馬宏達(dá)，崔英宇，高　軍，王琳琳，史國兵

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 110016

?

·藥學(xué)研究·

復(fù)方青黛散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馬宏達(dá)，崔英宇，高軍，王琳琳，史國兵*

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽 110016

[摘要]目的建立復(fù)方青黛散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用TLC法對本制劑中青黛、牛黃、黃柏、甘草、冰片進(jìn)行薄層鑒別。采用HPLC法對鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測定：以Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(40∶60) (每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸鈉)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為265 nm。結(jié)果薄層鑒別斑點(diǎn)清晰、分離較好，陰性對照無干擾；鹽酸小檗堿在0.002～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 6)，平均加樣回收率為100.31%，RSD=1.57% (n=6)。結(jié)論方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，能有效控制復(fù)方青黛散的質(zhì)量，為提高復(fù)方青黛散的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]復(fù)方青黛散；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；鹽酸小檗堿；薄層色譜法；高效液相色譜法

0引言

復(fù)方青黛散由青黛、黃柏和甘草等九味中藥組成，具有清熱解毒、止痛消腫的功效。用于口腔炎、口腔潰瘍。本方收載于《中國人民解放軍藥品制劑規(guī)范》中，目前該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，難以全面控制制劑質(zhì)量。本研究旨在提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要對黃柏、甘草、冰片、牛黃、青黛進(jìn)行定性鑒別；以鹽酸小檗堿為指標(biāo)，采用HPLC法測定鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果顯示，建立的方法可用于復(fù)方青黛散的質(zhì)量控制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器與試劑

1.1儀器創(chuàng)新通恒LC3000型高效液相色譜儀(UV檢測器)，島津紫外可見分光光度計(jì)(UV-1700)，電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號：BT125D]，數(shù)控超聲鍋提取器 (昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ3200DB)。

1.2試藥與試劑復(fù)方青黛散(批號：20130805、20130909、20130927)自制，各藥材陰性樣品自制；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212)，靛藍(lán)對照品(批號：110716-201111)，靛玉紅對照品(批號：110717-200204)，豬去氧膽酸對照品(批號：100087-200610)，膽酸對照品(批號：100078-200414)，黃柏對照藥材(批號：121510-201105)，甘草對照藥材(批號：120904-201117)；冰片對照品(批號：110743-200905)，所有對照品和對照藥材均由中國食品藥品檢定研究院提供。水為重蒸水(自制)，乙腈為色譜純(購自Sigma公司)，磷酸(沈陽沈一精細(xì)化學(xué)品有限公司)，十二烷基磺酸鈉(汕頭市光華化學(xué)廠)。

2方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

2.1.1青黛的TLC鑒別[1-2]取復(fù)方青黛散0.5 g，加二氯甲烷5 mL，超聲提取10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。分別取靛藍(lán)和靛玉紅對照品適量，用少量的二氯甲烷將其溶解，得到混合對照品溶液(濃度均為1 mg/mL)。再取青黛陰性樣品0.5 g，加二氯甲烷5 mL，超聲提取10 min，濾過，濾液作為青黛陰性樣品溶液。分別吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一張含硅膠G薄層板上，同時(shí)以二氯甲烷-乙酸乙酯(10∶1)進(jìn)行配制展開劑，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入帶有展開劑的展開槽中展開，待樣品完全展開后，取出，晾干。供試品薄層色譜中，在與對照品薄層色譜相應(yīng)的位置上，有顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性樣品不干擾青黛的薄層鑒別(圖1)。此外，3批樣品的供試品薄層色譜中，在與對照品薄層色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的斑點(diǎn)(圖2)。

圖1　青黛的薄層色譜鑒別(專屬性)

