胡鴻惠， 南文金， 龔中貴， 彭國良

1.韶關學院，廣東韶關 512005；2.韶關市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東韶關 512000)

?

豬流行性腹瀉弱毒疫苗研究進展

胡鴻惠1， 南文金1， 龔中貴2， 彭國良1

1.韶關學院，廣東韶關 512005；2.韶關市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東韶關 512000)

分析了我國豬流行性腹瀉疫苗的使用現(xiàn)狀，從疫苗毒株的選擇、野毒株的分離和培養(yǎng)、毒株的致弱、疫苗安全性和免疫效力等方面綜述了豬流行腹瀉弱毒疫苗的研究進展，以期為新形勢下進一步開展豬流行腹瀉疫苗的研發(fā)提供借鑒與參考。

豬流行性腹瀉；豬流行性腹瀉病毒；弱毒疫苗；毒株

1971年英國首先發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉(Porcineepidemicdiarrhea,PED)，隨后比利時、荷蘭、德國、瑞士、法國等均有該病的報道，我國于1976年首次報道該病的發(fā)生[1]。自2010年以來，我國大部分地區(qū)的豬場出現(xiàn)新的一輪仔豬腹瀉疫情，甚至出現(xiàn)在一些廣泛使用PED滅活苗和弱毒苗的豬場，與此同時韓國、日本、越南、泰國等亞洲國家也發(fā)生腹瀉疫情[2-3]。自2013年4月以來，美國、加拿大、墨西哥等美洲國家，甚至歐洲國家均有豬腹瀉疫情的報道[4-5]。2014年，日本大面積暴發(fā)仔豬腹瀉病[6]。目前，豬流行性腹瀉已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失，因此該病的防疫與控制至關重要。疫苗免疫是預防動物傳染病的有效方式，也是亞洲國家PED防疫控制的主要方式之一。一直以來，豬流行腹瀉疫苗的研制與應用備受國內外學者的重視。近年來，不少豬流行性腹瀉相關疫苗陸續(xù)上市，2014年3月美國宣布豬病毒性腹瀉RNA核酸疫苗上市，2015年3月我國宣布豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病三聯(lián)活疫苗上市等[7]。豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)主要寄生在豬的小腸，以細胞免疫為主，而弱毒疫苗是一種病原致病力減弱但仍然具有活力的完整病原疫苗，可以在免疫動物體內繁殖，具有使用劑量小、免疫原性好、不需佐劑、成本低、使用方便、可誘導較強的細胞免疫反應，一次免疫即可獲得長久免疫力等優(yōu)點[8-9]。筆者從疫苗毒株的選擇、野毒株的分離和培養(yǎng)、毒株的致弱、疫苗安全性和免疫效力等方面綜述豬流行性腹瀉弱毒疫苗的研究進展。

1　我國豬流行性腹瀉疫苗的使用現(xiàn)狀

已研制的豬流行性腹瀉疫苗有組織滅活苗、細胞滅活苗、細胞弱毒苗和轉基因植物疫苗、聯(lián)苗等，亞洲地區(qū)在很長一段時間內通過疫苗免疫接種很好地控制了豬流行性腹瀉。國內市售的豬流行性腹瀉相關疫苗以滅活苗為主，以弱毒苗為輔，其中大部分是聯(lián)苗，包括豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎(TGE)二聯(lián)苗和豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病(PoR)三聯(lián)疫苗等，國內生產廠家主要有哈維科、吉林正業(yè)、上海海利、成都天邦、普萊柯和諾倍威。滅活疫苗因其安全、穩(wěn)定而一直備受青睞，其中二聯(lián)滅活疫苗的市場份額相對較大。活疫苗可以誘導豬體產生分泌性IgA(sIgA)，提供對病毒強毒攻擊的免疫保護，已成為目前企業(yè)研發(fā)推出產品的熱點。陳靜等[10]研究表明，與滅活疫苗相比，接種活疫苗后動物攻毒保護性更好。盡管在一定程度上弱毒活疫苗存在毒力返強的危險，科研人員和企業(yè)仍在不斷完善和加強弱毒疫苗的研發(fā)，并在近年先后推出PED-TGE二聯(lián)活疫苗、PED-TGE-PoR三聯(lián)活疫苗投入市場。同時，新型疫苗(如亞單位疫苗、DNA疫苗、轉基因植物疫苗、重組活載體疫苗等基因工程疫苗)均在研發(fā)，但少有商品化。與傳統(tǒng)疫苗相比，新型疫苗在研發(fā)和投入使用的過程中人們更為關注疫苗的免疫原性和安全性，在我國等亞洲國家暫時沒有得到推廣和應用[11-14]。

