萬(wàn)玉林， 葛玉鳳， 武發(fā)菊， 安芳蘭， 劉學(xué)榮， 楊進(jìn)才， 張?jiān)频隆?中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

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獸用疫苗生產(chǎn)中支原體污染檢測(cè)和預(yù)防

萬(wàn)玉林， 葛玉鳳， 武發(fā)菊， 安芳蘭， 劉學(xué)榮*， 楊進(jìn)才， 張?jiān)频?中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

摘要細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染嚴(yán)重影響獸用生物制品的質(zhì)量和安全性，會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)獸用疫苗生產(chǎn)中支原體污染檢測(cè)方法、相關(guān)衍生技術(shù)及其預(yù)防控制等方面進(jìn)行了綜述，旨在為獸用生物制品生產(chǎn)過(guò)程中支原體污染的檢測(cè)工作提供參考。

關(guān)鍵詞支原體；疫苗生產(chǎn)；污染；檢測(cè)；預(yù)防

1898年，Nocard和Reux首次從患傳染性胸膜肺炎病牛中分離出支原體。隨著診斷技術(shù)的提高，人們對(duì)支原體的認(rèn)識(shí)不斷深入，目前在自然界中該類微生物近100余種，可直接或間接引起人類及動(dòng)植物各種疾病。國(guó)內(nèi)外均有研究表明，支原體感染可引發(fā)人和動(dòng)物呼吸道感染、生長(zhǎng)發(fā)育停滯及免疫系統(tǒng)損傷，同時(shí)對(duì)以培養(yǎng)細(xì)胞為材料的生物制品生產(chǎn)亦是棘手問題，因而引起了醫(yī)學(xué)界和獸醫(yī)工作者的廣泛關(guān)注。筆者對(duì)獸用生物制品生產(chǎn)中3種支原體檢測(cè)方法(傳統(tǒng)檢測(cè)法、血清學(xué)檢測(cè)法及分子生物學(xué)法)及相關(guān)衍生技術(shù)進(jìn)行了比較，并結(jié)合了預(yù)防支原體污染的有效措施，以期為獸用疫苗生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染提供準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段。

1支原體的特性及檢測(cè)重要性

支原體(Mycoplasma)隸屬柔膜體綱，是一類缺乏細(xì)胞壁的原核微生物，其個(gè)體微小，介于細(xì)菌和病毒之間，呈高度多態(tài)性，可通過(guò)常用的濾菌器，其毒株主要通過(guò)特殊的結(jié)構(gòu)黏附于宿主細(xì)胞膜上，并與相應(yīng)的受體結(jié)合，引起宿主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變及誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生某些細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素、干擾素等，從而促使宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)異常誘發(fā)各種疾病。在獸用疫苗生產(chǎn)中，由支原體引起的細(xì)胞污染發(fā)生率可達(dá)30%～60%，支原體污染可引起細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、DNA片段化及碳水化合物、核酸和蛋白質(zhì)的合成受阻[1]，進(jìn)而影響獸用生物制品的質(zhì)量和安全性。寧宜寶等[2]采用培養(yǎng)分離法對(duì)78批普通雞胚制活毒疫苗和31批雞胚成纖維細(xì)胞制疫苗進(jìn)行了支原體檢測(cè)，結(jié)果表明國(guó)內(nèi)普通疫苗和細(xì)胞生產(chǎn)活毒疫苗支原體污染嚴(yán)重，不僅造成了生物制藥企業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)疾病防疫工作帶來(lái)困難。WHO和新獸藥典規(guī)定所有細(xì)胞生產(chǎn)的活疫苗都不能檢測(cè)到支原體污染，因此在生物制品生產(chǎn)過(guò)程中支原體的檢測(cè)工作極為重要。

2支原體的檢測(cè)

2.1傳統(tǒng)檢測(cè)方法

2.1.1直接培養(yǎng)法。在《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010年版附錄[3]中有規(guī)定，支原體直接培養(yǎng)法為支原體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過(guò)將樣品接種到支原體培養(yǎng)基上，觀察液體培養(yǎng)基的顏色變化和固體培養(yǎng)基上是否有支原體菌落來(lái)判斷試驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確率高，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般在28 d左右，并且在同一培養(yǎng)基中不能完全檢測(cè)出所有的支原體類型，常用于對(duì)種毒和成品的檢測(cè)。