圖2　青黛的薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.1.2牛黃的TLC鑒別[3]取復(fù)方青黛散1 g，加甲醇10 mL，超聲提取15 min，濾過，蒸干濾液，用5 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。再分別精密稱取膽酸、豬去氧膽酸對照品，用甲醇溶解，制成兩者濃度均為1 mg/mL的對照品溶液。再取牛黃陰性樣品1 g，加甲醇10 mL，超聲提取15 min，濾過，蒸干濾液，用5 mL甲醇溶解，得到牛黃陰性樣品溶液。分別吸取上述溶液各4 μL，點(diǎn)于同一張含硅膠G的薄層板上，同時(shí)以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸(10∶1∶1)配制展開劑，將點(diǎn)好的薄層板放入事先已放入展開劑的展開槽中展開，待完全展開后，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液的顯色劑，將硅膠G板放于105 ℃下，直至薄層板斑點(diǎn)顯色清晰為止。供試品的薄層色譜中，在與膽酸、豬去氧膽酸對照品薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(圖3)。此外，3批樣品的供試品薄層色譜中，在與膽酸、豬去氧膽酸對照品的薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(圖4)。

圖3　牛黃的薄層色譜鑒別(專屬性)

圖4　牛黃的薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.1.3黃柏的TLC鑒別[4-5]取復(fù)方青黛散1.5 g，加入5 mL甲醇，超聲處理15 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取黃柏對照藥材0.1 g，加入5 mL甲醇，超聲處理15 min，濾過，制成對照藥材溶液。再精密稱取鹽酸小檗堿對照品，用甲醇將其溶解，制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。再取黃柏陰性樣品1.5 g，加入5 mL甲醇，超聲處理15 min，濾過，得到黃柏陰性樣品溶液。分別吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一張含硅膠G薄層板，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-冰醋酸(8∶1∶3∶1)的配比試劑為展開劑，將薄層板放入展開槽內(nèi)展開，取出，晾干，并且將已跑完的薄層板放在紫外光燈(365 nm)下觀察。供試品的薄層色譜中，在與黃柏對照藥材的薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)；并且在與鹽酸小檗堿對照品的薄層色譜相應(yīng)位置上，顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照樣品不干擾黃柏的薄層鑒別(圖5)。此外，3批樣品的供試品薄層色譜中，在與黃柏對照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)；并且在與鹽酸小檗堿對照品的薄層色譜相應(yīng)位置上，顯現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)(圖6)。

圖5　黃柏的薄層色譜鑒別(專屬性)

圖6　黃柏的薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.1.4甘草的TLC鑒別[6-7]取復(fù)方青黛散3 g，加60 mL石油醚(60～90 ℃)，進(jìn)行加熱回流提取，提取60 min，濾過，棄去濾液，在藥渣中加入50 mL甲醇，再次進(jìn)行加熱回流提取60 min，濾過，得到濾液，把濾液蒸干，再用5 mL甲醇將殘?jiān)芙猓玫焦┰嚻啡芤?。另取甘草對照藥? g，按照上述甘草供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，得到對照品藥材溶液。再取甘草陰性樣品3 g，加60 mL石油醚(60～90 ℃)，進(jìn)行加熱回流提取，提取60 min，將其濾過，棄去濾液，在藥渣中加入50 mL甲醇，再次進(jìn)行加熱回流提取60 min，濾過，得到濾液，把濾液蒸干，再用5 mL甲醇將殘?jiān)芙猓玫礁什蓐幮詷悠?。吸取上述溶液? μL，分別點(diǎn)在同一張含有硅膠G的薄層板上，展開劑配制成乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(16∶1∶1∶2)，展開，取出，自然晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，把顯色后的薄層板放于105 ℃下，直至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品的薄層色譜中，在與甘草對照藥材的薄層色譜相應(yīng)位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(圖7)。此外，3批樣品的供試品薄層色譜中，在與甘草對照藥材的薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(圖8)。

圖7　甘草的薄層色譜鑒別(專屬性)

