吳阿敏，趙宗江，張新雪，楊美娟，楊冠男，苗永輝，徐昌君，黃雅薇

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

糖腎平對(duì)糖尿病腎病KK-Ay小鼠腎臟保護(hù)作用及對(duì)TGF-β1/ Samd6 / BMP7信號(hào)通路影響的研究＊

吳阿敏，趙宗江＊＊，張新雪，楊美娟，楊冠男，苗永輝，徐昌君，黃雅薇

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

目的：本研究主要探討糖腎平對(duì)糖尿病腎?。―KD）KK-Ay小鼠腎臟保護(hù)作用及其對(duì)TGF-β1/ Samd6 / BMP7信號(hào)通路的影響。方法：10只雌性C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組。雌性10周齡KK-Ay小鼠60只，KK鼠料誘導(dǎo)10周后建立糖尿病腎病動(dòng)物模型。模型小鼠按體質(zhì)量和血糖區(qū)組分層隨機(jī)法分為模型組、厄貝沙坦組與糖腎平小、中、大劑量組。厄貝沙坦組，糖腎平小、中、大劑量組均灌胃給藥，正常組、模型組用等體積去離子水灌胃。每4周稱體質(zhì)量和測(cè)24 h尿蛋白定量。實(shí)驗(yàn)第26周，眼球取血并處死小鼠，稱腎臟質(zhì)量、測(cè)血糖，分離血清測(cè)BUN、Scr、TG、MDA、NO和SOD；HE染色和Mallory染色觀察腎組織病理形態(tài)；原位雜交、免疫組化、Western blot檢測(cè)腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA、E-Cadherin mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，各治療組體質(zhì)量、腎質(zhì)量/體質(zhì)量、尿蛋白降低，其中糖腎平中、大劑量組有顯著性差異（P＜0.01）；腎臟病理?yè)p害明顯減輕，F(xiàn)BG、血清BUN、Scr、TG和MDA含量明顯降低（P＜0.01），NO、SOD含量明顯增加（P＜0.01），Samd6、BMP7和E-Cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)量增加，TGF-β1和α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)量減少，其中糖腎平大劑量組有顯著性差異（P＜0.01），糖腎平的治療效果呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠腎臟保護(hù)及逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用，可能與下調(diào)氧化應(yīng)激水平及調(diào)節(jié)TGF-β1/ Samd6 / BMP7信號(hào)通路有關(guān)，這為DKD“腎痿”學(xué)說提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

糖尿病腎病 糖腎平 腎痿 KK-Ay小鼠 TGF-β1/ Samd6 / BMP7通路 腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

目前中國(guó)約7%的成年人患糖尿?。―iabetes Mellitus，DM），人數(shù)高達(dá)0.92億[1]，DM病程持續(xù)10-20年，約1/3的患者會(huì)發(fā)展為糖尿病腎?。―iabetic Kidney Disease，DKD）[2]。DKD治療遠(yuǎn)較一般腎病復(fù)雜，預(yù)后也較差，目前西醫(yī)主要以降低血糖、血脂、血壓及改善微循環(huán)來控制病情，但由于尚無有效的治療藥物，故難以阻止其病程發(fā)展。DKD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，DKD的典型病理改變是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的研究發(fā)現(xiàn)[3]，超過1/3的間質(zhì)成纖維細(xì)胞來源于腎小管上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial-Mesenchymal Trandifferentiation，EMT），腎小管上皮細(xì)胞EMT被認(rèn)為是DKD腎單位功能喪失的一個(gè)關(guān)鍵因素[4]，表現(xiàn)為失去上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-鈣黏素（E-cadherin）而獲得間質(zhì)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-Smooth Muscle Actin，SMA）。TGF-β1/ Samd6 / BMP7信號(hào)通路參與腎小管上皮細(xì)胞EMT[5]。糖腎平是“腎痿”假說[6]指導(dǎo)下的中藥復(fù)方，本課題組前期觀察到糖腎平能夠通過改善足細(xì)胞EMT[7]，維持足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白：腎病蛋白（nephrin）和CD2相關(guān)蛋白（CD2 Associated Protein，CD2AP）的穩(wěn)定性[8]，保護(hù)足細(xì)胞來延緩DKD的病程進(jìn)展。此次實(shí)驗(yàn)采用DKD KK-Ay小鼠模型，觀察糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠的腎臟保護(hù)作用的機(jī)制和對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響，為進(jìn)一步闡釋糖腎平防治DKD的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)藥物

