吳文君，湯孫寅炎，時俊鋒，尹雯雯，曹　殊，朱大龍，畢　艷

( 1.南京大學醫(yī)學院附屬南京市鼓樓醫(yī)院內分泌科，江蘇南京　210008;2．南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院內分泌科，江蘇無錫　214023;3．南京醫(yī)科大學附屬南京市第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京　210012)

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二甲雙胍抑制SREBP-1c改善高脂誘導的骨骼肌胰島素抵抗

吳文君1，2，湯孫寅炎1，時俊鋒3，尹雯雯1，曹殊1，朱大龍1，畢艷1

( 1.南京大學醫(yī)學院附屬南京市鼓樓醫(yī)院內分泌科，江蘇南京210008;2．南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院內分泌科，江蘇無錫214023;3．南京醫(yī)科大學附屬南京市第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京210012)

中國圖書分類號: R322．74; R341; R329．11; R394．2; R458．5; R977. 15

摘要:目的二甲雙胍已成為治療2型糖尿病的一線藥物，前期研究結果提示固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c( sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)抑制胰島素受體底物-1( insulin receptor substrate-1，IRS-1)基因轉錄表達，在高脂誘導骨骼肌胰島素抵抗中起關鍵作用。該研究探討SREBP-1c在二甲雙胍改善高脂誘導骨骼肌胰島素抵抗中的作用及機制。方法經(jīng)500 μmol·L－1PA處理的L6細胞被二甲雙胍( 1、10 mmol·L－1)干預24 h后，采用2-NBDG方法檢測其葡萄糖攝取水平，Western blot檢測SREBP-1c、FAS、p-IRS-1( Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT( Ser473)、AKT的蛋白表達。雙熒光素酶報告基因實驗檢測二甲雙胍對SREBP-1c和IRS-1基因轉錄的調控。CHIP定量分析二甲雙胍處理后SREPB-1c蛋白與IRS-1啟動子區(qū)域的相互作用。結果L6肌管細胞經(jīng)PA處理后，糖攝取下降，SREBP-1c及其下游分子FAS表達升高，胰島素信號通路相關分子p-IRS-1( Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT( Ser473) /AKT表達下降;不同濃度二甲雙胍干預后，L6肌管細胞糖攝取呈劑量依賴性增加，SREBP-1c、FAS表達下降，而p-IRS-1( Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT( Ser473) /AKT表達升高。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示二甲雙胍抑制SREBP-1c啟動子活性，增加IRS-1啟動子活性。CHIP結果顯示二甲雙胍使SREBP-1c蛋白結合到IRS-1啟動子區(qū)域的量下降約30%。結論二甲雙胍通過抑制SREBP-1c改善高脂誘導的骨骼肌胰島素抵抗。

關鍵詞:二甲雙胍;固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c;胰島素受體底物-1;棕櫚酸;骨骼肌細胞;胰島素抵抗

畢艷( 1974－)，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:糖尿病發(fā)病機制，通訊作者，E-mail: biyan@ nju．edu．cn

二甲雙胍在臨床上作為一線降糖藥而被廣泛應用，其具有多種降糖機制，主要是抑制肝糖輸出、促進骨骼肌與脂肪對葡萄糖的攝取、增加血漿胰高糖素樣肽1( GLP-1)水平及作用［1］，但具體分子機制尚不清楚。近年來，對肝臟脂代謝的研究顯示二甲雙胍可通過抑制固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c( SREBP-1c)活性而減輕肝細胞脂質沉積［2－3］。我們前期研究［4］顯示，在高脂誘導骨骼肌胰島素抵抗模型中SREBP-1c通過抑制胰島素受體底物-1( IRS-1)基因轉錄表達而影響IRS-1下游胰島素信號通路的轉導。因此，本研究旨在探討SREBP-1c在二甲雙胍改善高脂誘導骨骼肌胰島素抵抗中的作用及機制。

