李曉娜，李君秀，付 輝，楊星星，李細(xì)清，汪鳳林，楊 中，朱 海，嚴(yán)義勇*

(1.深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳市通量檢測(cè)科技有限公司，廣東深圳 518000)

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牛奶中甲氧芐啶膠體金快速檢測(cè)裝置的研制

李曉娜1，2，李君秀1，付 輝1，楊星星1，李細(xì)清1，汪鳳林1，楊 中1，朱 海1，嚴(yán)義勇1*

(1.深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳市通量檢測(cè)科技有限公司，廣東深圳 518000)

摘要[目的]研究牛奶中甲氧芐啶的膠體金快速檢測(cè)裝置，快速篩查牛奶中甲氧芐啶添加物含量并評(píng)價(jià)牛奶品質(zhì)。[方法]制備抗原，免疫得到抗體并摸索膠體金免疫層析裝置的樣品檢測(cè)性能。[結(jié)果]試驗(yàn)所得裝置對(duì)牛奶中甲氧芐啶的肉眼可見檢測(cè)線為2 ng/L，假陽(yáng)性率為0%，假陰性率為0%；與常見3種混合添加物無(wú)交叉反應(yīng)，特異性高；不同批次間結(jié)果重復(fù)性高度一致；穩(wěn)定性好，易于保存，在37 ℃條件可存放35 d，50 ℃存放6 d對(duì)其質(zhì)量無(wú)影響；兼容性好，適合6種不同種類奶基質(zhì)；檢測(cè)時(shí)間短，僅需6 min。[結(jié)論]該研究的裝置檢測(cè)時(shí)間短，使用簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，產(chǎn)品穩(wěn)定性高，適用于牛奶中甲氧芐啶的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和檢測(cè)。

關(guān)鍵詞牛奶；甲氧芐啶；膠體金；快速檢測(cè)

甲氧芐啶是一種親脂弱堿性乙胺嘧啶類抑菌劑[1]，其抗菌譜和磺胺類藥物相似，但抗菌作用較磺胺類藥物強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎桿菌、腐生葡萄球菌、多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌有效，但對(duì)綠膿桿菌感染無(wú)效，最低抑菌濃度常低于10 mg/L。甲氧芐啶單用易引起細(xì)菌耐藥性，故一般不單獨(dú)使用，主要與磺胺類藥組成復(fù)方制劑，因此它又被稱為磺胺增效劑，用于擴(kuò)大抗菌譜，增強(qiáng)抗菌活性。臨床上用于治療尿路感染、腸道感染、呼吸道感染、菌痢、腸炎、傷寒、腦膜炎、中耳炎、流腦、敗血癥及軟組織感染等，可與長(zhǎng)效磺胺類藥合用于耐藥惡性瘧的防治。隨著磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上不合理的使用甚至濫用，抗菌增效劑類藥物在動(dòng)物源性食品中的殘留會(huì)不可避免地發(fā)生。人類長(zhǎng)期食用含有甲氧芐啶殘留的動(dòng)物源性食品及其制品，將有可能對(duì)健康產(chǎn)生危害。因此為了加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源性食品中此類藥物的監(jiān)控，建立一種準(zhǔn)確、快速、方便的甲氧芐啶殘留量檢測(cè)方法很有必要。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)甲氧芐啶的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MASS)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[2-4]。在食品安全檢測(cè)中，往往先用ELISA初篩后再對(duì)陽(yáng)性樣本用HPLC或LC-MASS進(jìn)行確證。上述方法中所用儀器設(shè)備復(fù)雜、成本高、對(duì)操作人員技術(shù)要求高且不能立即顯示結(jié)果，不適用于商檢、防疫、畜牧生產(chǎn)者對(duì)懷疑對(duì)象進(jìn)行快速地在線檢測(cè)和監(jiān)控，因此筆者研制出一種能快速檢測(cè)牛奶中甲氧芐啶的裝置。