SPF級(jí)健康、雌性10周齡KK-Ay小鼠60只，SPF級(jí)健康、雌性10周齡C57BL/6J小鼠10只（北京華阜康生物科技有限公司，許可證編號(hào)：SCXK京2014-0004），KK鼠料（北京華阜康生物科技有限公司，專利號(hào)：CN102648734A、11003800003551）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于潔凈動(dòng)物櫥（北京文慧凈化設(shè)備廠制造，專利號(hào)：EJ932041477）中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23-25℃，相對(duì)濕度50%-60%。

糖腎平（生黃芪6 g、熟地黃3 g、山萸肉2 g、丹皮3 g、地骨皮3 g、水蛭2 g，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制劑室制備）；厄貝沙坦片（賽諾菲安萬特，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20130118，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130049）。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

液體蛋白抽提試劑盒-II（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)/批號(hào)：P1255/20150309）；BCA法蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)/批號(hào)：P1511/20151511052003）；一抗β-actin（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)/批號(hào)：4970/0011）；TGF-β1（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)/批號(hào)：ab92486/GR253274-1）；Samd6（美國(guó)Novus Biologicals公司， 貨號(hào)/批號(hào)：NBP1-19812/ G22121）；BMP7（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)/批號(hào)：ab54904/GR196216-4）；α-SMA（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)/批號(hào)：ab32575/GR32377-41）；E-Cadherin（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)/批號(hào)：ab76055/GR216035-1）；二抗山羊抗兔（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)/批號(hào)：ab6721/GR231489-1）；山羊抗鼠（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)/批號(hào)：ab6789/GR215715-5）；ECL超敏發(fā)光液（德國(guó)Merck Millipore公司，貨號(hào)/批號(hào)：WBKLS0100/1316802）。

原位雜交探針：TGF-β1（天津?yàn)笊锕こ逃邢薰?，貨?hào)/批號(hào)：BSH0087F/20150521）；Smad6、BMP7、α-SMA、E-Cadherin（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)/批號(hào)：MK2123/01907TW509171 12050VI、MK1787/000600108-101050FH、MK3558 /01906TW50917112059VI、MK1181/01908TW5091 7115050VI），探針序列分別為：TGF-β1：5′-AG CCCTGTATTCCGTCTCCTTGGTTCA-3′；Smad6：5′-TATTCTCGGCTGTCTCCTCCTGACCAGTACAA GCC-3′；BMP7：5′-TGCGGCGCCGCACAGCTTC GTGGCGCTCTG-3′；α-SMA：5′-TGTGAAGAGG AAGACAGCACAGCCCTGGTGTGCGACAATGGCT CT-3′；E-Cadherin：5′-AACGATCCTGACCAGCA GTTCGTTGTTGTCACAGA-3′。

2 方法

2.1 模型制備與分組

C57BL/6J小鼠喂食普通小鼠飼料，作為對(duì)照組；KK-Ay小鼠喂食KK鼠料，自由飲水及進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。KK鼠料誘導(dǎo)10周后，尾靜脈采血，羅氏血糖儀及配套試紙測(cè)空腹血糖（Fasting Blood Glucose，F(xiàn)BG）≥16.7 mmol·L-1，并代謝籠收集24 h尿液，當(dāng)24 h尿蛋白≥0.4 mg確認(rèn)為DKD動(dòng)物模型建立。

