王曉曄,石博妹,王英群,李　珣,劉徳玉,李　銘,李芳芳,胡傳活

(1.廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧　530005;2.廣西畜禽品種改良站,廣西 南寧　530001)

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抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)純化

王曉曄1,石博妹1,王英群2,李珣1,劉徳玉2,李銘2,李芳芳2,胡傳活1

(1.廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧530005;2.廣西畜禽品種改良站,廣西 南寧530001)

摘要：人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-xL能保護(hù)多種因素引起的細(xì)胞異常凋亡,為了獲得高純度Bcl-xL與PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝臟總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)計(jì)引物以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Bcl-xL基因,構(gòu)建pUM19-T-Bcl-xL質(zhì)粒,并對質(zhì)粒雙酶切鑒定和測序鑒定;其次設(shè)計(jì)包含PTD序列的Bcl-xL引物,以測序正確的pUM19-T-Bcl-xL質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PTD-Bcl-xL序列,將擴(kuò)增序列克隆入pET28a載體,構(gòu)建PTD-Bcl-xL蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-PTD-Bcl-xL,并對pET28a-PTD-Bcl-xL載體雙酶切鑒定和測序鑒定;將pET28a-PTD-Bcl-xL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),并對IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)的濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行了優(yōu)化;SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白的可溶性情況,在變性條件下用Ni-NTA瓊脂純化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及質(zhì)譜對融合蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明:雙酶切pUM19-T-Bcl-xL質(zhì)粒出現(xiàn)約774 bp大小條帶,pUM19-T-Bcl-xL質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對序列一致,表明成功構(gòu)建pUM19-T-Bcl-xL質(zhì)粒;雙酶切pET28a-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒出現(xiàn)約744 bp大小條帶,pET28a-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期序列一致,表明成功構(gòu)建了pET28a-PTD-Bcl-xL原核表達(dá)載體;在IPTG誘導(dǎo)下pET28a-Bcl-xL重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)出36 kDa大小蛋白,最優(yōu)IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L,最佳IPTG誘導(dǎo)時間為6 h;SDS-PAGE電泳顯示融合蛋白主要出現(xiàn)在菌液超聲后的沉淀里,以包涵體形式表達(dá),經(jīng)Ni-NTA瓊脂純化獲得了高純度的融合蛋白;Western Blot 和質(zhì)譜鑒定證明IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白和純化的融合蛋白為PTD-Bcl-xL蛋白。純化得到了PTD-BcL-xL融合蛋白,推進(jìn)了 PTD-Bcl-xL蛋白在豬、牛等家畜精液冷凍保存的應(yīng)用進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：Bcl-xL蛋白;PTD;原核表達(dá);蛋白純化

Bcl-2家族蛋白是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子,Bcl-xL和Bcl-xS是Bcl2L1編碼的2個剪接變異體,Bcl-xL蛋白具有抗凋亡作用,Bcl-xS發(fā)揮促凋亡作用。Bcl-xL主要分布在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜,與Bad、Bax等促凋亡蛋白結(jié)合形成異源二聚體[1]抑制其發(fā)揮促凋亡作用,Bcl-xL蛋白能使從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至線粒體的Bax重新回歸細(xì)胞質(zhì)[2],Bcl-xL蛋白還能與Beclin-1蛋白結(jié)合,從而提高細(xì)胞的存活率[3]。在人類胚胎干細(xì)胞中,過度表達(dá)Bcl-xL的細(xì)胞出現(xiàn)與含有CNV(Copy number variant)染色體干細(xì)胞有相似的生長特性,一旦抑制Bcl-xL蛋白表達(dá),CNV細(xì)胞生長優(yōu)勢受到限制,提示Bcl-xL在CNV細(xì)胞生長中起到關(guān)鍵作用[4]。在神經(jīng)系統(tǒng)中,Bcl-xL蛋白不僅能幫助神經(jīng)體抵抗死亡刺激,還能促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸的生長發(fā)育[5]。多種資料提示Bcl-xL蛋白在體內(nèi)外都能發(fā)揮重要的抗凋亡作用。

蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域結(jié)構(gòu)(Protein transduction domains,PTD)是一段由11個氨基酸(YGRKKRRQRRR)組成的短肽[6],能行使跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能[7],并且能通過共價連接和非共價連接的方式介導(dǎo)外源的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、核酸、藥物等多種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞[8-9],轉(zhuǎn)運(yùn)過程不依賴受體和蛋白載體,也不需要能量參與[10]。目前,國內(nèi)少有關(guān)于PTD-Bcl-xL蛋白的研究報(bào)道。因此,本研究利用PTD蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)快速、高效、無細(xì)胞毒性的特點(diǎn),將PTD蛋白和Bcl-xL蛋白融合在一起,用RT-PCR擴(kuò)增大鼠Bcl-xL基因,構(gòu)建Bcl-xL高效克隆質(zhì)粒和PTD-Bcl-xL的原核表達(dá)質(zhì)粒,誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)PTD-Bcl-xL融合蛋白,并對表達(dá)蛋白進(jìn)行分離、純化和鑒定,目的是為了獲得PTD-Bcl-xL融合蛋白,為進(jìn)一步研究PTD-Bcl-xL蛋白在組織細(xì)胞和動物精子冷凍保存的應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)動物

SD大鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2菌株載體及試劑

克隆宿主菌E.coliDH5α、表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)、表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a均為廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院解剖實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體質(zhì)粒pUM19-T、TRIzol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqPlus Master Mix、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ和SalⅠ、T4連接酶、抗His標(biāo)簽抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG均為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;蛋白Marker為Thermo公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒為Biomiga公司產(chǎn)品。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的大鼠Bcl-xL基因序列(Accession No.U72350),設(shè)計(jì)一對引物:上游引物Bcl-F,5′-TCACTTCCGACTGAA-3′;下游引物Bcl-R,5′-ATGTCTCAGAGCAAC-3′。同時設(shè)計(jì)含有PTD基因的另一條引物:上游引物Bcl-PTD-F,5′-ATT GAATTCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACG AAGAATGTCTCAGAGCAACCGG-3′(下劃線處為EcoR Ⅰ識別位點(diǎn));下游引物Bcl-PTD-R,5′-AGT GTCGACCTTCCGACTGAAGAGTG-3′(下劃線處為SalⅠ識別位點(diǎn)),均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4Bcl-xL基因的擴(kuò)增、克隆與鑒定

取大鼠肝臟組織,用TRIzol試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈(反應(yīng)條件:25 ℃ 5 min,50 ℃ 45 min,85 ℃ 5 min),以2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,Bcl-R和Bcl-F為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性 30 s,56 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,循環(huán)數(shù)為35;最后于72 ℃延伸7 min。預(yù)期產(chǎn)物分子量為702 bp。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物純化回收后克隆入pUM19-T載體,再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α,陽性單菌落經(jīng)PCR和EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定后,送華大基因公司進(jìn)行目的基因測序。

1.5PTD-Bcl-xL基因的擴(kuò)增

以測序正確的pUM19-T-Bcl-xL質(zhì)粒為模板,用引物PTD-BcL-R和PTD-Bcl-F進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)條件同1.4),PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,對正確PCR產(chǎn)物片段用膠純化回收試劑盒回收。

1.6PTD-Bcl-xL融合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將PTD-Bcl-xL的PCR產(chǎn)物膠純化回收及載體質(zhì)粒pET28a分別進(jìn)行EcoR Ⅰ和SaIⅠ雙酶切,然后用T4連接酶將PTD-Bcl-xL的cDNA片段與線性化載體質(zhì)粒pET28a連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性單菌落經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定后抽提陽性質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒命名為pET28a-PTD-Bcl-xL。

1.7誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)IPTG濃度的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒pET28a-PTD-Bcl-xL轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,以1∶100比例接種至新的LB(含卡那霉素100 mg/mL)培養(yǎng)基中培養(yǎng),至OD600=0.4~0.6時,IPTG濃度優(yōu)化試驗(yàn)分6組進(jìn)行,第1組為不加IPTG誘導(dǎo)組,第2組為pET28a空載體誘導(dǎo)組(0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)),第3~6組IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.1,0.5,1.0,1.5 mmol/L誘導(dǎo)5 h后收集菌體,進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳分析。

1.8誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)時間的優(yōu)化

當(dāng)OD600=0.4~0.6時,加入濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),分8組進(jìn)行試驗(yàn),第1~8組IPTG誘導(dǎo)時間分別為0,2,3,4,5,6,7,8 h,收集菌體,進(jìn)行全菌SDS-PAGE電泳分析。