2.1.2DNA熒光染色法。DNA熒光染色法，又稱指示細(xì)胞法，是將待測(cè)樣品接種于指示細(xì)胞中培養(yǎng)，以特異性熒光染料染色，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察附著在細(xì)胞表面的支原體DNA著色來(lái)判斷有無(wú)支原體污染。此檢測(cè)方法耗時(shí)短，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，且能檢測(cè)出培養(yǎng)法無(wú)法檢測(cè)的支原體，若在配苗前進(jìn)行初檢，去除不合格樣品，可以有效減少生產(chǎn)損失，保證疫苗質(zhì)量。唐書謙等[4]分別采用DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中常用細(xì)胞系及培養(yǎng)基進(jìn)行了支原體檢測(cè)，結(jié)果表明DNA熒光染色法較直接培養(yǎng)法敏感性高，簡(jiǎn)單、方便，需時(shí)較少，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

1987年，美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)提出對(duì)全部細(xì)胞系和用細(xì)胞生產(chǎn)的活疫苗必須檢查支原體，推薦采用DNA熒光染色法[5]。但是，因細(xì)胞核酸碎片易黏附至細(xì)胞膜上或樣品原因極易引起誤判，因此需要更簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法。2.2血清學(xué)法

2.2.1被動(dòng)顆粒凝集試驗(yàn)(PPA) 。將可溶性抗原或抗體吸附于與免疫無(wú)關(guān)的、一定大小的顆粒狀載體表面，并與相應(yīng)的抗體或抗原作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下即可發(fā)生凝集，稱為被動(dòng)顆粒凝集反應(yīng)。此方法可應(yīng)用于細(xì)菌、支原體的鑒定和抗體的定性檢測(cè)。吳曉等[6]分別用被動(dòng)顆粒凝集試驗(yàn)、ELISA法、金標(biāo)滲濾法及冷凝集試驗(yàn)進(jìn)行了肺炎支原體的檢測(cè)，通過(guò)比較不同滴度抗體的靈敏性和特異性，結(jié)果表明被動(dòng)凝集法操作簡(jiǎn)單，精確性和敏感度更高，更適宜于臨床應(yīng)用。

2.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。1971年，Engvall 等[7]建立了一種生物活性物質(zhì)微量測(cè)定新技術(shù)，即ELISA 檢測(cè)法，是目前診斷人和動(dòng)物肺炎支原體的較實(shí)用和可靠的方法之一，主要包括間接法、雙抗體夾心法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法。因其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，具有良好的特異性和敏感性，一次可以完成大量樣品的檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)用作為肺炎支原體檢測(cè)的常規(guī)方法。崔玉明等[8]用不與Mg發(fā)生交叉反應(yīng)的Mp單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)上呼吸道分泌物中肺炎支原體抗原的方法，為臨床診斷Mp感染提供了一種有效的方法。

2.3分子生物學(xué)技術(shù)

2.3.1PCR檢測(cè)技術(shù)。由于支原體生長(zhǎng)緩慢、營(yíng)養(yǎng)要求高、種間存在交叉抗原等生物學(xué)特性，支原體的傳統(tǒng)檢測(cè)法和血清學(xué)法具有一定的局限性[9]。隨著對(duì)支原體的核酸結(jié)構(gòu)、分子組成及其特異性的了解，20世紀(jì)90年代初國(guó)際上已將PCR技術(shù)應(yīng)用于支原體檢測(cè)中，其主要通過(guò)病毒模板RNA/DNA抽提、PCR擴(kuò)增、電泳等技術(shù)觀察目的條帶的存在與否，判斷樣品有無(wú)支原體污染。賈麗艷等[10]運(yùn)用支原體的16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以獸用生物制品中常見的支原體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了獸用疫苗支原體污染的PCR檢測(cè)方法。該方法與傳統(tǒng)的直接培養(yǎng)法相比具有更高的特異性和靈敏性，已廣泛應(yīng)用于獸用生物制品的生產(chǎn)中，但其對(duì)試驗(yàn)環(huán)境和儀器要求高，易交叉污染[11]。