將造模成功的小鼠按照按體質(zhì)量和FBG分層隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組、糖腎平小劑量組、糖腎平中劑量組、糖腎平大劑量組。厄貝沙坦組按人臨床用藥劑量10倍（每日25 mg·kg-1）灌胃給藥；糖腎平小、中、大劑量組分別按人臨床用藥劑量5倍（每日44 mg·kg-1）、10倍（每日88 mg·kg-1）、20倍（每日176 mg·kg-1）灌胃給藥；對(duì)照組、模型組小鼠用等體積去離子水灌胃，灌胃劑量按0.1 mL/10 g體質(zhì)量計(jì)算，用藥16周。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般情況

觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、二便、皮毛及活動(dòng)情況等。

2.2.2 器官系數(shù)

每4周稱量小鼠體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)第26周，眼球取血后，摘取腎臟并稱重，計(jì)算各組腎質(zhì)量與體質(zhì)量比。

2.2.3 24 h尿蛋白定量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)第10、14、18、22、26周末分別收集24 h尿液，用500 μL液體蛋白抽提試劑盒-II抽提100 μL尿液，排除尿酸等雜質(zhì)干擾，用BCA法96孔板測(cè)蛋白濃度：將25 μL蛋白樣品與200 μL工作液混合，37℃溫箱孵育30 min，測(cè)562 nm光密度值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。

2.2.4 生化指標(biāo)

全血測(cè)FBG；小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，摘眼球取血，4℃靜置2 h，4℃2 500 rpm離心20 min，吸取上層血清，-20℃保存，用7150全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清BUN、Scr、TG、MDA、NO和SOD的含量。

2.2.5 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化、原位雜交

摘取腎臟，固定后包埋。將腎組織石蠟切片行常規(guī)HE染色、Mallory染色及免疫組化；用DEPC水處理腎組織，行原位雜交，具體步驟參照文獻(xiàn)[9]。

2.2.6 Western blot測(cè)定腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-cadherin的蛋白表達(dá)

一抗稀釋濃度分別為TGF-β11：2 000、Samd6 1∶900、BMP7 1∶2 000、α-SMA 1∶2 000、E-cadherin 1∶1 000、β-actin 1∶1 000。電泳80 V、30 min，指示劑待到達(dá)濃縮膠下緣時(shí)，調(diào)節(jié)電壓為120 V繼續(xù)電泳1.5 h終止電泳、60 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h。具體步驟參照文獻(xiàn)[7]。

2.3 圖像分析

采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)免疫組化及原位雜交結(jié)果進(jìn)行圖像分析，用Image J圖像分析軟件分析Western blot圖像。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析、多重比較用LSD法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

KK-Ay小鼠喂養(yǎng)KK鼠料后，精神漸顯不佳，皮毛欠光澤，飲食飲水量和排尿排便量均增加，行動(dòng)減少、稍見遲緩、體型圓潤(rùn)、體質(zhì)量增加明顯。實(shí)驗(yàn)第10周，部分小鼠出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥，如潰瘍、尿路感染等。與模型組比較，各治療組小鼠一般狀態(tài)有所改善，且糖尿病并發(fā)癥小鼠數(shù)量相對(duì)較少，糖腎平大劑量組最為明顯。每組各死亡4只，予以剔除。

3.2 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠體質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）；糖腎平治療16周后體質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)，其中糖腎平大劑量組體質(zhì)量下降最為明顯（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)第26周取材后，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，糖腎平小、中、大劑量組腎質(zhì)量/體質(zhì)量均明顯降低（P＜0.01），其中糖腎平大劑量組腎質(zhì)量/體質(zhì)量降低最為明顯。詳見表1。

表1 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠體質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量的影響（±s，n=8）

表1 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠體質(zhì)量和腎質(zhì)量/體質(zhì)量的影響（±s，n=8）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