1　材料與方法

1．1材料大鼠L6成肌細胞(北京協(xié)和細胞中心)，改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基( DMEM)高糖和低糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清( FBS)、0．25%胰酶及雙抗(美國Invitrogen公司)，棕櫚酸( PA)、二甲雙胍( metformin)及胰島素(美國Sigma公司)，RIPA裂解液(中國凱基生物有限公司)，蛋白酶抑制劑(美國Roche公司)，BCA蛋白定量試劑盒(中國凱基生物有限公司)，化學發(fā)光試劑盒、PVDF膜、磷酸甘油醛脫氫酶( GAPDH)抗體、IRS-1和磷酸化( Tyr608/612) IRS-1抗體(美國Millipore公司)，SREBP-1抗體及SREBP-1 CHIP級抗體(美國Santa cruz公司)，AKT和磷酸化( Ser473) AKT抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，脂肪酸合成酶( FAS)抗體(美國BD Biosciences公司)，Lipofectamine 2000 ( 11668-019，美國Invitrogen公司)，SREBP-1c啟動子報告質粒和IRS-1啟動子報告質粒(中國賽哲生物有限公司)，去內毒素質粒抽提試劑盒( D69548-01，美國OMEGA公司)，pPL-TK海腎質粒、pGL3-basic熒光素酶質粒及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒( E1910，美國Promega公司)，蛋白A瓊脂和染色質免疫共沉淀試劑盒( 17-371，美國Millipore公司)。

1．2方法

1．2．1細胞培養(yǎng)及處理復蘇L6細胞，用含10% FBS、100 kU·L－1雙抗的高糖DMEM( H-DMEM)培養(yǎng)基于5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，生長至培養(yǎng)瓶70%～80%密度時傳代。當細胞密度長至60%～70%左右換2% FBS、100 kU·L－1雙抗的HDMEM，隔天換液，誘導6 d后出現(xiàn)明顯肌管。L6肌管細胞予PA( 500 μmol·L－1)與二甲雙胍( 1、10 mmol·L－1)共同干預24 h，設置空白對照組和PA干預組，收取細胞提總蛋白，采用Western blot檢測蛋白表達。

1．2．2細胞葡萄糖攝取測定［5］L6細胞給予相應處理后，磷酸鹽緩沖液( PBS)輕微漂洗，用含100 μmol·l－12N［7硝基苯2乙二酸，34羥氨基］標記葡萄糖( 2-NBDG)的無血清低糖DMEM( L-DMEM)培養(yǎng)基于37℃避光孵育1 h，最后10 min加100 nmol·L－1胰島素干預;預冷PBS漂洗2次，胰酶消化4℃離心收集細胞，預冷PBS重懸，移入流式管，放入流式細胞儀檢測，檢測條件為激發(fā)光485 nm、發(fā)射光520 nm。熒光強度反映細胞葡萄糖攝取量。

1．2．3Western blot L6細胞給予相應處理后，用RIPA裂解液裂解細胞收集蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以20 μg蛋白為上樣量，10% SDS-PAGE膠電泳分離;將蛋白轉至PVDF膜，室溫下用5%牛奶(伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉2. 5 g +50 mL TBST)封閉2 h;用封閉液稀釋一抗至所需濃度，4℃孵育過夜;次日用TBST洗膜5次，即5 min×2次、10 min ×2次、15 min×1次;用TBST液稀釋二抗至所需濃度，室溫孵育搖動2 h;用TBST洗膜5次，即5 min ×2次、10 min×2次、15 min×1次;配ECL發(fā)光液A∶B =1∶1混勻，暗室中進行曝光;將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)Quantity one軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH條帶灰度值為對照計算相對表達量，進行組間比較。

1．2．4雙熒光素酶報告基因檢測接種細胞到24孔板，密度達70%～90%時進行轉染。SREBP-1c啟動子報告質粒或IRS-1啟動子報告質粒1 000 ng及海腎質粒pRL-TK20 ng采用Lipofectamin 2000共轉染L6細胞24 h后，予PA +二甲雙胍處理12 h，同時設置空白對照組和PA干預組，裂解細胞按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書采用Glo-MaxTM20/20光度計檢測讀數(shù)。螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值反映啟動子活性。