2　弱毒疫苗毒株的選擇

已經實現(xiàn)商品化的弱毒疫苗所使用的豬流行性腹瀉病毒毒株主要有CV777株、P-5V株、KPED-9株和DR13株[15]。其中，CV777毒株最早由比利時Pensaert等分離得到，我國童有恩等[16]首次開展了CV777強毒株的致弱培育，隨后又開展了PED和TGE二聯(lián)弱毒苗的研制，并在2003年獲得TGE-PED二聯(lián)活疫苗新獸藥證書。目前，國內很多企業(yè)仍然使用該毒株作為疫苗毒株進行生產。在日本，廣泛用于活疫苗生產的毒株為P-5V。在韓國，Kweon等[17]成功從新生小豬小腸內容物分離到的野毒株KPEDV-9，通過傳代適應Vero細胞連續(xù)傳代致弱，并后續(xù)用于疫苗生產。Song等[18]也從新生仔豬小腸內容物中分離到DR13毒株，經過連續(xù)傳代并成功研制成口服疫苗，該疫苗口服效果強于肌注，并于2011年在菲律賓注冊商標。此外，也有很多未能實現(xiàn)商品化的疫苗研發(fā)和正在研發(fā)中的腹瀉疫苗，童昆周等[19]開展了PEDV-G1的致弱培育工作。Sato等[20]開展了83P-5毒株的致弱培育。陶曉珊等[21]開展了SD10A1毒株的致弱研究。張許科等[22]開展HN1301強毒株的致弱研究。

近年來，隨著豬流行性腹瀉疫情的暴發(fā)，研究人員發(fā)現(xiàn)以CV777毒株為代表的經典毒株生產的疫苗對豬的保護力不足，造成免疫失敗的現(xiàn)象屢屢發(fā)生[23]。通過對流行毒株的分子流行病學調查，發(fā)現(xiàn)我國2010年以來的流行毒株與CV777相比，毒力基因發(fā)生了較大的改變，而2013～2014美國、韓國、日本的流行毒株與過去10年的流行毒株相比，也發(fā)生了變異。Chen等[24]在我國分離的LC毒株與CV777毒株相比有897個核苷酸不同，大部分差異主要存在ORF1和S基基因上，同樣的基因缺失和插入存在2010～2012年的中國分離株BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011和GD-B中。SuzikiT等[25 ]于2013～2014年在日本分離的2個毒株(TTR-2/JPN/2014和MYG-1/JPN/2014)的S基因和ORF3基因上發(fā)現(xiàn)大范圍的缺失，這2個毒株與2013～2014年美國和韓國的廣泛流行的分離株有較近的親源關系，與經典毒株相比在已知的中和表位中存在氨基酸的突變。

總之，毒株的選擇及其免疫原性、毒價是弱毒疫苗研發(fā)和投入生產并能實現(xiàn)市場化的關鍵因素之一。在新的養(yǎng)殖新形勢下，由于經典疫苗對豬流行性腹瀉病毒感染的保護力不足和該病毒基因的變異，又一次啟發(fā)了新一輪的豬流行性腹瀉疫苗的研發(fā)之路，研究者們正從這些變異毒株中篩選代表性強、免疫原性好的毒株研發(fā)新的疫苗。