體質(zhì)量/g腎質(zhì)量/體質(zhì)量/mg·g-1第10周第14周第18周第22周第26周第26周對(duì)照組21.70±0.27 22.15±0.45 24.41±0.24 25.45±0.38 25.75±0.38 2.75±0.09模型組46.62±0.65 49.36±1.07**50.93±0.54**52.29±0.58**53.14±0.64**6.92±0.05**厄貝沙坦組47.08±0.85 49.06±0.68**49.00±0.41**#48.94±0.64**##48.81±0.83**##4.75±0.11**##糖腎平小劑量組47.00±0.81 49.38±0.91**51.06±0.53**△51.13±0.47**△50.69±0.47**#△5.23±0.08**##△△糖腎平中劑量組46.50±0.85 49.44±0.79**50.25±0.51**50.31±0.53**49.75±0.56**##4.84±0.07**##糖腎平大劑量組46.67±0.83 48.75±0.56**49.38±0.40**#49.69±0.39**#48.69±0.45**##4.68±0.08**##F值159.68262.61753.37497.44374.81275.40組別

3.3 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠24 h尿蛋白的影響

與對(duì)照組相比，模型組24 h尿蛋白定量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，糖腎平中、大劑量組24 h尿蛋白定量明顯降低（P＜0.01），糖腎平小劑量組24 h尿蛋白定量降低（P＜0.05），詳見表2。

3.4 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠FBG、血清BUN、Scr、TG、MDA、NO和SOD的影響

實(shí)驗(yàn)第26周，與對(duì)照組比較，模型組FBG明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，糖腎平中、大劑量組FBG明顯降低（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組血清BUN、Scr、TG、MDA含量顯著升高，NO、SOD含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，血清BUN、Scr、TG、MDA含量降低，NO、SOD含量增高，其中糖腎平大劑量組血清BUN、MDA、NO、SOD改變有顯著性差異（P＜0.01），糖腎平大劑量降低血清Scr作用優(yōu)于厄貝沙坦。詳見表3、表4。

表2 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠24 h尿蛋白的影響/mg（±s，n=8）

表2 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠24 h尿蛋白的影響/mg（±s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別第10周第14周第18周第22周第26周對(duì)照組0.02±0.00 0.02±0.00 0.02±0.00 0.09±0.02 0.14±0.02模型組3.40±0.05 4.48±0.05**5.36±0.05**8.50±0.11**10.50±0.18**厄貝沙坦組3.42±0.06 3.80±0.05**##4.00±0.06**##6.88±0.14**##8.88±0.14**##糖腎平小劑量組3.42±0.05 4.40±0.05**△△5.25±0.06**△△7.70±0.19**#△9.88±0.19**#△△糖腎平中劑量組3.31±0.05 3.86±0.06**##△4.16±0.07**##△7.46±0.14**##△8.51±0.29**##△△糖腎平大劑量組3.33±0.05 3.69±0.05**##3.88±0.05**##6.99±0.18**##6.64±0.16**##F值515.29 773.72 890.08 355.37 296.40

表3 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠FBG及血清BUN、Scr的影響（±s）

表3 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠FBG及血清BUN、Scr的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組比較，△P＜0.05。

組別n FBG BUN/mmol·L-1Scr/μmol·L-1第10周第26周對(duì)照組10 4.50±0.16 4.30±0.13 5.92±0.34 48.36±1.67模型組8 28.80±0.80**21.70±2.56**9.70±0.62**68.77±1.05**厄貝沙坦組8 29.00±0.84**16.20±1.85**#6.86±0.45##62.46±1.37**#糖腎平小劑量組8 28.60±1.72**20.80±1.50**7.63±0.17*#△65.17±1.43**糖腎平中劑量組8 28.10±1.02**15.30±1.66**#6.70±0.36##63.79±3.30**糖腎平大劑量組8 28.50±1.28**15.70±2.34**#6.33±0.52##60.21±1.60**#F值103.80 13.74 9.71 15.21

表4 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠血清TG、MDA、NO、SOD含量的影響（±s）

表4 糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠血清TG、MDA、NO、SOD含量的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組比較，△P＜0.05。