1.9融合蛋白表達(dá)的可溶性分析

當(dāng)OD600=0.4~0.6時,加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol/L,37 ℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)6 h收集菌體,用0.02 mol/L PBS(pH值8.0)重懸,超聲破碎(50 W,工作5 s,間隔5 s,超聲2 min),12 000 r/min 15 min離心收集上清和沉淀,沉淀用PBS液重懸。將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.10融合蛋白純化

將含有重組質(zhì)粒的陽性菌按1∶100的體積比接種到500 mL含100 mg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6時,加入IPTG使其終濃度0.1 mmol/L,誘導(dǎo)6 h后收集菌體,用0.02 mol/L PBS(pH值8.0)液重懸菌體,超聲破碎(50 W工作5 s,間隔5 s,超聲20 min),10 000 r/min 30 min離心,棄上清,保留沉淀,蛋白的純化依照QIAGEN公司Ni-NTA(Nickel-nitriacetic acid) argrose使用方法[11]進(jìn)行操作。

1.11原核表達(dá)產(chǎn)物和純化蛋白的Western Blot分析

確定融合蛋白最優(yōu)表達(dá)條件后,取誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和純化后的洗脫蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE分析,用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC(硝酸纖維素)膜上;然后用麗春紅染色,洗膜;用PBST配制的5%脫脂乳封閉1 h,PBST洗膜;一抗用抗His標(biāo)簽抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h,洗膜;二抗山羊抗鼠IgG(1∶10 000)孵育40 min,洗膜;用ECL發(fā)光顯色法顯色3 min,用透明保鮮膜封閉放入暗盒曝光5 min,再放入顯影液顯色,定影液定影1 min,用掃描儀掃描圖片保存。

1.12洗脫蛋白的質(zhì)譜鑒定

將Western Blot鑒定正確的純化后蛋白跑SDS-PAGE電泳,用R250考馬斯亮藍(lán)染液染色后切下蛋白條帶,送廣西大學(xué)亞熱帶生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室用基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(型號MALDI-TOF 4800 plus ABSciex公司)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1Bcl-xL基因擴(kuò)增及pUM19-T-Bcl-xL重組質(zhì)粒鑒定

Bcl-xL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在預(yù)期位置出現(xiàn)約為702 bp單一條帶(圖1-A)。將該片段插入pUM19-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切、瓊脂糖電泳,在預(yù)期位置出現(xiàn)一條約774 bp的單一片段(圖1-B)。將構(gòu)建的pUM19-T-Bcl-xL重組質(zhì)粒送測序、拼接,序列與NCBI數(shù)據(jù)庫提供的序列完全一致,提示擴(kuò)增到Bcl-xL基因CDS區(qū)全長序列,成功構(gòu)建pUM19-T-Bcl-xL重組質(zhì)粒。

2.2PTD-Bcl-xL基因擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

pUM19-T-Bcl-xL基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳,在預(yù)期位置出現(xiàn)735 bp大小單一條帶(圖2-A)。膠回收PCR產(chǎn)物,將膠回收產(chǎn)物和pET28a(+)載體分別經(jīng)過雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,構(gòu)建pET28a-PTD-Bcl-xL的重組質(zhì)粒,經(jīng)EcoR Ⅰ和SalⅠ雙酶切、瓊脂糖電泳后出現(xiàn)約744 bp大小條帶,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2-B)。經(jīng)測序正確,表明成功構(gòu)建了PTD-Bcl-xL原核表達(dá)載體。

A.Bcl-xL基因的RT-PCR擴(kuò)增:M.DL2000 DNA Marker;1.Bcl-xL基因;2.陰性對照;B.pUM19-T-Bcl-xL重組質(zhì)粒酶切鑒定:

A.PTD-Bcl-xL基因的RT-PCR擴(kuò)增:M.DL2000 Marker;1.PTD-Bcl-xL基因;2.陰性對照;B.pET28a-PTD-Bcl-xL重組質(zhì)粒酶切鑒定:

