韓瑨，吳正鈞，游春蘋，高彩霞（.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海0046；.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海0046；.光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院，上海0046）

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富含右旋糖苷番茄汁發(fā)酵飲料研制

韓瑨1，吳正鈞2，游春蘋3，高彩霞3
（1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海200436；2.上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海200436；3.光明乳業(yè)股份有限公司光明乳業(yè)研究院，上海200436）

摘要：腸膜明串珠菌BD1710可在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中代謝合成右旋糖苷，其發(fā)酵液可作為主要原料來勾兌制備富含右旋糖苷的發(fā)酵飲料，通過正交試驗確定了該多糖飲料的配方為：發(fā)酵液用量30 %（體積分?jǐn)?shù)）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2%，優(yōu)選配方制備的發(fā)酵飲料中多糖含量可達(dá)1.0%以上。

關(guān)鍵詞：腸膜明串珠菌BD1710；右旋糖苷；番茄汁蔗糖培養(yǎng)基

多糖（polysaccharide）是一類由多個相同或不同類型單糖縮合而成的高分子碳水化合物，其廣泛分布于高等植物、地衣、海藻、動物和微生物中，由于其具有免疫調(diào)節(jié)（牛膝多糖）[1]、降血糖（苦瓜多糖）[2]、抗腫瘤（香菇多糖）[3]、抗衰老（海帶多糖）[4]等生物活性，以及增加穩(wěn)定性（紅棗多糖）[5]、促進(jìn)澄清（魔芋多糖）[6]等優(yōu)良的加工性能，因此近年來被越來越多地應(yīng)用于多糖類保健飲料中。根據(jù)多糖來源的不同，這些產(chǎn)業(yè)化的多糖飲料主要采用了3類多糖：植物多糖、真菌多糖以及細(xì)菌多糖。其中，植物多糖主要來自植物的莖、葉以及種子，因其普遍存在性而應(yīng)用最廣，真菌多糖大多來源于真菌的菌絲體、菌柄以子實體，而細(xì)菌多糖主要指由微生物在生長代謝過程中分泌到胞外的粘液多糖，出于食用安全性的考慮以及相關(guān)法律法規(guī)的限制，目前應(yīng)用于飲料產(chǎn)品中的細(xì)菌性多糖僅限于包括乳酸菌在內(nèi)的少數(shù)微生物，而乳酸菌胞外多糖的降血壓[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等益生作用已獲得廣泛的認(rèn)同，因此，富含乳酸菌多糖飲料的開發(fā)有助于推動細(xì)菌多糖在功能性飲料領(lǐng)域進(jìn)一步的應(yīng)用。

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是一類的高產(chǎn)多糖乳酸菌，研究表明，由L. mesenteroides合成的多糖大多為主鏈以葡萄糖經(jīng)α-（1→3）、α-（1→4）或α-（1→6）糖苷鍵鍵合而成的葡聚糖（Glucan），如主鏈僅以α-（1→6）糖苷鍵將葡萄糖聚合而成的dextran[9]，主鏈由α-（1→6）和α-（1→3）交替鍵合而成的alternan[10]等。這些結(jié)構(gòu)各異的葡聚糖在改善發(fā)酵制品的質(zhì)地、生物分離（Sephadexgels）、醫(yī)藥（代血漿）等方面發(fā)揮著不同的作用[9]。然而，目前L. mesenteroides多糖通常以化學(xué)合成培養(yǎng)基（Chemically defined medi－um，CDM）[11]為基料發(fā)酵獲得，需經(jīng)不同方法（Sevag 法[12]、三氟三氯乙烷法[13]、三氯乙酸法[14]）提純后才能應(yīng)用于相關(guān)產(chǎn)品中。發(fā)酵基料組成的復(fù)雜性，繁瑣的多糖制備工藝導(dǎo)致的成本問題以及有機(jī)溶劑純化時潛在的殘留風(fēng)險成為L. mesenteroides多糖商業(yè)化應(yīng)用的不利因素。因此，尋找一種來源廣泛、價格低廉、且可直接飲用的發(fā)酵介質(zhì)是L. mesenteroides多糖飲料研發(fā)的關(guān)鍵。