圖8　甘草的薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.1.5冰片的TLC鑒別[8-9]取復(fù)方青黛散0.2 g，加入30 mL二氯甲烷，超聲處理，提取30 min，濾過，得到供試品溶液。精密稱取冰片對照品，加適量二氯甲烷超聲使溶解，得到濃度為0.25 mg/mL的對照品溶液。再取冰片陰性樣品0.2 g，加入30 mL二氯甲烷，超聲處理，提取30 min，濾過，得到冰片陰性樣品。分別吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)于同一張硅膠G薄層板上，配制成以環(huán)己烷-乙酸乙酯(5∶1)為展開劑，將薄層板放入展開缸中展開，展開后將其取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑，將顯色后的薄層板放于105 ℃下，加熱直至斑點(diǎn)顯現(xiàn)清楚。供試品薄層色譜中，在與冰片對照品薄層色譜相應(yīng)位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(圖9)。此外，3批樣品的供試品薄層色譜中，在與冰片對照品的薄層色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)(圖10)。

圖9　冰片的薄層色譜鑒別(專屬性)

圖10　冰片的薄層色譜鑒別(重復(fù)性)

2.2HPLC[10-11]

2.2.1色譜條件本實(shí)驗(yàn)選用C18色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸(40∶60) (每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸鈉)為流動(dòng)相；在265 nm條件下進(jìn)行檢測；以1 mL/min的流速進(jìn)行試驗(yàn)。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于3 000。

2.2.2溶液的制備①鹽酸小檗堿對照品：取鹽酸小檗堿對照品，精密稱定，先用少量甲醇將其溶解，得到濃度為20 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品。②復(fù)方青黛散供試品：精密稱取復(fù)方青黛散約0.1 g，將復(fù)方青黛散放在具塞錐形瓶中，再將50 mL甲醇加入錐形瓶中，密塞，稱定重量，再進(jìn)行超聲提取，處理30 min，放冷，再稱定其重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，將其搖勻，濾過，得到復(fù)方青黛散供試品。③陰性對照樣品溶液：取按處方除去黃柏的陰性樣品0.1 g，按上述供試品溶液配制方法進(jìn)行配制，得到陰性對照樣品。

2.2.3專屬性試驗(yàn)取黃柏陰性樣品溶液、復(fù)方青黛散供試品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液，精密吸取各溶液20 μL，進(jìn)行分析，結(jié)果見圖11。

圖11　鹽酸小檗堿液相色譜圖

結(jié)果顯示，黃柏陰性對照不干擾黃柏中鹽酸小檗堿的測定，且鹽酸小檗堿與其他雜質(zhì)的分離度均>1.5，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)均不低于3 000，表明此種方法的專屬性很好。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取20 μL濃度分別為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.10 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液，注入HPLC，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，測定各自對照品的峰面積，進(jìn)行線性回歸，橫坐標(biāo)為鹽酸小檗堿對照品的濃度(mg/mL)、縱坐標(biāo)為峰面積值，得到回歸方程：Y=2×107X-13 812，r=0.999 6。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在0.002～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn)精密吸取20 μL鹽酸小檗堿對照品(濃度為20 μg/mL)，按照上述色譜條件進(jìn)行分析，將鹽酸小檗堿對照品連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄6次色譜峰的峰面積，計(jì)算RSD，測得峰面積值的RSD為1.85% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取復(fù)方青黛散樣品約0.1 g，精密稱定，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，分別在0、2、4、6、8、10 h測定各自樣品中鹽酸小檗堿峰面積，測得峰面積值的RSD為2.07% (n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取復(fù)方青黛散樣品約0.1 g(共6份)，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，測定每份復(fù)方青黛散樣品中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果顯示，6份樣品中鹽酸小檗堿的平均含量為7.739 3 mg/g，RSD=1.31% (n=6)，結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn)取復(fù)方青黛散樣品約0.055 g (共6份)，精密稱定，分別精密加入濃度為0.2 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液各2.2 mL(0.44 mg)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，求得鹽酸小檗堿的回收率。結(jié)果顯示，復(fù)方青黛散樣品中鹽酸小檗堿的平均回收率為100.31%，RSD=1.58% (n=6)，結(jié)果見表1。

表1　回收率試驗(yàn)

2.2.9樣品含量測定取3個(gè)批號的復(fù)方青黛散，按照“2.2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行供試品溶液的配制，測得每份復(fù)方青黛散中指標(biāo)性成分鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