2.3不同IPTG濃度與PTD-Bcl-xL融合蛋白表達(dá)量的關(guān)系

鑒于不同IPTG濃度在蛋白表達(dá)過程中的重要作用,本試驗(yàn)摸索了 0,0.1,0.5,1.0,1.5 mmol/L 5種 IPTG 濃度與融合蛋白表達(dá)的量的關(guān)系,SDS-PAGE電泳分析顯示,以未誘導(dǎo)和空載體誘導(dǎo)為對照,發(fā)現(xiàn)在36 kDa大小處誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白,但是IPTG濃度在0.1~1.5 mmol/L對PTD-Bcl-xL融合蛋白表達(dá)量的影響不明顯(圖3),因此,鑒于IPTG對細(xì)菌的毒性,最終選擇的IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo);2.pET28a空載體的IPTG誘導(dǎo)表達(dá);3~6.分別為0.1,0.5,1.0,1.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

M.Protein Marker;1.Expression without IPTG induction;2.Expression of pET28a with IPTG induction;3-6.Expression of PTD-Bcl-xL with 0.1,0.5,1.0,1.5 mmol/L IPTG induction.

圖3不同IPTG濃度與融合蛋白表達(dá)量的關(guān)系

Fig.3Relationship between different concentration

of IPTG and fusion protein expression

2.4IPTG不同誘導(dǎo)時間與PTD-Bcl-xL融合蛋白表達(dá)量的關(guān)系

為了探索融合蛋白表達(dá)的最優(yōu)IPTG誘導(dǎo)時間,筆者分析了IPTG誘導(dǎo)2~8 h融合蛋白表達(dá)量,以未誘導(dǎo)的菌液為對照,其結(jié)果表明,在IPTG誘導(dǎo)的各個時間段均有約36 kDa融合蛋白的表達(dá);且表達(dá)量隨著IPTG誘導(dǎo)時間的增加而增多,但是6~8 h之間融合蛋白表達(dá)量差異不明顯(圖4),因此,選擇6 h作為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的最佳時間。

2.5PTD-Bcl-xL融合蛋白表達(dá)的可溶性分析與純化

用試驗(yàn)確定的IPTG最佳誘導(dǎo)時間和濃度誘導(dǎo)表達(dá)PTD-Bcl-xL融合蛋白,SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物主要存在于菌體超聲破碎的沉淀中,以包涵體的形式表達(dá)(圖5-A)。將包涵體用低濃度尿素洗滌后,高濃度尿素溶解,鎳離子親和層析柱純化,一次純化就能得到較高純度的融合蛋白(圖5-B)。

2.6PTD-Bcl-xL融合蛋白的Western Blot 鑒定

Western Blot鑒定結(jié)果顯示,未誘導(dǎo)的菌體超聲后上清和沉淀未出現(xiàn)特異性條帶;誘導(dǎo)的菌體超聲后沉淀中出現(xiàn)PTD-Bcl-xL特異性條帶,而上清中在相應(yīng)位置未出現(xiàn)陽性反應(yīng)(圖6-A)。純化后蛋白Western Blot 分析出現(xiàn)特異性條帶(圖6-B)。

2.7融合蛋白的質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜測序結(jié)果證實(shí)所純化蛋白為PTD-Bcl-xL蛋白(圖7)。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1.未誘導(dǎo);2~8.IPTG誘導(dǎo)

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量;A.融合蛋白的溶解性分析:1.裂解上清;2.裂解沉淀;3.未誘導(dǎo)上清;

A.表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot鑒定:M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量;1~2.裂解沉淀;3.裂解上清;

圖7　PTD-Bcl-xL MS+MS/MS鑒定結(jié)果

3結(jié)論與討論

本研究以大鼠肝臟總RNA為模板,通過RT-PCR成功擴(kuò)增出Bcl-xL基因編碼區(qū)702 bp全長序列,設(shè)計(jì)引物將PTD的11個氨基酸(YGRKKRRQRRR)序列設(shè)計(jì)在Bcl-xL編碼區(qū)的5′端,之后以pUM19-T-Bcl-xL為模板,用RT-PCR的方法擴(kuò)增了PTD-Bcl-xL序列,定向插入pET28a載體中,雙酶切和測序均證實(shí)pET28a-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒的正確性,表明成功構(gòu)建了pET28a-PTD-Bcl-xL原核表達(dá)質(zhì)粒。