前期研究發(fā)現(xiàn)，L. mesenteroides BD1710（CGMCC NO. 6432）在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中可發(fā)酵產(chǎn)多糖，經(jīng)結(jié)構(gòu)解析確定為右旋糖苷。因此，本文首先比較了BD1710代謝不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基后，其發(fā)酵液的酸度、右旋糖苷及殘余蔗糖的含量，以確定適于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)選培養(yǎng)基配方，進(jìn)而以正交試驗為手段，研究了發(fā)酵液用量、蔗糖和檸檬酸的添加量對飲料感官效果的影響，確定了BD1710番茄汁發(fā)酵飲料的最佳工藝配方。此外，還對優(yōu)選配方制備獲得的飲料的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)進(jìn)行了測定，旨在為開發(fā)一種富含右旋糖苷的的發(fā)酵番茄汁飲料提供必要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種與試驗材料

菌種L. mesenteroides BD1710（CGMCC NO. 6432），由光明乳業(yè)股份有限公司提供；

M17瓊脂/液體培養(yǎng)基：OXOID LTD.，英國；成熟番茄、蔗糖：市售；檸檬酸（食品級）：市售；NaOH、無水乙醇：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備

主要儀器設(shè)備見表1。

表1主要儀器設(shè)備Table 1 Experimental apparatus and equipment

1.3方法

1.3.1工藝流程

工藝流程如下。

1.3.2發(fā)酵種子的制備

從L. mesenteroides BD1710（CGMCC NO. 6432）深冷保藏管中以接種環(huán)挑取少量菌粉劃線于M17蔗糖瓊脂培養(yǎng)[以5.0%（g/mL）蔗糖取代M17培養(yǎng)基中0.5% （g/mL）的乳糖，在120℃下滅菌20 min即得]上，28℃好氧培養(yǎng)24 h取出，用接種環(huán)挑取單菌落接入1 mL M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，采用渦旋混合儀將細(xì)胞均勻分散后，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h取出，再以2 %（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于50 mL上述M17蔗糖液體培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液經(jīng)15 000 g離心10 min后取沉淀，并以相同體積的無菌蒸餾水重懸，即得發(fā)酵用的種子。

1.3.3番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備

1）番茄汁的制備：成熟番茄清洗、去皮，榨汁，果汁部分經(jīng)多層紗布過濾后，經(jīng)15 000 g離心10 min，取清液即得。

2）番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的制備：向100 %（體積分?jǐn)?shù)）的番茄汁中加入5 %、10 %、15 %、20 %（g/mL）的蔗糖，加熱溶解并冷卻后，用5.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，在120℃下滅菌20 min即得相應(yīng)蔗糖濃度的無菌番茄汁蔗糖培養(yǎng)基。

1.3.4 L. mesenteroides BD1710番茄汁蔗糖發(fā)酵液的制備

將1.3.2方法制備的L. mesenteroides BD1710發(fā)酵種子以2.0 %（體積分?jǐn)?shù)）接種量無菌操作接入1.3.3方法制備的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中，180 r/min、28℃搖床恒溫培養(yǎng)48 h即得發(fā)酵液。

1.3.5調(diào)配、均質(zhì)和滅菌

將白砂糖、檸檬酸以一定比例完全溶解于50℃的水中，即得勾兌液。將L. mesenteroides BD1710 48 h的發(fā)酵液與上述勾兌液以一定比例充分混合均勻后在30 MPa壓力下進(jìn)行均質(zhì)，并于100℃滅菌20 min。

1.3.6右旋糖苷含量的測定

將不同時間獲得的發(fā)酵液在沸水浴30 min，冷卻至室溫后加入4倍體積的無菌水稀釋，15 000 g離心10 min，取上清，加入3倍體積經(jīng)過預(yù)冷的無水乙醇，靜置過夜，15 000 g離心10 min，收集沉淀物，沉淀采用少量無水乙醇洗滌后，采用蒸餾水溶解后經(jīng)真空冷凍干燥后即得右旋糖苷，稱重即可。

1.3.7酸度的測定

稱取10 g發(fā)酵液于三角瓶中，加入蒸餾水20 mL、1 %酚酞指示劑3滴，搖勻，以0.1 mol/L NaOH滴定至終點。所用NaOH毫升數(shù)即為發(fā)酵液酸度（°T）。

