張萍，王毅紅，張春生，王盼，譚萍（六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

?

櫻桃多酚含量的福林法測(cè)定研究

張萍，王毅紅，張春生，王盼，譚萍*
（六盤水師范學(xué)院，貴州水城553004）

摘要：采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探究以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定櫻桃多酚含量的福林法適宜條件。結(jié)果表明，櫻桃多酚含量福林法測(cè)定的最佳試驗(yàn)條件為：福林試劑用量為4 mL，福林試劑與10 %Na2CO3溶液的體積比為1∶2，反應(yīng)時(shí)間為90 min，反應(yīng)溫度為40℃。

關(guān)鍵詞：櫻桃；多酚；福林法；正交設(shè)計(jì)

櫻桃屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus L.）櫻亞屬（Cerasus Pers）植物，櫻桃屬的植物有120多種，世界上做為果樹栽培的主要有4種，即中國(guó)櫻桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）、歐洲甜櫻桃（Prunus avium Linn.）、歐洲酸櫻桃（Prunus cerasus Linn.）、毛櫻桃（Prunus tomentosa Thunb.）[1]。櫻桃作為一種營(yíng)養(yǎng)與口味俱佳的果品，因成熟期早，有“早春第一果”的美譽(yù)，號(hào)稱“百果第一枝”，深受人們的喜愛(ài)。貴州櫻桃分布較廣，很多地方栽培種品質(zhì)優(yōu)良，果實(shí)色澤鮮艷、汁多、味甜酸[2]。隨著人們對(duì)食物營(yíng)養(yǎng)成分的搭配日趨重視，水果、蔬菜等的抗氧化活性成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，櫻桃成為其中備受關(guān)注的水果之一。市場(chǎng)對(duì)櫻桃及其加工食品的需求量日益擴(kuò)大，栽培面積的不斷增加，但目前為止，對(duì)櫻桃的研究多見(jiàn)于甜櫻桃[3-7]，中國(guó)櫻桃的成分研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

櫻桃含有豐富的糖分、鐵、VC、多酚類物質(zhì)[8]，酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物中的重要類型之一，因其具有顯著的抗氧化、抗癌、抗炎及抗突變活性而引起人們的廣泛關(guān)注[9]。酚類化合物是一類具有大而復(fù)雜基團(tuán)的化合物，從化學(xué)上講多酚以苯酚為基本骨架，以苯環(huán)的多羥基取代為特征，主要由無(wú)色多酚和色素兩類物質(zhì)組成。從低分子量的簡(jiǎn)單酚類到分子量大至數(shù)千道爾頓的單寧類，按結(jié)構(gòu)可分為酚酸類、類黃酮類及1，2-二苯乙烯、花青素類和原花色素類等[10]，因此不同植物多酚的定量在方法上存在著一定的差異。目前對(duì)于貴州櫻桃多酚的福林法測(cè)定的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用福林法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定櫻桃中多酚的含量，意在研究櫻桃多酚測(cè)定條件，為更好地開(kāi)發(fā)利用這一農(nóng)業(yè)資源提供一定的檢測(cè)參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

櫻桃：購(gòu)于貴州省六盤水市六枝特區(qū)落別鄉(xiāng)，無(wú)機(jī)械損傷，顆粒均勻，成熟度好。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；鉬酸鈉：上海膠體化工廠；鎢酸鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃磷酸：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；濃鹽酸：重慶江川化工（集團(tuán)）有限公司；硫酸鋰：廣東光華科技股份有限公司；無(wú)水碳酸鈉：重慶無(wú)機(jī)化學(xué)試劑廠；乙醇：天津市富裕精細(xì)化工有限公司；溴水：廈門海標(biāo)科技有限公司；以上試劑均為分析純；水為雙蒸餾水。

1.1.2儀器

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；METTLER TOLEDO AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1福林（FC）試劑的配制[11]

按徐輝艷等福林試劑的配制方法配制一定量的福林試劑，置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2樣品原液的制備

櫻桃去核打漿后準(zhǔn)確稱取25 g，用100 mL 30 %乙醇溶液于35℃條件下恒溫水浴90 min，浸提液過(guò)濾后定容至100 mL，得樣品原液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[12]

準(zhǔn)確稱取50 mg沒(méi)食子酸，用10 mL無(wú)水乙醇溶解，蒸餾水定容至50 mL，得標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取10 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液至100 mL容量瓶中定容，得濃度為0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取此標(biāo)準(zhǔn)液一定量于50 mL容量瓶中，得到濃度為1 μg/mL~6 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。經(jīng)福林試劑顯色后于762 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。求得回歸方程，繪制工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