在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)中myc標(biāo)簽和his標(biāo)簽是常用的融合標(biāo)簽,myc重組蛋白在低pH值洗脫過程中會降低蛋白的活性,常用于目的蛋白的檢測,而his標(biāo)簽不存在這個問題,且his標(biāo)簽只有6個氨基酸,分子量小,不會改變目的蛋白自身的可溶性,在pH值8.0時,不攜帶電荷,對蛋白的折疊、構(gòu)象形成等影響較小,容易分離純化。Asoh等[12]曾用myc標(biāo)簽成功表達(dá)了PTD-myc-Bcl-xL融合蛋白,而用其他標(biāo)簽表達(dá)PTD-Bcl-xL融合蛋白在國內(nèi)外未曾報(bào)道,pET28a是融合型原核表達(dá)載體,融合標(biāo)簽為6×his-tag,因此,本試驗(yàn)選用pET28a載體表達(dá)PTD-Bcl-xL融合蛋白。

將pET28a-PTD-Bcl-xL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時,筆者對誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的最佳條件進(jìn)行了探索。鑒于IPTG誘導(dǎo)濃度對蛋白表達(dá)的重要作用,首先進(jìn)行IPTG濃度梯度誘導(dǎo)蛋白表達(dá)試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1~1.5 mmol/L 時均能誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),且不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)量差異不明顯,提示IPTG濃度對PTD-Bcl-xL融合蛋白的表達(dá)影響較小,考慮到IPTG對細(xì)菌生長的毒害作用,確定IPTG工作濃度為0.1 mmol/L。同時,筆者也分析了IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時間與蛋白表達(dá)量的關(guān)系。SDS-PAGE結(jié)果提示,隨IPTG誘導(dǎo)時間增長融合蛋白表達(dá)量呈上升趨勢,6~8 h表達(dá)量最高。因此,將6 h作為后續(xù)試驗(yàn)的誘導(dǎo)時間。PTD-Bcl-xL融合蛋白主要存在于菌體超聲后的沉淀里,以包涵體形式表達(dá),與Ozaki等[13]的研究結(jié)果一致。筆者嘗試不同溫度誘導(dǎo)蛋白表達(dá),由于低溫(<20 ℃)融合蛋白仍以包涵體表達(dá)為主,因此,選擇37 ℃為誘導(dǎo)表達(dá)溫度。在未誘導(dǎo)的菌體和空載體誘導(dǎo)中,也出現(xiàn)與融合蛋白大小相近的雜蛋白,推測是 BL21(DE3)菌種自身能表達(dá)這種大小相適蛋白,在后期純化過程中能洗脫下去。pET28a-PTD-Bcl-xL重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白大小約36 kDa,比預(yù)計(jì)的PTD-Bcl-xL融合蛋白分子量要大,推測可能是由于Bcl-xL蛋白修飾引起的,后續(xù)試驗(yàn)對表達(dá)蛋白進(jìn)行了Western Blot 和質(zhì)譜鑒定,當(dāng)證實(shí)所誘導(dǎo)表達(dá)和純化的蛋白為PTD-BcL-xL融合蛋白。

包涵體表達(dá)與可溶性表達(dá)相比,有蛋白不容易降解、純化方便[14]等自身的優(yōu)勢。為了提高純化效率,在純化融合蛋白之前對包涵體進(jìn)行了洗滌,洗滌液用2 mol/L尿素的0.02 mol/L PBS液(含0.1%Txion-100),低濃度尿素添加0.1%Txion-100洗滌后包涵體純度有所提高,在后續(xù)蛋白純化洗脫雜蛋白時洗脫液BufferC、BufferD中雜蛋白含量較少。8 mol/L尿素屬于中強(qiáng)度蛋白變性劑,對包涵體氫鍵有較強(qiáng)的可逆變性作用。此外,高濃度的尿素對包涵體的溶解度高達(dá)90%,且在變性條件下his標(biāo)簽?zāi)軌蛲耆┞对诒砻?提高與Ni-NTA的結(jié)合能力,增加純化效率,提高純化產(chǎn)量。Ni-NTA瓊脂糖是用于純化6×his 標(biāo)簽融合蛋白的一種介質(zhì),能在變性或非變性條件下純化各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的his標(biāo)簽蛋白。his標(biāo)簽融合蛋白能與Ni-NTA上的Ni2+螯合,從而使其他非特異性蛋白洗脫出來。