3　弱毒疫苗的分離培養(yǎng)與致弱

3.1毒株的分離和培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒野毒株的分離培養(yǎng)較為困難，有研究人員應用豬胎腎、豬甲狀腺細胞進行PEDV的分離未能成功。宣華等[26]應用豬胎小腸組織原代單層細胞培養(yǎng)獲得成功，病毒滴度可達2×106.5～2×109.0TCID50/mL。Hofmann等首次在Vero細胞中成功傳代和培養(yǎng)PEDV。此后，陸續(xù)有成功應用Vero細胞進行PEDV的分離的報道[27-28]。此外，也有應用PK15 細胞和Marc-145 細胞中成功分離或傳代PEDV的報道[29-30]。總體而言，PEDV分離率非常低，有的培養(yǎng)后基本檢測不到組織細胞感染量(TCID50)，給病毒的擴大生產及病毒量的確定造成困難。

為了提高PEDV的臨床分離效率、在疫苗生產中提高病毒的低度，研究人員不斷探索研究。有些PEDV的分離會在第1代出現(xiàn)細胞病變，有的則需要盲傳多代后才出現(xiàn)病變[31]。馮曉聲等[32]通過使用細胞親和劑來改變病毒與細胞之間的關系，增加病毒和細胞之間的親和度，使得病毒更容易感染細胞。佟有恩等[33]采用加胰酶的辦法將二聯(lián)活疫苗的PEDV的毒價提高2個滴度。周靚靚等[34]試驗發(fā)現(xiàn)Vero細胞采用0.02%EDTA+0.25%胰酶為分散液與用PBS+0.25%胰酶為分散液，其使單層細胞的消化時間縮短，進而縮短了病毒繁殖時間，且毒價能達到要求。王琳等[35]探索并優(yōu)化CV777疫苗株的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)當胰酶濃度為5.0～7.5μg/mL時，病毒增殖速度隨胰酶濃度的增加有所上升，且不同代次Vero細胞對病毒增殖的敏感性不同。為降低生產成本，有企業(yè)馴化疫苗毒株，以適應低血清培養(yǎng)，采用分代次遞進式減少營養(yǎng)液中的血清濃度[36]。除病毒本身的特性以外，提高PEDV病毒培養(yǎng)的滴度不僅可以從培養(yǎng)基著手，也可以考慮培養(yǎng)條件、細胞系等。同時，需要建立一個敏感性高的檢測方法輔助病毒分離與鑒定，如熒光定量RT-PCR方法相比普通方法更具定量、敏感的優(yōu)越性。

3.2毒株的致弱常用的病毒致弱方法有4種：①從自然界中篩選弱毒株；②通過異種動物或細胞傳代致弱；③采用物理和化學方法致弱；④利用基因工程技術對病原進行重組。目前，應用于豬流行性腹瀉病毒的致弱方法主要是通過細胞傳代致弱和利用基因工程技術對病原進行重組致弱。