1．2．5染色質免疫共沉淀( CHIP)操作按CHIP ( 17－371)試劑盒說明書進行，L6細胞予PA( 500 μmol·L－1)或PA +二甲雙胍( 10 mmol·L－1)共同干預24 h，酶消化法收集細胞后用甲醛于室溫交聯(lián)固定，冰上超聲剪切DNA至200－1000 bp大小;加蛋白A/鮭精DNA瓊脂預清洗1 h，離心沉淀瓊脂，取10 μL上清作為Input;加SREBP-1c抗體及IgG，4℃翻轉過夜，再次加入蛋白A/鮭精DNA瓊脂4℃翻轉1 h，免疫沉淀抗體/轉錄因子復合體，離心沉淀瓊脂，洗滌蛋白A/鮭精DNA復合體;洗脫結合于轉錄因子的DNA，離心柱純化DNA;設計特異性PCR引物( Tab 1)，針對IRS-1啟動子特定區(qū)域進行擴增。PCR程序設置如下: 95℃，30 s; 56℃，30 s; 72℃，30 s; 32個循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統(tǒng)掃描圖象并分析PCR結果。

Tab 1 Primers of IRS-1 promoter regions

用熒光染料法對CHIP樣品進行定量分析，反應體系:模板( 2 μL)、2×SYBR GREEN PCR Master Mix( 10 μL)、正向引物( 2 μmol·L－1，4 μL)、反向引物( 2 μmol·L－1，4 μL)，反應條件: 95℃，15 s; 63℃，1 min; 40個循環(huán)。將Input以1∶4，1∶16，1 ∶64，1∶256等比稀釋后定量繪制標準曲線。所有IP樣品(包括IgG)都以相對應的標準曲線作為參照校準細胞數(shù)量和引物擴增效率所產生的誤差。實時定量PCR所得數(shù)據(jù)根據(jù)以下公式計算:ΔCt = Ct( IP樣品)－Ct( Input)，ΔΔCt =ΔCt(陰性對照)－ΔCt(實驗樣品)，用2 (－ΔΔCt)表示實驗樣品與陰性對照之間的倍數(shù)差異，將IgG標化為1。

1．3統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0軟件包進行統(tǒng)計學分析。各組指標的測定結果均以±s表示，組間差異采用雙因素方差分析進行比較。

2　結果

2．1高脂處理的L6肌管細胞經(jīng)二甲雙胍干預后細胞葡萄糖攝取改善與對照組比較，PA抑制L6細胞攝取葡萄糖;與PA組比較，加用二甲雙胍改善L6細胞攝取葡萄糖，并呈劑量依賴性，提示二甲雙胍改善骨骼肌細胞胰島素抵抗( Fig 1)。

2．2二甲雙胍抑制SREBP-1c表達，改善IRS-1/ AKT通路為進一步明確二甲雙胍改善L6肌管細胞攝取葡萄糖的分子機制，用不同濃度二甲雙胍( 1、10 mmol·L－1)干預經(jīng)PA處理的L6肌管細胞，24 h后收取細胞，采用Western blot檢測蛋白表達。結果顯示PA組SREBP-1c( 68 ku)及其下游分子FAS( 265 ku)表達升高，胰島素信號通路相關分子p-IRS-1( Tyr608/612) ( 170 ku)、IRS-1( 180 ku)、p-AKT( Ser473) /AKT( 60 ku)表達下降，而二甲雙胍組SREBP-1c、FAS蛋白表達呈劑量依賴性抑制，p-IRS-1( Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT( Ser473) /AKT蛋白表達呈劑量依賴性增加( Fig 2)。

Fig 1 Glucose uptake assay in L6 myotubes treated with metformin ( n =9)

2．3二甲雙胍抑制SREBP-1c啟動子轉錄活性

SREBP-1c啟動子報告質粒( pGL3-SREBP-1c)與內參質粒pRL-TK共轉染L6細胞24 h后予PA、二甲雙胍( 1、10 mmol·L－1)處理，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收取細胞檢測熒光素酶。結果顯示:與PA組相比，二甲雙胍呈劑量依賴性抑制SREBP-1c啟動子的轉錄活性( Fig 3)。