組別n TG/mmol·L-1MDA/nmol·mL-1NO/μmol·L-1SOD/μg·mL-1對(duì)照組10 0.71±0.06 5.54±0.12 43.57±0.52 77.49±1.62模型組8 3.19±0.47**11.98±0.62**22.11±1.17**52.09±0.55**厄貝沙坦組8 1.58±0.10*##6.90±0.07**##32.02±2.06**##75.17±2.12##糖腎平小劑量組8 2.43±0.15**#7.45±0.32**##△30.66±1.71**##△67.84±1.20**##△糖腎平中劑量組8 2.19±0.14**#7.07±0.17**##37.24±1.80*##68.11±1.29**##△糖腎平大劑量組8 2.04±0.27**#6.43±0.14*##37.52±1.33*##76.56±2.20##F值15.46 63.36 24.74 31.20

圖1 各組腎組織HE染色（×400）

圖2 各組腎組織Mallory染色（×400）

圖3 糖腎平對(duì)各組腎組織TGF-β1mRNA表達(dá)的影響（×400）

3.5 糖腎平對(duì)腎組織病理形態(tài)的影響

光鏡下見對(duì)照組小鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常；與對(duì)照組相比，模型組可見腎小球肥大、重度系膜細(xì)胞增生、大量膠原纖維，腎小球壁層上皮細(xì)胞增生，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比，糖腎平大劑量組和厄貝沙坦組系膜細(xì)胞輕度增生，少量膠原纖維，間質(zhì)輕度纖維化，糖腎平小、中劑量組腎間質(zhì)纖維化有一定減輕，中等量膠原纖維，系膜細(xì)胞中輕度增生，間質(zhì)中等量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)輕中度纖維化。見圖1、圖2。

3.6 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、Bmp7、α-SMA和E-Cad mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，原位雜交結(jié)果顯示模型組腎小管上皮細(xì)胞Samd6、Bmp7和E-Cad mRNA表達(dá)明顯減少，TGF-β1和α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加，均為棕黃色顆粒（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組Samd6、Bmp7和E-Cad mRNA的表達(dá)量明顯增加，TGF-β1和α-SMA mRNA的表達(dá)明顯減少，其中糖腎平大劑量組有顯著性差異（P＜0.01），糖腎平的治療效果呈劑量依賴關(guān)系。見表5及圖3-圖7。

3.7 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞大量表達(dá)Samd6、BMP7和E-cadherin，少量表達(dá)TGF-β1和α-SMA，均為棕黃色顆粒顯色；與對(duì)照組相比，模型組Samd6、BMP7和E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少，TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組Samd6、BMP7和E-cadherin的表達(dá)明顯增加，TGF-β1和α-SMA的表達(dá)量明顯減少，其中糖腎平大劑量組有顯著性差異（P＜0.01），糖腎平的治療效果呈劑量依賴關(guān)系。詳見表6及圖8-圖12。

表5 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、Bmp7、α-SMA、E-Cad mRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）

表5 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、Bmp7、α-SMA、E-Cad mRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別TGF-β1mRNA Samd6 mRNA Bmp7 mRNAα-SMA mRNA E-Cad mRNA對(duì)照組0.17±0.01 0.38±0.00 0.33±0.01 0.14±0.01 0.24±0.01模型組0.35±0.00**0.23±0.00**0.14±0.01**0.26±0.01**0.13±0.01**厄貝沙坦組0.27±0.01**##0.36±0.00*##0.23±0.02**##0.19±0.00*##0.18±0.01**##糖腎平小劑量組0.30±0.01**△△0.31±0.00**##△△0.18±0.01**#△0.21±0.01**#0.16±0.00**#糖腎平中劑量組0.28±0.01**##△0.32±0.00**##△0.21±0.01**#0.19±0.01**##0.16±0.01**#糖腎平大劑量組0.25±0.01**##0.34±0.00**##0.24±0.02**##0.19±0.01**##0.19±0.01**##F值54.47 389.04 20.09 17.41 19.52