選擇合適的毒株進行致弱是弱毒疫苗研發(fā)的關鍵環(huán)節(jié)之一，而不同的毒株由于其毒力的強弱不同，因此通過傳代致弱的代次會有一定的差距。童昆周等[19]通過使用Vero細胞的傳代，并在一定代次用PK15和ST細胞進行交替?zhèn)鞔鷮EDV-G1強毒株致弱，后續(xù)試驗結果表明PEDV-G1 第83代毒具有較高的免疫原性并具備作為弱毒疫苗株的條件。佟有恩等[16]將CV777強毒株的在Vero細胞上連續(xù)傳代進行致弱，83代以后適應了仔豬腎原代細胞(PK)，并自90代起做空斑培養(yǎng)，進行病毒克隆純化，克隆后25代弱毒株穩(wěn)定性試驗表明經6代返祖?zhèn)鞔玖ξ匆姺祻?，符合弱毒株標準。Kweon等[17]成功分離到野毒株KPEDV-9，通過傳代適應Vero細胞，并連續(xù)傳代至93 代 。Song等[18,37]將DR13毒株經過在Vero細胞上連續(xù)傳代100代致弱。日本Sato等[20]開展83P-5毒株的傳代致弱，該毒株在傳代22代時開始適應細胞，并連續(xù)傳代至100代。陶曉珊等[21]對分離的SD10A1毒株進行傳代致弱，第16代出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變，病毒含量高于106.0TCID50/mL，在Vero細胞上傳代至121代時對未吃初乳仔豬安全，并命名為SD10。張許科等[22]將HN1301分離株經Vero細胞傳代致第46代時成功致弱，并命名為HN1302株。P-5V毒株雖已經應用于疫苗生產， 但無相關的致弱研究報道。已有的研究表明，PEDV在細胞傳代培養(yǎng)的過程中，隨著代次的增加，其毒力逐漸減弱，但也存在散失病毒復制能力的風險。目前使用的不同弱毒疫苗毒株致弱的代次各不相同。筆者認為PED疫苗毒株的致弱方面仍然存在很多不足之處，比如可以考慮改良培養(yǎng)基縮短病毒復制周期、 改變病毒培養(yǎng)溫度致弱病毒、研發(fā)培育新的適應性細胞系等。此外，在病毒的致弱研究中可以關注毒株的致弱標志，有助于疫苗投入使用后的鑒別診斷。

4　凍干保護劑

動物疫苗保護劑可以減少疫苗在高溫和長時間保存中可能發(fā)生的物理和化學變化。常用的凍干保護劑有糖類、蛋白類、聚乙二醇等。國內動物疫苗最常使用的凍干保護劑主要有脫脂牛奶、蔗糖、明膠，其中一般蔗糖脫脂牛奶的比例為5%，明膠的比例為1.5%～3.0%，這些保護劑具有溶解性好、外型穩(wěn)定、保存方便和成本低廉等優(yōu)點，但具有熱穩(wěn)定性差和保護功能較弱的缺點，一般2～8 ℃下保存期為4～6個月。國外對耐熱凍干保護劑的研究起步較早，已有商品化的產品，2～8 ℃下保存期可達2年以上。近年來，國內有研究人員探索以二糖類海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白等為組分的耐熱性凍干保護劑的研究工作[38-39]。關于PEDV的凍干保護劑的研發(fā)鮮有報道。陶曉珊等[21]選擇蔗糖和明膠為保護劑，其在疫苗中的質量百分比終濃度分別為5%和1%，在保護劑中添加0.5%的酪蛋白酸鈉。凍干保護劑的選擇和質量會影響疫苗的質量、效價和穩(wěn)定性?？傮w來看，國內對耐熱凍干保護劑的研究報道較少，僅有少量禽病疫苗的研發(fā)過程中對耐熱凍干保護劑進行了研究，豬病疫苗普遍采用的是普通凍干保護劑。對PED疫苗在內的豬病疫苗的凍干保護劑的研發(fā)具有一定的市場潛力。

5　疫苗的安全性和免疫效力

疫苗的安全性試驗主要包括垂直傳播和水平傳播能力、不同日齡豬和妊娠母豬的免疫安全性、陽性豬群的免疫安全性、超劑量免疫的安全性以及毒力返強試驗等。免疫效力試驗則包括最小免疫劑量、免疫產生期與免疫持續(xù)期、不同的免疫途徑等。