1.3.8殘余蔗糖含量的測定

吸取20 μL發(fā)酵液原液（或稀釋過的發(fā)酵液）注入1260型高效液相色譜儀（Agilent，美國）進(jìn)行流速為1.0 mL/min的等度洗脫[流動相為乙腈∶水85∶15（體積分?jǐn)?shù)）]，以RID示差檢測器測定待測樣品溶液的響應(yīng)值（峰面積）。所測得的峰面積代入蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積的線性回歸方程式中，求得發(fā)酵液中的蔗糖含量。

1.3.9多糖飲料配方正交試驗設(shè)計

以發(fā)酵液用量（A）、蔗糖添加量（B）、檸檬酸添加量（C）為因素，以飲料的感官風(fēng)味為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗設(shè)計。因素水平表如表2所示。

表2 L9（34）正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.10感官評定標(biāo)準(zhǔn)

由20人組成的感官評定小組按表3所示標(biāo)準(zhǔn)對多糖飲料進(jìn)行感官評定。

表3多糖飲料感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Evaluation standards of polysaccharide drink

2結(jié)果與討論

2.1 L. mesenteroides BD1710優(yōu)選番茄汁蔗糖發(fā)酵液配方的選擇

將L. mesenteroides BD1710接種于不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中，180 r/min、28℃搖床恒溫培養(yǎng)48 h，發(fā)酵終點處各發(fā)酵液中右旋糖苷含量、殘余蔗糖含量與酸度如圖1所示。

圖1蔗糖濃度對右旋糖苷含量、發(fā)酵液殘余蔗糖含量以及酸度的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on acidity，content of dextran and residual-sucrose of culture

從右旋糖苷含量來看，發(fā)酵終點處（48 h），蔗糖濃度為5 %的發(fā)酵液中右旋糖苷含量最低，僅為19 g/L，而右旋糖苷含量最高（32.15 g/L）的發(fā)酵液中蔗糖濃度為15 %，蔗糖濃度為10 %和20 %的發(fā)酵液中右旋糖苷含量分別為28.8 g/L和29.44 g/L。蔗糖濃度與右旋糖苷產(chǎn)量正相關(guān)的現(xiàn)象表明蔗糖是L. mesenteroides BD1710右旋糖苷合成的關(guān)鍵性原料，這與目前關(guān)于L. mesenteroides合成多糖的報道是一致的，這些研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合在L. mesenteroides菌體細(xì)胞壁上的右旋糖苷蔗糖酶（Dextransucrase）可將蔗糖水解，并依靠葡萄糖殘基在主鏈上的聚合延長作用來合成右旋糖苷[15]。

同時，隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的不斷提高（5 %→15 %），發(fā)酵液酸度及其殘余蔗糖含量均有相應(yīng)的增加，為63°T→95°T，6 g/L→41.1 g/L。而當(dāng)蔗糖濃度為20 %時，酸度不再大幅度增加（96°T），而殘余蔗糖含量顯著增加70.8 g/L，這說明L. mesenteroides BD1710 在15 %的蔗糖培養(yǎng)基中生長產(chǎn)酸能力達(dá)到了極限，而更高的蔗糖濃度雖然對酸度沒有過多的影響，但是由于滲透壓過高的原因影響細(xì)胞合成多糖的性能，使其多糖產(chǎn)量反而低于15 %的培養(yǎng)基，同時導(dǎo)致發(fā)酵液中大量蔗糖的殘余。

綜上所述，在蔗糖濃度為15 %（g/mL）的培養(yǎng)基中L. mesenteroides BD1710的產(chǎn)糖、產(chǎn)酸效果最佳，因此是制備發(fā)酵飲料的優(yōu)選培養(yǎng)基。