2.3.2巢式PCR 檢測(cè)法。在PCR方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)設(shè)計(jì)巢式 PCR 引物，根據(jù)擴(kuò)增后目的片段的有無(wú)判斷污染情況，并根據(jù)片段大小判斷支原體污染類型，進(jìn)而推斷污染源。由于類支原體16S～23S rDNA的種屬差異性，李菁竹[12]利用ISR序列對(duì)細(xì)胞污染中常見的5種支原體進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，通過(guò)考察檢測(cè)限、特異性及耐受性等參數(shù)發(fā)現(xiàn)此方法可以同時(shí)有效檢測(cè)多種支原體引起的污染，具有高靈敏性、高度特異性、簡(jiǎn)單快速、避免交叉污染等特點(diǎn)，使多個(gè)取樣點(diǎn)的在線檢測(cè)成為可能，可有效應(yīng)用于生產(chǎn)過(guò)程的控制，防止污染的蔓延，確保疫苗生產(chǎn)質(zhì)量。

2.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。1996年，美國(guó)Applied Biosystems公司首次推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[13]，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析。宋建領(lǐng)等[14]建立了豬肺炎支原體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)表明僅豬肺炎支原體檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，可檢測(cè)到101copies/μL DNA 模板，每份樣品的變異系數(shù)均小于5%，表明該方法精確、靈敏、重復(fù)性高。目前，該方法已被應(yīng)用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與繁殖、動(dòng)物遺傳育種及動(dòng)物疾病檢測(cè)和預(yù)防等領(lǐng)域，但由于無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)品、不能監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、熒光素種類和檢測(cè)光源的局限性及檢測(cè)成本高等因素的制約，因而限制了其廣泛應(yīng)用。

2.3.4DNA分子雜交檢查法。在原核生物中，rRNA是高度保守的。提取已知支原體的rRNA，克隆至質(zhì)粒PBR325中進(jìn)行擴(kuò)增，以缺刻轉(zhuǎn)移法制成P32標(biāo)記的探針。將待檢查的細(xì)胞消化懸浮后，低速離心，取其上清液，提取DNA后用EcoR I降解2 h，凝膠電泳，采用Southern blot法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以探針在膜上與之雜交。此膜X光底片重迭放置24～48 h即可根據(jù)探針存在的部位判定結(jié)果。此檢測(cè)方法特異性高，支原體探針與大多數(shù)原核細(xì)胞DNA可雜交，不會(huì)與真核細(xì)胞DNA雜交，可完成支原體種類的大致鑒別。

3預(yù)防與控制

自然界存在的支原體有120多種，但在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中有95%以上的支原體污染來(lái)自豬源的豬鼻支原體、牛源的精氨酸支原體和萊氏支原體、人源的口腔支原體和發(fā)酵支原體。在感染的組織細(xì)胞中，支原體的密度可高達(dá)107克隆單位/mL，可引起細(xì)胞形態(tài)和遺傳物質(zhì)的改變，干擾病毒復(fù)制，也可引起宿主細(xì)胞免疫能力的改變，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。因此，在以培養(yǎng)細(xì)胞為材料的獸用疫苗生產(chǎn)中，支原體的防治工作尤為重要。國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道可使用抗生素(如卡那霉素)阻斷支原體核糖核蛋白體循環(huán)過(guò)程[15]，但可能影響細(xì)胞的正常生理功能，甚至可能對(duì)細(xì)胞造成毒害作用，在使用中應(yīng)控制其劑量(50～100 U/mL)。在糾正支原體污染過(guò)程中，保持細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液為酸性環(huán)境(pH 6.6～6.8)，可以有效抑制支原體生長(zhǎng)。也有學(xué)者提出將有效的抗生素配合克隆，如使用泰霉素和麥諾霉素處理支原體污染的細(xì)胞后，可以有效緩解支原體污染狀況，且操作簡(jiǎn)單，毒副作用較小，但不能完全去除。目前，在獸用生物制品生產(chǎn)中，支原體種類的鑒定及檢測(cè)主要是為了檢測(cè)細(xì)胞的污染源，從而切斷污染源，以期進(jìn)行有效預(yù)防與控制。較常用的支原體檢測(cè)方法是直接培養(yǎng)法，但僅依靠此方法還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的需要，應(yīng)將ELISA法、常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、DNA分子雜交檢查法等方法與分離培養(yǎng)法結(jié)合使用，以適應(yīng)不同來(lái)源樣本的特殊檢測(cè)要求。4展望