表2　三批樣品含量測定結(jié)果

3討論

3.1薄層鑒別本研究結(jié)果顯示，各鑒別方法的專屬性及重復(fù)性良好，Rf值在0.2～0.8范圍內(nèi)，且展開劑簡單易行，可用于青黛、牛黃、黃柏、甘草、冰片的鑒別方法。

3.2含量測定本實(shí)驗(yàn)在供試品溶液制備中對提取方法(超聲提取、回流提取)、提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、提取溶劑用量(30、50、70 mL)、提取時(shí)間(30、45、60 min)及提取次數(shù)(1、2、3次)進(jìn)行了考察，最終確定上述最佳的供試品溶液制備方法，此法測得鹽酸小檗堿的含量較高。

筆者選用乙腈-水(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.34 g、磷酸二氫鈉0.17 g，磷酸調(diào)pH值至3.0)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)、乙腈-0.1%磷酸水溶液(每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸鈉)等幾種流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，同時(shí)對不同流動(dòng)相的不同比例進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸(40∶60) (每100 mL水中加入0.05 g十二烷基磺酸鈉)為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸小檗堿與其他成分完全分離，陰性對照不干擾鹽酸小檗堿的含量測定，且峰形較好，結(jié)果可行，可用于復(fù)方青黛散的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄭立紅,李衛(wèi)敏,黃健,等.祛濕散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].北京中醫(yī)藥,2012,31(6):458-460.

[2]康強(qiáng),樊華,張?zhí)J燕,等.珍黃安宮片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥師,2013,16(10):1488-1491.

[3]丁曉瑜,陳鈞,劉一丹,等.減味錫類散栓劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(17):97-99.

[4]江維克,郭培果,艾強(qiáng).鱉甲消痔片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂研究[J].中成藥,2010,32(2):337-339.

[5]張錦興,唐蕾,李卓亞,等.利尿消炎合劑的薄層色譜鑒別[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2013,7(8):15-16.

[6]徐英宏,關(guān)丁越,姜清華.治咽顆粒的鑒別及其綠原酸含量測定[J].實(shí)用藥物與臨床,2011,14(6):496-498.

[7]吳玲,胡淼.復(fù)方甘草麻黃堿片的定性定量研究[J].西北藥學(xué)雜志,2012,27(5):427-429.

[8]袁旭江,吳燕紅,郭鐘慧,等.喉疾靈口含片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2010,26(5):477-481.

[9]昊慶淼,吳立軍,楊志偉.醒腦再造丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2010,11(1):25-29.

[10]葉秀金,宋粉云.HPLC測定清肺抑火丸中鹽酸小檗堿的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(3):90-92.

[11]周國莉,林曉蓮,程聰.HPLC法測定復(fù)方黃連液中鹽酸小檗堿的含量[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,16(8):80-81.

Study on quality standard of compound qingdai powderMA Hong-da,CUI Ying-yu,GAO Jun,WANG Lin-lin,SHI Guo-bing*(Department of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish the quality standard of compound qingdai powder.MethodsTLC method was used for the qualitative identification of indigo naturalis,bovis calculus,phellodendri chinensis cort,glycyrrhizae radix et rhizoma,borneolum syntheticum.HPLC was used to determine the content of berberine hydrochloride.The determination was performed on Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) column with mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid water (40∶60) (SDS 0.05 g was added in 100 mL water) at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 265 nm.ResultsTLC spots were clear and well-separated without negative interference.The linear range of berberine hydrochloride was 0.002～0.10 mg/mL (r=0.999 6) with an average recovery of 100.31%,RSD=1.57% (n=6).ConclusionThe method is simple,accurate and reproducible.It is effective in controlling the quality of compound qingdai powder and providing the basis to improve the quality standards.

Key words：Compound qingdai powder;Quality standards;Berberine hydrochloride;TLC;HPLC

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602022

*通信作者

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)重點(diǎn)課題(13ZJZ02)

收稿日期：2015-07-15