有關(guān)PTD-Bcl-xL融合蛋白包涵體表達(dá)復(fù)性后的活性問題,Chen等[15-16]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),復(fù)性后的PTD-Bcl-xL及其功能增強(qiáng)型堿基突變體PTD-FNK具備良好的穿膜和抗凋亡特性,能夠在30~60 min進(jìn)入細(xì)胞定位于線粒體,對多種類型因素引起的細(xì)胞死亡都有保護(hù)作用[17-19],且能顯著地改善冷凍后豬精液的質(zhì)量[20]。由于豬精子對低溫敏感，豬精液低溫保存技術(shù)自出現(xiàn)以來雖有進(jìn)步，但商業(yè)化豬凍精沒有很大突破[21]，對此國內(nèi)研究者將抗凋亡藥物添加到精液低溫保存稀釋液，許春榮等[22]發(fā)現(xiàn)葛根素、酒石酸美托洛爾和二氯乙酸鈉能有效地延長低溫保存時豬精子的存活時間，楊尚雪[21-24]黃芪多糖、水蛭素添加到精液冷凍保存稀釋液中能顯著提高凍后精子活力。目前，國內(nèi)尚未有將抗凋亡蛋白應(yīng)用于精液冷凍保存的研究及抗凋亡 PTD-Bcl-xL融合蛋白研究報(bào)道。

本試驗(yàn)成功地表達(dá)了PTD-Bcl-xL蛋白,優(yōu)化了PTD-Bcl-xL的表達(dá)條件,獲得了高純度的PTD-Bcl-xL融合蛋白,為研究Bcl-xL蛋白對動物細(xì)胞的保護(hù)作用及其在家畜精液低溫保存中提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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Prokaryotic Expression Plasmid Construction and Expression/Purification of Anti-apoptotic Fusion Protein PTD-Bcl-xL

WANG Xiaoye1,SHI Bomei1,WANG Yingqun2,LI Xun1,LIU Deyu2,LI Ming2,LI Fangfang2,HU Chuanhuo1

(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning530005,China;2.Guangxi Work Station of Livestock & Poultry Breed Improvement,Nanning530001,China)

Abstract：Artificial anti-apoptotic protein PTD-Bcl-xL can control abnormal apoptosis induced by a variety of factors.The present study was to obtain a high-purity Bcl-xL and PTD (Protein transduction domains) fusion protein.SD rat liver total RNA was extracted by TRIzol and transcribed into cDNA.Bcl-xL gene was amplified by PCR with cDNA as a template and was cloned into pUM19-T vector to construct pUM19-T-Bcl-xL plasmid,which was Identified by restriction enzyme digestion and sequencing and the pUM19-T-Bcl-xL plasmid was used as a template to amplify PTD-Bcl-xL fragment which was cloned into vector pET28a to construct recombinant plasmid pET28a-PTD-Bcl-xL and PTD sequence were designed to be placed before the Bcl-xL by designing primers.Then the recombinant plasmid was identified by restriction enzyme and was transformed into E.coli BL21(DE3),PTD-Bcl-xL fusion protein was induced to express with different IPTG concentration and induction time.Then the expression culture was analyzed for it′s solubility and was prepared to purify PTD-Bcl-xL fusion protein with Ni-NTA agarose under denaturing condition.Finally,the expressing culture and purified protein was identified with SDS-PAGE analysis,Western Blot and MS.The results showed that detected by sequencing and enzyme digestion plasmid pUM19-T-Bcl-xL was constructed;prokaryotic expression vector pET28a-PTD-Bcl-xL was constructed with confirmed by sequencing and enzyme digestion;The fused protein PTD-Bcl-xL could be expressed by IPTG induction with 0.1 mmol/L IPTG induction 6 hours for well expression;The fusion protein expressed in an insoluble form of inclusion bodies and a high-purity fused protein was obtained with Ni-NTA agarose purification;the expressing culture and purified protein were proved to be the PTD-Bcl-xL fusion protein with SDS-PAGE,Western Blot and MS analysis.This study obtains purified PTD-BcL-xL fusion protein and promotes the application process PTD-Bcl-xL protein in pork,beef and other livestock semen cryopreservation.

Key words:Bcl-xL protein;PTD;Prokaryotic expression;Protein purification

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.001

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0001-07

作者簡介：王曉曄(1987-),男,山東濰坊人,講師,博士,主要從事獸醫(yī)外科學(xué)及產(chǎn)科學(xué)研究。王曉曄、石博妹、王英群、李珣為同等貢獻(xiàn)作者。通訊作者：胡傳活(1964-),男,廣西平南人，教授，博士，主要從事動物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科能1598022-2);廣西畜禽品種改良站橫向科技項(xiàng)目(20140220)

收稿日期：2015-09-24