Western blot顯示對(duì)照組腎組織高表達(dá)Samd6、BMP7和E-cadherin，少量表達(dá)TGF-β1和α-SMA；與對(duì)照組相比，模型組腎組織Samd6、BMP7和E-cadherin表達(dá)明顯減少，TGF-β1和α-SMA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，各治療組Samd6、BMP7和E-cadherin的表達(dá)量明顯增加，TGF-β1和α-SMA的表達(dá)量明顯減少，其中糖腎平大劑量組有顯著性差異（P＜0.01），糖腎平的治療效果呈劑量依賴關(guān)系。詳見表7及圖13。

圖4 糖腎平對(duì)各組腎組織Smad6 mRNA表達(dá)的影響（×400）

圖5 糖腎平對(duì)各組腎組織Bmp7 mRNA表達(dá)的影響（×400）

圖6 糖腎平對(duì)各組腎組織α-SMA mRNA表達(dá)的影響（×400）

圖7 糖腎平對(duì)各組腎組織E-Cad mRNA表達(dá)的影響（×400）

4 討論

KK-Ay小鼠是一種基因（Ay）突變的2型DM動(dòng)物模型[10]，具有遺傳信息完整、個(gè)體差異小、繁育時(shí)間短、可操作性較強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。遺傳因素和飲食因素共同參與了KK-Ay小鼠糖尿病的發(fā)生，與人類2型DM極為相似。有研究顯示，高脂飼料誘導(dǎo)的18周齡KK-Ay小鼠出現(xiàn)高血糖、24 h尿蛋白排泄率增加等病變，腎質(zhì)量和體質(zhì)量均明顯增加[11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到模型組DKD KK-Ay小鼠體質(zhì)量明顯增加，24 h尿蛋白定量明顯升高，氧化應(yīng)激水平升高，腎臟病理顯示系膜細(xì)胞重度增生、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)等。

在DKD病理過程中，眾多細(xì)胞因子和信號(hào)通路參與腎小管上皮細(xì)胞EMT，在一定條件下這一過程是可逆的[12]。TGF-β1/Samd6/BMP7信號(hào)通路參與EMT過程，TGF-β1具有促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和參與炎癥反應(yīng)等作用，從多個(gè)方面、多角度加快DKD病理進(jìn)程。Smads蛋白家族是TGF-β1受體激酶的底物，是TGF-β1信號(hào)通路中一類非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子。Smad6是抑制型Smad，可以在C末端5個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域（Pro-Leu-Asp-Leu-Ser，PLDLS）序列介導(dǎo)下與C末端結(jié)合蛋白（C-terminal Binding Protein，CtBP）結(jié)合，形成Smad6-CtBP復(fù)合物，并由此抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號(hào)通路[13,14]。BMP7能通過抑制EMT，抑制腎小管上皮細(xì)胞I型膠原和α-SMA的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)EMT[15]。BMP7及Smad6在DKD腎纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要的反饋性抑制作用，是重要的腎臟保護(hù)因子。α-SMA和E-Cadherin是常見的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物和上皮細(xì)胞標(biāo)志物[12,15]。

表6 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（±s，n=8）

表6 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（±s，n=8）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組比較，△P＜0.05。

組別TGF-β1Samd6 BMP7α-SMA E-Cadherin對(duì)照組0.15±0.01 0.28±0.01 0.26±0.01 0.14±0.01 0.26±0.01模型組0.28±0.01**0.15±0.01**0.14±0.01**0.28±0.01**0.13±0.01**厄貝沙坦組0.19±0.01*##0.22±0.01**##0.21±0.01*##0.20±0.01**##0.20±0.01**##糖腎平小劑量組0.22±0.01**##0.20±0.00**#0.18±0.01**#△0.23±0.01**##△0.17±0.01**#△糖腎平中劑量組0.20±0.01*##0.21±0.01**#0.20±0.01**##0.21±0.01**##0.19±0.01**#糖腎平大劑量組0.19±0.01*##0.22±0.01*##0.21±0.01**##0.20±0.01**##0.20±0.01**##F值13.92 12.96 15.88 23.92 19.24