支原體污染的診斷是獸用疫苗生產(chǎn)中保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)。今后，相關(guān)研究的發(fā)展方向有：①通過(guò)建立準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，有效減少下游產(chǎn)品的污染；②研制特異性及敏感性高的支原體檢測(cè)試劑盒，快速準(zhǔn)確檢測(cè)疫苗生產(chǎn)中細(xì)胞培養(yǎng)物支原體污染，對(duì)獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)成本控制有重要意義。

在防治方面，建立有效預(yù)防的支原體疫苗是今后支原體檢測(cè)工作的研究重點(diǎn)。雖然對(duì)家畜支原體疫苗的研發(fā)已取得了一定進(jìn)展，但由于受佐劑、免疫途徑及載體等因素的影響，免疫效果均較差，目前還未商品化，尚需進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)

[1] NIKFARJAM L，F(xiàn)ARZANEH P.Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture[J].Cell journal,2012，13(4)：203-212.

[2] 寧宜寶.國(guó)內(nèi)禽用活病毒疫苗中支原體污染的調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)獸藥雜志，1993，21(1)：34-36.

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典:2010年版[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[4] 唐書謙，伍津津,楊濤，等.細(xì)胞培養(yǎng)中污染支原體的檢查[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(23)：2403-2404.

[5] 黃海波.細(xì)胞培養(yǎng)感染支原體的檢測(cè)和清除研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志，1997,27(3)：57-60.

[6] 吳曉，鄭穎,趙志鋼，等，被動(dòng)凝集法檢測(cè)肺炎支原體抗體的實(shí)驗(yàn)室研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(12)：2886-2888.

[7] ENGAVALL E，PERLMANN P.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8：871-874.

[8] 崔玉明，蔡平生，郭善原，等.雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)肺炎支原體抗原方法的研究[J].中國(guó)人獸共患病雜志，2002，18(4)：120-121.

[9] 姚曉輝，練炳洲，王林川，等.支原體檢測(cè)方法的建立及在疫苗檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2010：23-26.

[10] 賈麗艷，李彥明，張映.獸用疫苗支原體污染的PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(6)：55-58.

[11] 魏欣球.三種血清學(xué)方法檢測(cè)肺炎支原體抗體的比較[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2010，23(3)：328-329.

[12] 李菁竹.支原體污染的巢式PCR檢測(cè)法的摸索及其初步驗(yàn)證[D].武漢：武漢生物制品所，2010:1-59.

[13] 周曉麗，朱國(guó)坡,李雪華，等.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)原理與應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010,37(2)：87-89.

[14] 宋建領(lǐng)，高華峰，信愛國(guó)，等.豬肺炎支原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].畜牧與獸醫(yī)，2013,45(5)：71-74.

[15] 何大澄，張鴻卿,薛紹白.支原體污染防治研究的新進(jìn)展[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，1986，8(1)：23-26.

Detection and Prevention of Mycoplasma in the Production of Veterinary Vaccines

WAN Yu-lin, GE Yu-feng, WU Fa-ju, LIU Xue-rong*et al

(China Agriculture Vet. Bio. Science and Technology Co. Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

Key wordsMycoplasma; Vaccine production; Pollution; Detection; Prevention

AbstractMycoplasma contamination in cell culture affects the quality and safety of veterinary biological products, and can cause huge economic losses. In this research, we reviewed the veterinary mycoplasma contamination detection method, related derivative technology and prevention used in vaccine production, aiming at providing the references for mycoplasma contamination detection during the production of a veterinary biological production.

基金項(xiàng)目蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-1-143)。

作者簡(jiǎn)介萬(wàn)玉林(1976- )，男，甘肅隴南人，助理研究員，碩士，從事口蹄疫疫苗生產(chǎn)與細(xì)胞培養(yǎng)工藝研發(fā)。*通訊作者，副研究員，碩士，從事國(guó)家重大動(dòng)物疫病預(yù)防用生物制品技術(shù)研發(fā)。

收稿日期2016-01-29

中圖分類號(hào)S 859.79

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-081-02