方程為y=0.131 1x+0.119 1，r=0.999 6。

1.2.4樣品原液測(cè)定

準(zhǔn)確吸取2 mL樣品原液于50 mL容量瓶中，福林試劑的顯色操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

2結(jié)果與分析

2.1吸收波長(zhǎng)的選擇

分別準(zhǔn)確吸取樣品原液和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)福林試劑顯色后，均在波長(zhǎng)600 nm~850 nm范圍內(nèi)掃描，兩者光吸收曲線一致，確定最大吸收波長(zhǎng)為762 nm。

2.2福林試劑與10 %Na2CO3比例的選擇

準(zhǔn)確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入不同量的福林試劑與10 %Na2CO3溶液，使兩者有不同的體積比，保溫顯色后于762 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。福林試劑與10 %Na2CO3溶液的體積比對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖2。

圖2試劑比例與吸光度的關(guān)系Fig.2 Relationship between Folin reagent-10 % Na2CO3ratio and absorbance

結(jié)果表明，當(dāng)福林試劑與10 %Na2CO3體積之比為1∶2時(shí)吸光度達(dá)到最大值。

2.3福林試劑用量的選擇

準(zhǔn)確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入不同量的福林試劑，保溫顯色于762 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。福林試劑的用量對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖3。

圖3福林試劑用量與吸光度的關(guān)系Fig.3 Relationship between Folin regent dose and absorbance

結(jié)果表明，相同條件下隨著福林試劑用量的增加，吸光度先增大后減小，在福林試劑體積為3 mL時(shí)達(dá)到最大值。

2.4反應(yīng)時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入一定量的福林試劑，置于25℃的恒溫水浴鍋中保溫30 min~150 min，于762 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖4。

圖4反應(yīng)時(shí)間與吸光度的關(guān)系Fig.4 Relationship of reaction time and absorbance

結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，吸光度緩慢增加，且90 min時(shí)吸光度達(dá)到最大值。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到達(dá)120 min后吸光度開(kāi)始下降。

2.5反應(yīng)溫度的選擇

準(zhǔn)確吸取樣品原液2 mL于50 mL容量瓶中，加入一定量的福林試劑，置于15℃~45℃的恒溫水浴鍋中保溫60 min，于762 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖5。

圖5反應(yīng)溫度與吸光度的關(guān)系Fig.5 Relationship of reaction temperature and absorbance

結(jié)果表明，隨著溫度的改變，吸光度變化明顯，且隨著溫度的升高基本呈上升趨勢(shì)，45℃達(dá)到最大值。因溫度過(guò)高對(duì)多酚的性質(zhì)造成改變，故試驗(yàn)溫度設(shè)計(jì)不宜過(guò)高。

2.6顯色條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，為了進(jìn)一步找出顯色反應(yīng)的最佳試驗(yàn)條件，將福林試劑用量（A）、福林試劑與10 %Na2CO3比例（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）、反應(yīng)溫度（D）為考察因素，以吸光度為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表1。

表1試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors

正交試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

續(xù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal test

表3方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

由表2、表3可知，影響吸光度大小的因素為B> A>D>C，即福林試劑與10 %Na2CO3比例>福林試劑用量>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間。其中A、B、C、D因素對(duì)試驗(yàn)均有顯著影響（P < 0.01），故確定最佳提取工藝為B2A3D2C3，所以本試驗(yàn)中確定：福林試劑用量為4 mL，福林試劑與10 %Na2CO3比例為1∶2，反應(yīng)時(shí)間為90 min，反應(yīng)溫度為40℃為優(yōu)選顯色工藝。用該優(yōu)選條件，按1.2.4所述的試驗(yàn)方法測(cè)得吸光度值為0.462，在所有提取方法中數(shù)值最大，說(shuō)明B2A3D2C3為最佳提取工藝。

2.7精密度試驗(yàn)

通過(guò)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)本法的精密度。準(zhǔn)確移取樣品原液4份，按1.2.4所述的試驗(yàn)方法進(jìn)行平行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4精密度試驗(yàn)Table 4 Precision of method

2.8加樣回收率試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定方法的準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確移取同一批提取物，稀釋一定倍數(shù)后取1 mL，分別精密加入0.5、1.0、1.5 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品。按1.2.4所述的試驗(yàn)方法進(jìn)行平行測(cè)定，取平均吸光度求出總酚含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5回收率試驗(yàn)Table 5 Recovery of method