童昆周等[19]將PEDV-G1第83代致弱毒株進行免疫效力試驗 ，結果表明弱毒疫苗總免疫效力達94.6%。其中，口服或肌注免疫1～4 個發(fā)病量強毒攻擊的免疫豬均獲得100 %保護；6 個發(fā)病量攻擊的免疫豬, 則口服免疫獲得50%保護, 肌注免疫獲得100 %保護。1998年，佟有恩等[16]將適應Vero細胞系的不同代次的CV777 毒株進行感染性及免疫效力試驗，結果表明致弱毒株毒價可達3.33×107.0～3.33×107.5TCID50/mL，第83-7-斑5的克隆傳代毒的主動免疫試驗保護率為95.92%，被動免疫試驗保護率為96.2%，且該毒株經6 代次返祖?zhèn)鞔玖ξ捶祻姟Ｙ∮卸鞯萚32]又研制了TGE-PED二聯(lián)活疫苗，免疫效力試驗結果表明弱毒株的毒力穩(wěn)定，免疫后主動保護率為97.7%，被動保護率為98%，比二聯(lián)滅活疫苗約高10個百分點，而免疫劑量減少50%，免疫期可達7個月，仔豬的被動免疫期可至斷奶后1 周，免疫后14d可產生較強的保護力，6 個豬場的田間試驗保護率為95%～98%，緊急預防接種效果明顯。1999年，Kweon等[17]用KPEDV-9弱毒株免疫妊娠母豬，結果發(fā)現(xiàn)母豬的免疫力明顯提高。初乳前仔豬的致病性試驗發(fā)現(xiàn)母豬所產生的抗體對抵抗PEDV野毒能力較強。懷孕母豬安全性試驗表明接種KPEDV-9的母豬平均每窩產活仔數與對照組相同，無任何臨床癥狀。2000 年，李樹根等[40]將PEDV弱毒株G1-P83和TGE弱毒株AG1制成弱毒二聯(lián)疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗可以使初生仔豬、斷奶仔豬和肥育豬對TGEV和PEDV強毒的攻擊有一定的抵抗能力，其中初生仔豬在8～10日齡用弱毒二聯(lián)疫苗口服免疫,在斷奶時能夠較好地保護仔豬,免受TGEV和PEDV強毒的感染。2007年，Song等[18]將13 株DR弱毒株通過口服及肌肉注射免疫妊娠母豬，其中口服免疫組發(fā)病率為13%，而肌肉免疫組為60%，口服組仔豬的IgA含量高于肌肉注射組，在強毒株攻毒情況下，新生仔豬口服組比肌肉注射組獲得了更好的免疫保護，病毒株在豬體內連續(xù)3 次傳代毒力不返強。2014年，陶曉珊等[21]開展以SD10為毒株的弱毒疫苗研發(fā)，單劑量和超劑量試驗均表明該毒株對小豬安全，主動免疫妊娠母豬后其產仔豬攻毒保護率為100%，而仔豬的主動免疫保護率也達100%，對照組發(fā)生典型的發(fā)病癥狀。2015年，張許科等[22]研究弱毒株HN1302的免疫保護效力，試驗結果表明攻毒后第14天血清中和抗體水平逐漸升高，多數達到1∶32的水平，此后隨著攻毒時間的增加，中和抗體水平增高，在攻毒后第28天達到最高，與CV777相比，弱毒株HN1302產生免疫效力較快，且能維持在一個較高的水平，能夠充分保護豬流行性腹瀉的攻擊。疫苗的免疫效力決定了動物能否有效抵抗病毒的感染，弱毒疫苗接種后可以快速、持續(xù)地產生抵抗力，國內PED弱毒疫苗推出市場后其占有的市場份額逐漸提升。同時，在研發(fā)過程中需要關注的一個問題是PED疫苗的免疫持續(xù)期，弱毒疫苗的免疫持續(xù)期越長可以減少疫苗的免疫次數，減低生產成本、減少應激，尤其是當前養(yǎng)殖狀況復雜，豬場接種疫苗種類較多、相互干擾已成為影響疫苗免疫效果的因素之一。