Fig 2 Protein expression of SREBP-1c，F(xiàn)AS and IRS-1/AKT pathway in L6 myotubes treated with metformin( n =3)

2．4二甲雙胍降低SREBP-1c與IRS-1啟動子的結合，促進IRS-1基因轉錄應用PA或PA +二甲雙胍處理L6肌管細胞，培養(yǎng)24 h后收取細胞進行染色質免疫共沉淀。以Input等比稀釋后定量繪制標準曲線，沉淀的DNA通過實時定量PCR擴增，計算2－ΔΔCt值進行定量分析。結果顯示:與PA組相比，二甲雙胍( 10 mmol·L－1)使SREBP-1c蛋白與IRS-1啟動子區(qū)域的結合量下降約30%( Fig 4)。

2．5二甲雙胍增加IRS-1啟動子轉錄活性IRS-1啟動子報告質粒( pGL3-IRS-1)與內參質粒pRL-TK共轉染L6細胞24 h后，予PA及二甲雙胍( 1、10 mmol·L－1)干預12 h，裂解細胞檢測熒光素酶。結果顯示:與PA組相比，二甲雙胍呈劑量依賴性升高IRS-1啟動子的轉錄活性( Fig 5)。

3　討論

二甲雙胍為雙胍類口服降血糖藥，具有多種降糖機制，包括延緩葡萄糖由胃腸道的吸收，通過提高胰島素的敏感性而增加外周組織對葡萄糖的利用，以及抑制肝臟的糖原異生［6］。UKPDS［7－9］研究顯示，二甲雙胍應用3年后達到與磺脲類藥物、胰島素相似的降糖效果，而且還降低空腹胰島素，不增加體重，低血糖發(fā)生少，并減少肥胖患者的大血管并發(fā)癥。DPP研究顯示二甲雙胍對糖調節(jié)受損患者尤其合并肥胖者發(fā)生糖尿病有預防作用［10－11］。因此，深入研究二甲雙胍降糖的具體分子機制有助于發(fā)現(xiàn)新的有遠景的分子靶點。

SREBP-1c是屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈家族( bHLH-LZ)的轉錄因子，其無活性前體合成后滯留在粗面型內質網(wǎng)上，當細胞內固醇含量變化時，SREBP-1c前體在SREBP裂解激活蛋白( SCAP)幫助下從內質網(wǎng)轉移到高爾基體，在高爾基體經(jīng)兩種蛋白酶的水解釋放出具有轉錄活性的N端，繼而轉位到細胞核內，啟動靶基因轉錄。SREBP-1c是控制脂肪及脂肪酸合成的關鍵轉錄因子，在脂毒性機制中發(fā)揮重要作用［12］。SREBP-1c表達及活性增高可引起細胞內脂質沉積，損害肝臟、骨骼肌、脂肪組織處理葡萄糖的功能，導致胰島素抵抗。另外，有研究顯示肝臟過表達SREBP-1c可抑制IRS-2基因表達及其下游胰島素信號通路的轉導［13－14］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導的L6肌細胞，SREBP-1c抑制IRS-1啟動子活性及下游的胰島素信號通路轉導［4］。

Fig 3 Impact of metformin on SREBP-1c promoter activity( n =6)

Fig 4 Impact of metformin on the binding of SREBP-1c to the IRS-1 promoter ( n =3)

Fig 5 Impact of metformin on IRS-1 promoter activity( n =6)