2.2發(fā)酵飲料配方正交試驗結(jié)果

以發(fā)酵液用量（A）、蔗糖添加量（B）、檸檬酸添加量（C）為因素進(jìn)行L9（34）正交試驗，以確定最佳的原輔料配比方案，結(jié)果見表4。

由表4的R值可知，各因素對L. mesenteroides BD1710多糖飲料影響的主次順序為：A＞C＞B，即多糖發(fā)酵液的用量對飲料品質(zhì)的影響最大，影響較大的是檸檬酸的添加量，而蔗糖添加量影響最小。從k值可知，最佳因素水平組合為A2B2C3，即最佳配方為發(fā)酵液用量30 %（體積分?jǐn)?shù)）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。正交試驗最高評分93分一組試驗配方與最佳配方一致?？沈炞CA2B2C3為最佳配方組合。

表4 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 4 Results of L9（34）orthogonal test

發(fā)酵液的用量是飲料品質(zhì)高低的關(guān)鍵因素，由于明串珠菌多糖在溶液體系中本身具有穩(wěn)定劑的作用[16]，因此，當(dāng)發(fā)酵液用量過低時，會直接影響成品在貨架期的穩(wěn)定性，其次，成品的色澤略淺，特殊的番茄汁風(fēng)味與口感不明顯。而發(fā)酵液用量過高時，飲料顏色略顯渾濁，流動性差。

蔗糖添加量的高低會影響飲料的甜度，其添加量過低時，則無法掩蓋發(fā)酵液中菌株代謝所產(chǎn)生的苦澀味物質(zhì)，給人以不愉快的感覺，而過高時，會因過甜而掩蓋了番茄的特有風(fēng)味。

檸檬酸添加量同樣會對飲料的口感產(chǎn)生影響，適量的添加檸檬酸，會令制成的飲料口感清新、爽口，但若檸檬酸的添加量過高，制成的飲料口感因過酸而破壞了特有的番茄風(fēng)味。

2.3 L. mesenteroides BD1710發(fā)酵飲料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1感官指標(biāo)

色澤：透明、淺澄黃色；酸甜比：適宜；風(fēng)味：具有獨(dú)特的番茄風(fēng)味；口感：柔和、清爽；組織狀態(tài)：均勻無雜質(zhì)，穩(wěn)定且久置無分層和沉淀現(xiàn)象。

2.3.2理化指標(biāo)

右旋糖苷含量：1.0%蔗糖含量：6.5%；檸檬酸濃度：0.2 %。

2.3.3微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤100 CFU/mL；大腸菌群≤5MPN/100mL；霉菌≤30 MPN/100 mL，致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌等）不得檢出。

3　討論

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者在要求飲料美味可口、營養(yǎng)豐富的同時，更希望它們具有一定的益生功能來促進(jìn)人體健康和提高生活質(zhì)量，其中功能性多糖飲料因其免疫調(diào)節(jié)作用的多樣化（抗炎護(hù)肝[17]、促體液免疫與細(xì)胞免疫[18]、改善2型糖尿病[19]等）而受到消費(fèi)者越來越多的追捧。

植物與真菌來源的多糖應(yīng)用相對單一，只能通過熱水浸提法、水提醇沉法[20]、稀酸稀堿提取法[21]、酶法[4]等提取獲得后，再勾兌制成多糖飲料，而細(xì)菌多糖的應(yīng)用顯得更靈活多變，既可通過離心、醇沉等簡易分離手段從產(chǎn)糖發(fā)酵液中方便獲得多糖后再深加工成相應(yīng)飲料，亦可直接保留于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)揮其特定的益生功效與加工性能；其次，鑒于微生物合成代謝的高效性以及所需培養(yǎng)基的廣泛性，獲得細(xì)菌多糖的時間和物料成本均遠(yuǎn)低于其他來源的多糖。盡管細(xì)菌性多糖優(yōu)點眾多，但目前應(yīng)用于飲料的細(xì)菌性多糖種類較少（大多為乳酸菌），加之較低的胞外多糖產(chǎn)率，如嗜熱鏈球菌（230 mg/L~270 mg/L），保加利亞乳桿菌（58 mg/L~540 mg/L）[22]，這些限制性因素成為此類多糖飲料大規(guī)模生產(chǎn)的最大瓶頸。