6　展望

近年來，國內外腹瀉疫情屢屢發(fā)生，豬流行性腹瀉的給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。該病流行的相關問題主要集中在病毒發(fā)生較多的變異，與其他腸病毒共感染的比例逐年上升，疫苗的質量問題等[41]。很多因素使得豬流行性腹瀉的防治成為今后一段時間內集約化養(yǎng)豬面臨的亟待解決的問題之一。面對近年來的腹瀉疫情，在臨床生產實踐中一些經典的腹瀉疫苗不能很好地抵抗疾病，有的發(fā)病豬場通過返飼、自家苗的制備和使用，在一定程度內很好地控制了腹瀉疫情，但返飼、自家苗的使用缺乏規(guī)范的方法，且病毒的滴度難以控制，又存在其他疫病感染的風險，不能長期使用。因此，飼養(yǎng)者們通過選擇合適的疫苗進行免疫防疫才是科學有效的防控手段。

幾十年來，學者們對PED疫苗的研發(fā)工作一直沒有停滯。篩選和培育出具有良好免疫原性、高毒價的毒株是疫苗研制成功的關鍵。動物機體抗感染免疫的過程中，體液免疫和細胞免疫都非常重要。由于PEDV的腸道親嗜性，局部腸黏膜免疫也發(fā)揮了重要作用，而活疫苗毒力減弱但保持完整的具有活力的病原，可以誘導良好粘膜免疫，是一個可持續(xù)發(fā)展和不斷完善的研究方向。但是，與滅活疫苗相比，弱毒疫苗的安全更為受到關注。弱毒疫苗的研發(fā)主要分為弱毒疫苗株的培育、疫苗的安全性檢驗和疫苗的效力檢驗等3個階段。

目前，基于腹瀉疫情發(fā)生形勢的變化，結合現(xiàn)有腹瀉疫苗研究概況，筆者認為今后對豬流性腹瀉疫苗的研發(fā)可以從以下方面加以重視：①豬流行性腹瀉具有一定的地方流行性特征，研究人員可以長期監(jiān)測腹瀉疫情的發(fā)生，篩選地方流行毒株作為疫苗的候選毒株，追蹤變異的PEDV毒株，加強企業(yè)-高校-研究院所的合作，將工廠化的疫苗生產工藝與高校、研究院所的資源優(yōu)勢相結合。以臨床分離培養(yǎng)的變異毒株作為候選，優(yōu)化和改進現(xiàn)有的商品化疫苗，加快科技轉化為生產力的進度，加快實驗室研發(fā)轉化為生產的速度，也使養(yǎng)豬業(yè)受惠。②有針對性地考慮加強聯(lián)苗的研發(fā)。持續(xù)追蹤調查，檢測和分離臨床上與PEDV共感染的其他腸病毒，作為多聯(lián)疫苗毒株的候選。③考慮基因工程活疫苗的研發(fā)與應用，保持活疫苗的免疫原性，但又減少活疫苗毒力返強的風險。

[1]HOFMANNM,WYLERR.Propagationofthevirusofporcineepidemicdiarrheaincellculture[J].JClinMicro, 1988,26(11):2235-2239.

[2]SUNRQ,CAIRJ,CHENYQ,etal.Outbreakofporcineepidemicdiarrheainsuckingpiglets,China[J].EmergInfectDis, 2012,18(1):161-163.

[3] 蔡汝健,張樂宜,宋長緒.2010-2013 年華南地區(qū)豬流行性腹瀉病流行情況調查及防控效果[J].廣東農業(yè)科學,2013(11):104-105.

[4]WANGL,BYRUMB,ZHANGY.Newvariantofporcineepidemicdiarrheavirus,UnitedStates, 2014[J].EmergInfectDis, 2014(20):917-919.

[5]CHUNGHC,NGUYENVG,MOONHJ,etal.IsolationofporcineepidemicdiarrheavirusduringoutbreaksinSouthKorea, 2013-2014 [J].EmergInfectDis,2015,21(12):2238-2240.

[6]HORIEM,KABEMURAM,MASATANIT,etal.IsolationandmolecularcharacterizationofporcineepidemicdiarrheavirusescollectedinJapanin2014[J].ArchVirol, 2016，161：2189.

