蘇靜緣，李曉明

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經外科，沈陽 110016

?

柚皮苷對大鼠蛛網膜下腔出血腦血管痙攣及神經元凋亡的影響

蘇靜緣，李曉明*

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經外科，沈陽 110016

[摘要]目的研究柚皮苷對蛛網膜下腔出血(SAH)引起的腦血管痙攣以及神經元凋亡的影響，并分析其潛在機制。方法60只SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、SAH模型組(SAH組)、柚皮苷治療組(Nar組，80 mg/kg)，每組20只。各組10只大鼠取患側大腦皮質勻漿液，檢測MDA含量；另10只大鼠斷頭取腦，固定后常規(guī)包埋后切片，HE染色測基底動脈內徑周長。TUNEL和NEUN免疫熒光雙染檢測大鼠腦皮質神經元凋亡。結果與模型組比較，柚皮苷能明顯降低SAH氧化應激指標MDA的水平(P<0.01)；并顯著抑制腦基底動脈血管痙攣(P<0.01)；免疫熒光結果顯示，柚皮苷能顯著減少SAH大腦皮質神經元凋亡的數(shù)量(P<0.01)。結論柚皮苷可以減輕大鼠SAH后早期腦血管痙攣，減少大腦皮質神經元凋亡的功能，其機制可能與抑制SAH后氧化應激有關。

[關鍵詞]蛛網膜下腔出血；柚皮苷；血管痙攣；凋亡；氧化應激

0引言

蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是最常見的腦血管疾病之一，而腦血管痙攣(Cerebral vasospasm，CVS)作為其嚴重和常見的并發(fā)癥，是其致死、致殘的重要原因。有研究表明，氧化應激是蛛網膜下腔出血發(fā)生腦血管痙攣的重要原因[1]。因此，尋找新的抗氧化劑對CVS進行早期干預對治療SAH具有重要意義。

柚皮苷(Naringin)是中草藥骨碎補、枳實、枳殼、橘紅的主要有效成分，是目前研究、開發(fā)、利用廣泛的天然藥物植物活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗突變等多種活性藥理效能，其神經保護作用在腦缺血[2]、癲疒間[1]等疾病中得到驗證。但有關柚皮苷在SAH治療中的應用目前尚未見報道。本實驗對SAH模型大鼠進行腹腔注射柚皮苷，觀察柚皮苷對SAH引起的腦血管痙攣以及神經元凋亡的影響，旨在為柚皮苷在SAH中的應用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑藥物柚皮苷購自天津士蘭科技有限公司；TUNEL試劑盒和DAPI染液購自武漢博士德試劑公司；兔單克隆NEUN購自santa公司；熒光二抗試劑購自北京中杉金橋公司；MDA檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1.2實驗動物和大鼠蛛網膜下腔出血模型的制備清潔健康雄性SD大鼠，體重210~260 g，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供。術前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺上，頸部正中縱向切口，暴露右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，分離右側頸總動脈，在靠近頸外動脈根部結扎頸外動脈并剪斷，分離頸動脈分叉部；夾閉頸總動脈、頸內動脈。將單絲尼龍線自頸外動脈剪口處插入，松開頸內動脈血管夾，通過頸內動脈到大腦中動脈開口處，至有阻力感后再插入2 mm左右刺破willis環(huán)造成SAH，迅速將尼龍線拔出，整個過程不超過30 s。假手術組除不進線外，其余過程同SAH組。正常組不干預。以大鼠有明確的SAH或血凝塊而無腦實質損害作為建模成功標準。

1.3大鼠分組與給藥將60只SD大鼠隨機分為3組：假手術組(Sham組，20只)，SAH模型組(SAH組，20只)，柚皮苷治療組(Nar組，20只)。給藥組柚皮苷用生理鹽水稀釋后，于SAH后0.5 h和23 h時腹腔注射，濃度80 mg/kg；SAH組給予等體積生理鹽水。

1.4各組MDA活性的檢測各組10只大鼠過量麻醉致死，取腦患側皮質組織勻漿液，根據(jù)試劑盒標準步驟以硫代巴比妥酸鈉法檢測MDA含量，以考馬斯亮藍法檢測勻漿液中蛋白含量。

1.5取材及切片各組另10只大鼠過量麻醉致死后，打開顱骨，剖取基底動脈與其附著的腦干和整個大腦，分離腦干和基底動脈，取包含腦干的基底動脈上1/2段做標本，將基底動脈置于4%中性甲醛固定，取材時保持管壁斷面和血管壁垂直，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋和切片。

1.6基底動脈測量每個基底動脈連續(xù)取3個切片，層厚4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色。在光鏡下觀察，并利用Image Pro-Plus 6.0軟件系統(tǒng)測量每個基底動脈的內徑周長，作為評價CVS程度的指標。

