiang4，LIU Fang4，ZHANG Lin-xi4
( 1. Dept of Pathology，Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China; 2. Dept of Function，Huangcheng Hospital，Zhangjiakou，Hebei 075100，China; 3. Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China; 4. Experiment center，Heber North University，Zhangjiakou Hebei 075000，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of artesunate on the invasion of human colon cancer Lovo cells and the possible mechanisms．Methods After Lovo cells were treated with different doses of artesunate( 20，80，160 μmol·L－1)，the soft agar colony formation test was adopted to observe the anchorage-independent proliferation of Lovo cells．Transwell assay was used to determine the effect of artesunate on the invasion ability of Lovo cells．And the protein expressions of HMGB1 and MMP-2 were investigated by western blot．ResultsArtesunate could significantly inhibit both proliferation and invasion ability of Lovo cells in a dose-dependent manner( P＜0. 01)．The experimental group treated with artesunate significantly down-regulated the protein expressions of HMGB1 and MMP-2 compared with control group( P＜0. 05)．Conclusion Artesunate could inhibit the invasion of human colon cancer Lovo cells by down-regulating HMGB1 and MMP-2 expressions．

Key words:artesunate; colon cancer; proliferation; invasion; HMGB1; MMP-2

作者簡(jiǎn)介:郭穎( 1982－)，女，碩士，講師，研究方向:消化道腫瘤病理學(xué)，通訊作者，Tel: 0313-4029293，E-mail: guoyingguo2008@163．com

基金項(xiàng)目:河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目( No QN20131078) ;河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目( No ZD20131004)

收稿日期:2015－10－14，修回日期: 2015－11－15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0060－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．013