[7] 張曉鵬.10年磨一劍哈獸研維科生物首創(chuàng)的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗隆重上市[J].獸牧獸醫(yī)科技信息，2015 (8):83.

[8] 趙德明,張仲秋,周向梅,等.豬病學[M].10版.北京:中國農業(yè)出版社,2014.

[9] 殷震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997.

[10] 陳靜,劉德清,張寧,等.7種常用豬流行性腹瀉疫苗臨床免疫效果觀察和評估[J]. 養(yǎng)豬,2013(4):106-108.

[11] 孟凡丹.豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D].哈爾濱:東北農業(yè)大學,2011.

[12] 陳建飛.豬流行性腹瀉病毒全基因組序列分析及感染性才cDNA克隆的構建[D].哈爾濱,哈爾濱獸醫(yī)研究所研究生院,2012.

[13]KANGTJ,JANGYS,YANGMS.Cloningandsequenceanalysisofthekoreanstrainofspikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusandexpressionofitsneutralizingepitopeinplants[J] .ProteinExprPurif, 2005, 41(2):378-383.

[14]ZHANGY,ZHANGX,LIAOX,etal.ConstructionofabivalentDNAvaccineco-expressingSgenesoftransmissiblegastroenteritisvirusandporcineepidemicdiarrheavirusdeliveredbyattenuatedSalmonella typhimurium[J].Virusgenes,2016,52(3):354-364.

[15]SONGD,MOONH,KANGB.Porcineepidemicdiarrhea:Areviewofcurrentepidemiologyandavailablevaccines[J].ClinExpVaccineRes,2015,4(2):166-176.

[16] 佟有恩,馮力,李偉杰,等.豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J].中國畜禽傳染病,1998,20(6):329-332.

[17]KWEONCH,KWONBJ,LEEJG,etal.Derivationofattenuatedporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)asvaccinecandidate[J].Vaccine, 1999, 17: 2533-2546.

[18]SONGDS,OHJS,KANGBK,etal.OralefficacyofVerocellattenuatedporcineepidemicdiarrheavirusDR13strain[J].ResVetSci, 2007,82(1):134-140.

[19] 童昆周,李力復,林志雄,等.豬流行性腹瀉弱毒疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1996,26(1):3-4.

[20]SATOT,TAKEYAMAN,KATSUMATAA,etal.Mutationsinthespikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusassociatedwithgrowthadaptationinvitroandattenuationofvirulenceinvivo[J].VirusGenes,2011,43(1):72-78.

[21] 陶曉珊,劉蕾,申洪銀,等.一種豬流行性腹瀉活疫苗：中國,CN103933561A[P].2014.

[22] 張許科,孫進忠,田克恭.一種豬流行性腹瀉病毒株、及其致弱毒疫苗株及應用:中國,CN104513827A[P].2015.

[23]LINCM,SAIFLJ,MARTHALERD,etal.Evolution,antigenicityandpathogenicityofglobalporcineepidemicdiarrheavirusstrains[J].VirusRes, 2016，16:30225-30232.

[24]CHENF,ZHUY,WUM,etal.Comparativegenomicanalysisofclassicalandvariantvirulentparental/attenuatedstrainsofporcineepidemicdiarrheavirus[J].Viruses,2015,7(10):5525-5538.

[25]SUZUKIT,MURAKAMIS,TAKAHASHIO,etal.MolecularcharacterizationofpigepidemicdiarrhoeavirusesisolatedinJapanfrom2013to2014[J].InfectGenetEvol, 2015,36(12):363-368.

[26] 宣華,邢德坤,王殿瀛,等.應用豬胎腸單層細胞培養(yǎng)流行性腹瀉病毒的研究[J].中國人民解放軍獸醫(yī)大學學報,1984,4(3):202-208.

[27] 王康,王鑫,楊德,等.豬流行性腹瀉病毒HeB10/2014 株的分離與鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(4):284-288.