本研究結果顯示L6細胞經(jīng)PA處理后葡萄糖攝取下降，加不同濃度二甲雙胍干預后葡萄糖攝取逐漸恢復，SREBP-1c及其下游分子FAS表達呈濃度依賴性下降，而胰島素信號通路關鍵分子IRS-1及其酪氨酸磷酸化水平與AKT磷酸化水平呈濃度依賴性升高，提示二甲雙胍改善骨骼肌胰島素抵抗可能通過抑制轉錄因子SREBP-1c表達而恢復IRS-1的活性;進一步研究表明二甲雙胍通過抑制SREBP-1c啟動子轉錄活性而下調SREBP-1c蛋白表達，繼而使SREBP-1c蛋白與IRS-1啟動子區(qū)域的結合量下降約30%，部分恢復IRS-1基因轉錄和蛋白表達，該研究結果詳細地展現(xiàn)了二甲雙胍通過抑制SREBP-1c改善高脂誘導的骨骼肌胰島素抵抗的具體分子機制，為全面了解二甲雙胍的降糖機制提供了新的證據(jù)，SREBP-1c有望成為降糖藥物研發(fā)的新靶點。

本研究在細胞及分子水平闡述了二甲雙胍作用的具體機制，有助于更好地了解二甲雙胍對糖脂代謝的調節(jié)作用，對二甲雙胍的臨床應用有一定的指導價值，但本研究證據(jù)僅來源于細胞系。為了得到可靠的結論，將來尚需在動物及人體水平進一步研究。

(致謝:本工作在南京市鼓樓醫(yī)院中心實驗室完成，在此致以衷心的感謝! )

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Metformin ameliorates PA-induced skeletal muscle insulin resistance by suppressing SREBP-1c

WU Wen-jun1，2，TANG-SUN yin yan1，SHI Jun-feng3，YIN Wen-wen1，CAO Shu1，ZHU Da-long1，BI Yan1
( 1．Dept of Endocrinology，Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China; 2．Dept of Endocrinology，Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi Jiangsu 214023，China; 3．Dept of Oncology，Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210012，China)

Abstract:AimMetformin has been the first-line oral agent for the treatment of type 2 diabetes．The results from preliminary studies suggested that sterol regulatory element binding protein-1c( SREBP-1c) inhibited the transcription of insulin receptor substrate-1 ( IRS-1)，which plays a key role in PA-induced skeletal muscle insulin resistance．In the current study，we investigated the role and mechanism of SREBP-1c in metformin ameliorating PA-induced skeletal muscle insulin resistance．Methods L6 cells were treated with metformin ( 1，10 mmol·L－1) for 24h in 500 μmol·L－1PA-induced insulin-resistant state and then harvested for protein and glucose uptake assay．Glucose uptake was performed by 2-NBDG method．The protein expression of SREBP-1c，F(xiàn)AS，p-IRS-1( Tyr608/612)，IRS-1，p-AKT ( Ser473) and AKT was detected by western blot．The effects of metformin on SREBP-1c and IRS-1 gene transcription were assessed by a dual-luciferase reporter assay．CHIP assay was performed to examine the binding of SREBP-1c protein to the IRS-1 promoter region by metformin treatment．Results PA treatment decreased glucose uptake in L6 myotubes．The protein expression of SREBP-1c and its downstream molecule FAS was increased significantly after exposure to PA．By contrast，the proteins related to insulin signaling pathway including IRS-1，p-IRS-1( Tyr608/612) and p-AKT ( Ser473) /AKT were decreased significantly．Metformin increased glucose uptake in a dose-dependent manner compared to PA-cultured L6 cells．The SREBP-1c and FAS protein levels were decreased by metformintreatment．Correspondingly，p-IRS-1 ( Tyr608/612)，IRS-1，p-AKT( Ser473) /AKT protein levels were increased significantly．The results from dual-luciferase reporter assay indicated metformin suppressed SREBP-1c promoter activity and enhanced IRS-1 promoter．The results from CHIP assay showed that metformin decreased binding of SREBP-1c protein to the IRS-1 promoter region ( about 30%)．Conclusion Metformin can improve PA-induced muscular insulin resistance by suppressing SREBP-1c．

Key words:metformin; SREBP-1c; IRS-1; palmitate acid; skeletal muscle cell; insulin resistance

作者簡介:吳文君( 1976－)，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:骨骼肌胰島素抵抗，E-mail: wuwenjung@ hotmail．com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 81270906 81500630) ;南京醫(yī)科大學科技發(fā)展基金( No 2013NJMU155)

收稿日期:2015－08－11，修回日期: 2015－11－22

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0055－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．012