盡管L. mesenteroides是最早應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)多糖的乳酸菌之一，但其現(xiàn)有的多糖發(fā)酵技術(shù)大多依賴于化學(xué)合成培養(yǎng)基，并且應(yīng)用手段也與植物與真菌多糖相似，同為先提取后添加，鮮有利用多糖發(fā)酵液直接勾兌制備飲料的報道。研究表明，番茄汁對保加利亞乳桿菌[23]、嗜酸乳桿菌[24]以及植物乳桿菌[25]等乳酸菌具有普遍的促生長作用，但鮮見有過L. mesenteroides在番茄汁中發(fā)酵產(chǎn)糖的相關(guān)報道。本文在前期L. mesenteroides BD1710在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)右旋糖苷的研究基礎(chǔ)上，首先，比較了BD1710代謝不同蔗糖濃度的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基后，其發(fā)酵液的酸度、右旋糖苷及殘余蔗糖的含量，確定了適于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)選培養(yǎng)基配方，并探討了發(fā)酵液用量、蔗糖和檸檬酸的添加量對多糖飲料感官效果的影響，明確了發(fā)酵飲料的最佳工藝配方為：發(fā)酵液用量30 %（體積分?jǐn)?shù)）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。在此條件下制備獲得的飲料為淺澄黃色的透明液體，酸甜比適宜，口感柔和、清爽，具有獨(dú)特的番茄風(fēng)味，組織狀態(tài)穩(wěn)定、久置無分層和沉淀現(xiàn)象。該飲料中右旋糖苷含量達(dá)1.0%、蔗糖含量為6.5%、檸檬酸濃度為0.2 %。

以L. mesenteroides發(fā)酵番茄汁蔗糖培養(yǎng)基所獲得的發(fā)酵液，經(jīng)勾兌來制備的發(fā)酵飲料的方法，為以往先提取多糖后添加勾兌的繁復(fù)飲料制備工藝提供了新思路，同時為乳酸菌多糖發(fā)酵果蔬汁在飲料制備方面的應(yīng)用開創(chuàng)了新途徑，因此，可作為一種以天然果蔬汁為發(fā)酵基料大規(guī)模制備乳酸菌多糖飲料的新方法。

4　結(jié)論

1）L. mesenteroides BD1710在接種量2.0 %（體積分?jǐn)?shù)）、初始pH 7.0、番茄汁濃度100 %（體積分?jǐn)?shù)）、蔗糖濃度15 %、發(fā)酵溫度28℃的條件下，其代謝番茄汁蔗糖培養(yǎng)基的48 h發(fā)酵液中右旋糖苷含量為3.215 %、酸度95°T、蔗糖濃度4.11 %，此發(fā)酵液為用于制備發(fā)酵飲料的優(yōu)選勾兌基料。

2）L. mesenteroides BD1710番茄汁發(fā)酵飲料的最佳配方為：48 h發(fā)酵液用量30 %（體積分?jǐn)?shù)）、蔗糖添加量6 %、檸檬酸添加量0.2 %。

3）最佳配方制備的L. mesenteroides BD1710番茄汁發(fā)酵飲料為淺澄黃色的透明液體，酸甜比適宜，口感柔和、清爽，具有獨(dú)特的番茄風(fēng)味，組織狀態(tài)穩(wěn)定、久置無分層和沉淀現(xiàn)象。其中右旋糖苷含量達(dá)1.0 %、蔗糖含量為6.5 %、檸檬酸濃度為0.2 %，并且微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

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Preparation of Fermented Tomato Juice Beverage Rich in Dextran

HAN Jin1，WU Zheng-jun2，YOU Chun-ping3，GAO Cai-xia3
（1. State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China；2. Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology，Shanghai 200436，China；3. Dairy Research Institute，Bright Dairy & Foods Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

Abstract：Leuconostoc mesenteroides BD1710 is capable of synthesis tising dextran by fermenting tomato juice-sucrose medium，and the culture could be used as primary raw material to produce such beverage rich in dextran. According to the orthogonal test results，the optimal processing parameters were as follow：fermentation 30 %（volume fraction）、sucrose 6 % and citric acid 0.2 %. Dextran content in the best formula beverage was above 1.0 %.

Key words：Leuconostoc mesenteroides BD1710；dextran；tomato juice-sucrose medium

收稿日期：2014-06-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.016

作者簡介：韓瑨（1980—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：乳品科學(xué)。

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃課題“發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開發(fā)”（2013BAD18B01）；“十二五”國家863項目“優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)”（2011AA100901）