[28]KADOIK,SUGIOKAH,SATOHT,etal.Thepropagationofaporcineepidemicdiarrheavirusinswinecelllines[J].NewMicro,2002,25(3):285-290.

[29]JUNGK,SAIFLJ.Porcineepidemicdiarrheavirusinfection:Etiology,epidemiology,pathogenesisandimmunoprophylaxis[J].VetJ, 2015,204(2):134-143.

[30]LAWRENCEPK,BUMGARDNERE,BEYRF,etal.Genomesequencesofporcineepidemicdiarrheavirus:Invivoandinvitrophenotypes[J].GenAnnou,2014,2(3):503-514.

[31] 付夢瑾,朱玲,吳云飛,等.豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及增殖規(guī)律[J].中國獸醫(yī)科學,2013,43(11):1133-1139.

[32] 馮曉聲,賈愛卿,王貴平.一種豬流行性腹瀉病毒的培養(yǎng)方法：中國,CN104611297A[P].2015.

[33] 佟有恩,馮力,李偉杰,等. 豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究[J].中國預防獸醫(yī)學報,1999,21(6):406-410.

[34] 周靚靚,孫心,吳蕾.豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉疫苗病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014,39(6):33-35.

[35] 王琳,邢育鋼 ,李繼昌.豬流行性腹瀉疫苗株在Vero細胞中繁殖條件的優(yōu)化[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2014(11):3-4.

[36] 徐宏軍,胡來根,牟和平,等.低血清培養(yǎng)Vero細胞生產豬流行性腹瀉CV777株病毒的方法：中國,CN104630158A[P].2015.

[37]SONGDS,YANGJS,OHJS.DifferentiationofaVerocelladaptedporcineepidemicdiarrheavirusfromKoreanfieldstrainsbyrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofORF3[J].Vaccine, 2003, 21(17/18):1833-1842.

[38] 王佳佳.雞新城疫耐熱糖玻璃活疫苗制備技術研究[D].南京:南京農業(yè)大,2013.

[39] 陳果亮,杜元釗,管清江,等.常規(guī)動物用活疫苗凍干保護劑的改良初探[J].中國動物檢疫,2007，24(10):28-29.

[40] 李樹根,周仲芳,李力復,等.豬流行腹瀉和豬傳染性胃腸炎弱毒二聯(lián)疫苗研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2000,26(8):5-8.

[41]SUNDB,WANGXY,WEIS,etal.EpidemiologyandvaccineofporcineepidemicdiarrheavirusinChina:amini-review[J].JVetMedSci, 2016,78(3):355-363.

ResearchProgressofPocineEpidemicDiarrheaAttenutedVirusVaccine

HUHong-hui1,NANWen-jin1,GONGZhong-gui2etal

1.ShaoguanUniversity,Shaoguan,Guangdong512005; 2.ShaoguanAnimalHealthSupervisionInstitute,Shaoguan,Guangdong512000)

Inthispaper,thecurrentusagesituationofpocineepidemicdiarrheavaccine(PEDV)inChinawasdescribed,andtheresearchprogressofpocineepidemicdiarrhea(PED)attenutedvirusvaccinewassummarizedfromtheaspectsoftheselectionofvaccinestrains,theseparationandcultureofwildstrains,theattenuationofstrains,thesafetyandimmuneefficiencyofvaccine,andsoon.Itprovides< class="emphasis_italic">references

fortheresearchanddevelopmentofpocineepidemicdiarrheavaccineinthenewepidemicsituation.

PED;PEDV;Attenutedvirusvaccine;Strain

廣東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)體系建設專項；廣東省協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心平臺項目(YJK-2014-52-16)；韶關市科技計劃項目(2013CX/N06，韶科[2015]72號)；2016年韶關學院校級科研項目；廣東省科技計劃項目(2016A040402038)。

胡鴻惠(1982- )，女，湖南郴州人，助理研究員，碩士，從事動物生產與疾病研究。

2016-08-05

S852.5

A

0517-6611(2016)26-0069-04