圖8 糖腎平對(duì)各組腎組織TGF-β1蛋白表達(dá)的影響（×400）

圖9 糖腎平對(duì)各組腎組織Samd6蛋白表達(dá)的影響（×400）

圖10 糖腎平對(duì)各組腎組織BMP7蛋白表達(dá)的影響（×400）

趙宗江教授對(duì)DKD有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和研究經(jīng)歷，對(duì)其病因病機(jī)和辨證論治具有獨(dú)特見解，在《素問·痿論》、《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》和《華佗神醫(yī)秘傳》等論著并參照現(xiàn)代科學(xué)研究技術(shù)的基礎(chǔ)上，提出“腎痿”假說，在此基礎(chǔ)上指導(dǎo)組方應(yīng)用于臨床治療，并對(duì)糖腎平治療DKD的機(jī)制展開了研究[7-9]。本虛標(biāo)實(shí)為DKD基本病機(jī)，本虛是指氣血陰陽(yáng)虧虛，標(biāo)實(shí)指兼挾癥，如痰飲、瘀血、水濕、濁毒等，貫穿DKD全程。治療要以補(bǔ)虛扶正為本，以期調(diào)整臟腑氣血陰陽(yáng)平衡，輔以祛邪排毒、活血化瘀。“腎痿”的病機(jī)涉及眾多臟腑，病位在肝、脾、腎，以腎為主。糖腎平有滋補(bǔ)肝腎、益氣固精的功效，并能活血化瘀通腎絡(luò)，其特點(diǎn)為補(bǔ)而不滯、祛瘀而不傷正，治療DKD之氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)者為宜[16]。方中黃芪為君，熟地、山萸肉為臣，共奏固攝精微、補(bǔ)益肝腎、益氣消腫之功；丹皮、地骨皮為佐，兼去虛熱；水蛭為使，活血通經(jīng)，以引諸藥直達(dá)腎絡(luò)。

圖11 糖腎平對(duì)各組腎組織α-SMA蛋白表達(dá)的影響（×400）

圖12 糖腎平對(duì)各組腎組織E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（×400）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠血清MDA的含量顯著增加，NO、SOD的含量顯著降低，處于氧化應(yīng)激激活狀態(tài)。Gomes等[17]研究發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞MDA含量明顯增加，反映大量脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)物堆積、細(xì)胞嚴(yán)重受損，SOD含量明顯下降，抗氧化酶活性降低，清除過氧化產(chǎn)物的能力也隨之下降，提示高糖可以刺激腎小管上皮細(xì)胞損傷。糖腎平小、中、大劑量組小鼠血清MDA的含量下降，NO、SOD的含量升高，糖腎平能夠通過改善DKD KK-Ay小鼠體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，減輕腎臟的損傷，減少尿蛋白的產(chǎn)生，從而延緩DKD病程的進(jìn)展。糖腎平小、中、大劑量組Samd6和BMP7 mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯增加，TGF-β1mRNA及蛋白的表達(dá)量明顯減少，并能夠減少間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)，增加上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA及蛋白的表達(dá)，且糖腎平的治療效果呈劑量依賴關(guān)系，糖腎平大劑量組療效最佳。由此可見，糖腎平對(duì)DKD KK-Ay小鼠的腎臟保護(hù)及逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞EMT作用，延緩了DKD的發(fā)展，為豐富和發(fā)展DKD“腎痿”學(xué)說提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，至于糖腎平其他作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