1.7TUNEL和NEUN免疫熒光雙染石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS水洗后，Proteinase K 37 ℃消化15 min，PBS水洗，每張切片滴加TDT+DIG-UTP混合液，37 ℃孵育2 h，PBS水洗，滴加封閉液室溫30 min，甩去不洗，滴加抗地高辛抗體+neun抗體混合液，4 ℃過夜。PBS水洗后滴加熒光二抗(TUNEL-FITC+NEUN+TRITC)37 ℃孵育30 min。最后用DAPI復染細胞核，于熒光顯微鏡下觀察。每例大鼠隨機取6張切片，在出血側大腦皮質區(qū)隨機選取10個不重疊高倍鏡視野(×400)，計數(shù)TUNEL和NEUN陽性細胞數(shù)。

2結果

2.1柚皮苷治療對SAH后大腦皮質MDA含量的影響與Sham組比較，SAH組腦樣本MDA含量明顯升高(P<0.01)；與SAH組比較，Nar組的腦樣本MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　柚皮苷治療對SAH大腦皮質MDA含量的影響

注：*與Sham組比較，#與SAH組比較，P<0.01

2.2柚皮苷治療對SAH基底動脈血管痙攣的影響與Sham組比較，SAH組和Nar組基底動脈管徑及橫截面積均明顯變小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；管壁明顯攣縮增厚。而Nar組基底動脈的管徑及橫截面積均較SAH組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；血管壁的皺縮及增厚程度也較SAH組有所減輕。見圖1、表2。

圖1　柚皮苷治療對SAH基底動脈血管痙攣的影響(HE染色，×100)

組別只數(shù)基底動脈內徑周長(μm)Sham組10295.67±78.45SAH組10205.92±45.14*Nar組10245.78±35.67*#

注：*與Sham組比較，#與SAH組比較，P<0.01

2.3柚皮苷治療對SAH大腦皮質神經元凋亡的影響TUNEL和NEUN免疫熒光雙染結果顯示：Sham組中，TUNEL陽性細胞較少，幾乎沒有；SAH組TUNEL陽性細胞表達數(shù)量高于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，并且部分TUNEL陽性細胞與NEUN共定位，說明凋亡細胞為神經元。Nar組的TUNEL陽性的凋亡細胞數(shù)較SAH組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2、表3。

圖2　柚皮苷治療對SAH大腦皮質神經元凋亡的影響(熒光雙染，×400)

3討論

本實驗應用大腦中動脈穿刺法制備大鼠SAH模型，模擬人類SAH損傷，在SAH后立即給予柚皮苷進行干預治療，經生化水平檢測，柚皮苷能減弱SAH引起的氧化應激指標MDA水平的升高；

表3　柚皮苷治療對SAH大腦皮質神經元

注：*與Sham組比較，#與SAH組比較，P<0.01

運用HE染色定量基底動脈內徑周長以評估動脈痙攣情況，結果顯示，柚皮苷能抑制腦基底動脈血管痙攣；免疫熒光雙染技術檢測大腦皮質神經元凋亡情況，發(fā)現(xiàn)柚皮苷能有效抑制SAH大鼠皮質神經元的凋亡。

動脈瘤破裂引起的SAH是高致死率、致殘率的神經外科疾病，嚴重威脅人類健康[3]。首先，SAH引起的氧化應激反應在SAH后早期CVS的發(fā)生發(fā)展過程起重要作用[4]。SAH后早期，蛛網膜下腔紅細胞崩解釋放大量的氧自由基，包括超氧化物、氫氧根、過氧化氫、一氧化氮和過氧亞硝酸根等；并且還伴隨線粒體呼吸鏈、NADPH酶和抗氧化防御系統(tǒng)的破壞，降低活性氧增加量[1]。血管壁炎癥反應誘導血管內皮細胞凋亡，血管屏障破壞，最終引起CVS[5]。氧自由基還可導致共價鍵的改變，誘導產生多種縮血管物質，如內皮素、血栓素A2、前列腺素H2等，并拮抗NO的舒血管作用，促進CVS發(fā)展。其次，SAH后產生的過量氧自由基可以直接作用于神經細胞膜上的不飽和脂肪酸，破壞神經細胞膜的完整性，引起神經細胞壞死，還可以直接攻擊神經細胞內的線粒體，通過促進脂質過氧化、蛋白質變性、鈣超載、DNA損傷等引起神經元損傷凋亡[6]。腦組織本身對自由基損傷缺乏足夠抵抗力，需要外源性抗氧化劑來清除自由基。因此，有效的抗氧化劑有可能改善CVS和腦神經元凋亡，進而改善SAH。