3　討論

目前，利用如高錳酸鉀法[14]、紫外分光光度法[15]、酒石酸亞鐵比色法[16]等測(cè)定植物多酚的方法報(bào)道很多。不同的方法均存在一定的缺點(diǎn)。我們經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，櫻桃多酚含量福林法測(cè)定的最佳試驗(yàn)條件為：福林試劑用量為4 mL，福林試劑與10 % Na2CO3溶液的體積比為1∶2，反應(yīng)時(shí)間為90 min，反應(yīng)溫度為40℃。優(yōu)選出的條件操作簡(jiǎn)單、顯色穩(wěn)定，快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，精密度和重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。這為以后的進(jìn)一步研發(fā)提供了很好的參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]于亞軍,代漢萍,李寶江,等.世界櫻桃雨中進(jìn)展[J].果樹學(xué)報(bào),2003, (2):135-139

[2]李金強(qiáng),吳亞維,袁啟鳳.貴州櫻桃種質(zhì)資源調(diào)查初報(bào)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(3):126-128

[3]王賢萍,段澤敏,戴桂林,等.甜櫻桃主要栽培品種多酚含量的測(cè)定與品質(zhì)分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(13):173-176

[4]邸圓媛,竇月,王淼,等.甜櫻桃抗氧化物質(zhì)的提取及穩(wěn)定性研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(3):180-181

[5]王立新.櫻桃果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的提取研究[J].吉林農(nóng)業(yè),2010(9) 60-61

[6]李洋,欽傳光,尚曉亞,等.甜櫻桃色素的提取及抗氧化活性[J].化學(xué)研究,2008,19(4):28-31

[7]劉杰超,焦中高,張陽(yáng),等.甜櫻桃紅色素對(duì)自由基和亞硝基的清除作用[J].食品工業(yè)科技,2008,29(11):122-124,127

[8] Jaouad Bouayed, Hassan Rammal,Amadou Dicko,et al.Chlorogenic acid,a polyphenol from Prunus domestica (Mirabelle),with coupled anxiolytic and antioxidant effects[J].Journal of the Neurological Sciences,2007,262(1/2):77-84

[9] Balasundram N, Sundram K, Samman S. Phenolic compounds in plants and agri-industrialby-products: antioxidant activity, occurrence, and potential uses[J]. Food Chem,2006,99(1):191

[10]吳瓊,白兆鵬,劉佰.茶多酚及其生物學(xué)功能[J].養(yǎng)殖與飼料,2007 (1):57-61

[11]徐輝艷,孫曉東,張佩君,等.紅棗汁中總酚含量的福林法測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009,30(3):126-128

[12]王岸娜,徐山寶,劉小彥,等.福林法測(cè)定獼猴桃多酚含量的研究[J].食品科學(xué),2008,29(7):398-401

[13]譚萍,張萍,王玉珠,等.蕎麥多糖的提取方法及含量測(cè)定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,47(8):955-956

[14]王文杰.高錳酸鉀測(cè)定法測(cè)定茶多酚有關(guān)用劑的特性研究[J].福建茶葉,2002(1):15-17

[15]卜彥花,周娜娜,王春悅,等.福林酚試劑法和紫外分光光度法測(cè)定冬棗多酚含量的比較研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(1):212-217

[16]劉蓓蓓,陳勝璜,鄒菊英,等.酒石酸亞鐵比色法測(cè)定黃鸝芽中茶多酚的含量[J].中南藥學(xué),2011,9(10):740-741

Study on Determining Cherry Polyphenols Content by Folin Method

ZHANG Ping，WANG Yi-hong，ZHANG Chun-sheng，WANG Pan，TAN Ping*
（Liupanshui Normal College，Shuicheng 553004，Guizhou，China）

Abstract：By means of orthogonal experimental design，with gallic acid as standard，the suitable conditions for determining cherry polyphenols content by Folin method. The results showed that，the best condition determination method of Folin polyphenol content of cherry：Folin reagent amount used was 4 mL，F(xiàn)olin reagent and 10 % Na2CO3ratio（V/V）of 1∶2，reaction time 90 min，reaction temperature 40℃.

Key words：cherry；polyphenols；Folin method；orthogonal experimental design

收稿日期：2014-09-22

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.036

*通信作者：譚萍（1963—），女（漢），教授，本科，主要從事植物生理學(xué)與分子生物學(xué)的教學(xué)與研究。

作者簡(jiǎn)介：張萍（1973—），女（漢），副教授，本科，主要從事無(wú)機(jī)及分析化學(xué)的教學(xué)及研究。

基金項(xiàng)目：六盤水師范學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目（lpssy201201）