表7 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

表7 糖腎平對(duì)腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與糖腎平大劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別TGF-β1Samd6 BMP7α-SMA E-Cadherin對(duì)照組0.59±0.01 0.96±0.01 0.80±0.01 0.67±0.00 0.84±0.08模型組1.02±0.03**0.63±0.02**0.23±0.01**0.96±0.01**0.47±0.01**厄貝沙坦組0.65±0.03##0.88±0.03##0.68±0.02**##0.77±0.03*##0.74±0.01**##糖腎平小劑量組0.90±0.02**#△△0.74±0.05**#△0.43±0.01**##△△0.96±0.02**△△0.53±0.01**#△△糖腎平中劑量組0.71±0.04*##0.83±0.05*#0.61±0.03**##0.84±0.03**#0.61±0.02**##△△糖腎平大劑量組0.67±0.01##0.89±0.02##0.60±0.01**##0.78±0.02*##0.71±0.01**##F值39.31 13.62 170.21 31.82 144.93

圖13 糖腎平對(duì)各組腎組織TGF-β1、Samd6、BMP7、α-SMA和E-Cadherin蛋白表達(dá)的影響

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Renoprotective Effects ofTangshenpingon TGF-β1/ Samd6 / BMP7 Signaling Pathway in KK-Ay Mice with Diabetic Kidney Disease

Wu Amin, Zhao Zongjiang, Zhang Xinxue, Yang Meijuan, Yang Guannan, Miao Yonghui, Xu Changjun, Huang Yawei
(School of Basic Medical Science, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This study aimed to explore the renoprotective effects of Tangshenping on TGF-β1/ Samd6 / BMP7 signaling pathway in KK-Ay mice with diabetic kidney disease (DKD). Ten female C57BL/6J mice were made up for the control group. Sixty female 10-week-old KK-Ay mice were used to establish the animal model of diabetic kidney disease with 10-week special food intake. Mice were randomly divided into the model group, the irbesartan group and the Tangshenping low-, medium- and high-dose groups depending on their body weight and blood glucose levels. The mice of the irbesartan group and Tangshenping low-, medium- and high-dose groups were intragastrically administered with irbesartan and Tangshenping, respectively, while the mice of the control group and the model group were treated with deionized water with the equal volume. 24 h urine protein quantification and body weight were tested every 4 weeks. At the end of the 26thweek, all the mice were sacrificed and the biochemical indicators, such as serum BUN, SCR, TG, MDA, SOD and NO were measured; while HE staining and Mallory staining were used to observe the pathological morphology of the kidney tissues, and in situ hybridization, immunohistochemistry and western blot to detect TGF-β1, Samd6, BMP7,α-SMA, E-cadherin mRNA and protein expressions in the renal tissues. As a result, compared with the model group, it was found that the body weight, the ratio of kidney weight to body weight, and 24 h albuminuria in all the treatment groups were reduced, and significant differences showed between Tangshenping medium- and high-dose groups (P ＜ 0.01); renal pathological damage was improved, the contents of FBG, serum BUN, Scr, TG and MDA were decreased significantly (P ＜ 0.01), while serum NO and SOD increased (P ＜ 0.01); the protein and mRNA expressions of Samd6, BMP7 and E-cadherin were enhanced, while the expressions of TGF-β1andα-SMA attenuated. These changes were especially obvious in the Tangshenping high-dose group (P ＜ 0.01). Moreover, the therapeutic effect of Tangshenping was dose dependent. In conclusion, it was demonstrated that Tangshenping protected and reversed the epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells in DKD KK-Ay mice, which may be achieved via a reduction in oxidative stress and the regulation of TGF-β1/Samd6/BMP7 signaling pathway. This study provided new experimental evidence for the theory of "kidney impotence" in DKD.

Diabetic kidney disease, Tangshenping, consumptive kidney disease, KK-Ay mice, TGF-β1/ Samd6 /BMP7 signaling pathway, epithelial-mesenchymal transdifferentiation of renal tubular epithelial cells

10.11842/wst.2016.08.018

R2-031

A

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-04-28

修回日期：2016-06-02

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81373831）：基于“腎痿”組方的糖腎平干預(yù)糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的分子機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：趙宗江。

＊＊ 通訊作者：趙宗江，本刊編委，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治糖尿病腎病的機(jī)制研究。