柚皮苷是一種來自于葡萄柚的類黃酮化合物，在心肌梗死的研究中，應用柚皮苷能有效改善線粒體脂質過氧化和線粒體功能障礙，這說明柚皮苷有抗氧化作用[7-8]。也有研究應用柚皮苷治療紅藻氨酸(Kainic acid)引起的大鼠癲疒間，發(fā)現(xiàn)柚皮苷能穿過血腦屏障，發(fā)揮抗氧化、抗炎的神經保護作用[9]。在缺氧引起的腦損傷中，應用柚皮苷可以明顯減少HIF-1α、VEGF和Caspase-3蛋白的表達，提示柚皮苷在缺氧引起的腦功能障礙中具有神經保護作用[10]。我們應用柚皮苷治療SAH，發(fā)現(xiàn)其同樣能抑制氧化應激，緩解腦血管痙攣和神經元凋亡。

綜上所述，柚皮苷具有減輕大鼠SAH后早期CVS，減少大腦皮質神經元凋亡的功能，其機制可能與抑制SAH后氧化應激有關。然而，柚皮苷對SAH后神經炎癥反應是否有影響目前知之甚少。因此，我們將進一步研究柚皮苷對SAH后神經炎癥的影響。

參考文獻：

[1]Ayer RE,Zhang JH.Oxidative stress in subarachnoid haemorrhage:significance in acute brain injury and vasospasm[J].Acta Neurochir Suppl,2008,104:33-41.

[2]Raza SS,Khan MM,Ahmad A,et al.Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-kappaB signaling pathway in experimental stroke[J].Neuroscience,2013,230:157-171.

[3]Zhang ZY,Sun BL,Yang MF,et al.Carnosine attenuates early brain injury through its antioxidative and anti-apoptotic effects in a rat experimental subarachnoid hemorrhage model[J].Cell Mol Neurobiol,2015,35(2):147-157.

[4]Osuka K,Watanabe Y,Usuda N,et al.Oxidative stress activates STAT1 in basilar arteries after subarachnoid hemorrhage[J].Brain Res,2010,1332:12-19.

[5]Wu Q,Zhang XS,Wang HD,et al.Astaxanthin activates nuclear factor erythroid-related factor 2 and the antioxidant responsive element (Nrf2-ARE) pathway in the brain after subarachnoid hemorrhage in rats and attenuates early brain injury[J].Mar Drugs,2014,12(12):6125-6141.

[6]Zhang T,Su J,Wang K,et al.Ursolic acid reduces oxidative stress to alleviate early brain injury following experimental subarachnoid hemorrhage[J].Neurosci Lett,2014,579:12-17.

[7]Rajadurai M,Prince PS.Naringin ameliorates mitochondrial lipid peroxides,antioxidants and lipids in isoproterenol-induced myocardial infarction in Wistar rats[J].Phytother Res,2009,23(3):358-362.

[8]吳鏗,涂焰明,游瓊.柚皮苷對糖尿病心肌病大鼠心肌組織核因子κB炎癥信號通路的影響[J].中國醫(yī)藥,2013,8(3):295-297.

[9]Golechha M,Chaudhry U,Bhatia J,et al.Naringin protects against kainic acid-induced status epilepticus in rats:evidence for an antioxidant,anti-inflammatory and neuroprotective intervention[J].Biol Pharm Bull,2011,34(3):360-365.

[10]Sarkar A,Angeline MS,Anand K,et al.Naringenin and quercetin reverse the effect of hypobaric hypoxia and elicit neuroprotective response in the murine model[J].Brain Res,2012,1481:59-70.

Effects of naringin on cerebral vasospasm and apoptosis after subarachnoid hemorrhage in ratsSU Jing-yuan,LI Xiao-ming*(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of naringin on cerebral vasospasm and neuronal apoptosis induced by subarachnoid hemorrhage in rats,and analyze the potential mechanisms.MethodsSixty SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham group),SAH group,and naringin group (Nar group,80 mg/kg),20 rats in each group. Among 10 rats in each group,ipsilateral hemispheres of brains were homogenized to detect the MDA level. Another 10 rats’ brains were dissected and fixed-embedded sections,HE staining was conducted to detect the basilar artery diameter. The neuronal apoptosis was detected by immunofluorescent double staining with TUNEL and NEUN antibody.ResultsCompared with SAH group,naringin significantly attenuated the level of MDA-an oxidative stress marker (P<0.01),and inhibited cerebral vasospasm (P<0.01). The result of immunofluorescent double staining showed that naringin significantly attenuated the neuron apoptosis in brain cortex (P<0.01).ConclusionNaringin can attenuate cerebral vasospasm and decrease the number of neuron apoptosis in brain cortex in rats after SAH,the potential mechanism may be related with anti-oxidant after SAH.

Key words：Subarachnoid hemorrhage;Naringin;Cerebral vasospasm;Apoptosis;Oxidative stress

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601002

*通信作者

收稿日期：2015-06-15