1材料與方法

1.1材料檢測(cè)用牛奶樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?。氯金酸、檸檬酸鈉、甲醇等化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；卵清蛋白、牛血清蛋白購(gòu)自生工集團(tuán)；甲氧芐啶購(gòu)自sigma公司；硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊及反應(yīng)杯購(gòu)自上海必泰生物科技；所用純水為出自純化系統(tǒng)的電阻為18.2 mΩ的超純水。磁力加熱攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；數(shù)控切條機(jī)、點(diǎn)模儀，杭州格倫坤科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1抗原制備。在100 mL的三頸瓶中依次加入2.5 g甲氧芐啶，30 mL 48%氫溴酸，100 ℃反應(yīng)30 min，然后加入50%氫氧化鈉溶液6 mL淬滅。冷卻析出晶體后，將晶體溶解于20 mL沸水，隨后加入濃氨水調(diào)節(jié)pH至7，重結(jié)晶提純。

取上一步晶體0.5 g溶于10 mL DMF中，加入碳酸鉀0.5 g，及0.43 mL溴丙酸，40 ℃反應(yīng)6 h。乙酸乙酯萃取過柱提純得甲氧芐啶半抗原。

1.2.2免疫抗原制備。利用甲氧芐啶半抗原制備免疫抗原。取甲氧芐啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，攪拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清液為A液，稱取卵清蛋白(OVA)140 mg溶于10 mL濃度為0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應(yīng) 12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用生理鹽水透析3 d，每天更換3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的濃度分裝于0.5 mL離心管中，凍存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.3包被抗原的制備。利用甲氧芐啶半抗原制備包被抗原。取甲氧芐啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，攪拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力攪拌反應(yīng)過夜，離心后上清液為A液，稱取牛血清蛋白(BSA)140 mg溶于10 mL濃度為0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應(yīng) 12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用生理鹽水透析3 d，每天更換3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的濃度分裝于0.5 mL離心管中，凍存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.4膠體金的制備。取純水100 mL，加入1 mL 1% (m/V)的氯金酸溶液，攪拌均勻并加熱至沸騰，迅速加入2.4 mL 1%(m/V)檸檬酸鈉水溶液，攪拌均勻并繼續(xù)加熱至沸騰，至液體變?yōu)榫萍t色停止加熱。冷卻至室溫，并補(bǔ)充水至100 mL，得到膠體金溶液。

1.2.5甲氧芐啶單克隆抗體的制備。利用甲氧芐啶免疫抗原制備單克隆抗體。使用甲氧芐啶免疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強(qiáng)免疫3次后，采血測(cè)效價(jià)，待血清效價(jià)不再上升，用2倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，3 d后脫頸致死小鼠，在無(wú)菌條件下取脾臟制備脾細(xì)胞，與生長(zhǎng)旺盛的小鼠骨髓瘤細(xì)胞按8∶1的比例混合于50 mL離心管，加入30 mL無(wú)血清IPMI1640培養(yǎng)基，1 100 r/min離心5 min后棄上清，將細(xì)胞團(tuán)輕輕振松，置于37 ℃水浴中。將1 mL 50%PEG-4000緩緩加入細(xì)胞中，在1 min內(nèi)滴完，同時(shí)輕輕攪動(dòng)底部沉淀，靜置1 min后，前30 s沿管壁緩慢勻速加入無(wú)血清培養(yǎng)基 1 mL，后30 s加入2 mL，然后快速加入27 mL終止融合過程，1 100 r/min離心5 min，棄上清，用HAT選擇性培養(yǎng)基重懸后加到已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)。7 d后換成HT培養(yǎng)液，待孔內(nèi)的雜交細(xì)胞數(shù)量達(dá)到300個(gè)以上時(shí)，用間接ELISA法篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制效果好、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行有限稀釋克隆化，經(jīng)3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測(cè)，均呈陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)以備單克隆抗體的制備。

采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)抗甲氧芐啶單克隆抗體。選4只經(jīng)產(chǎn)昆明小鼠，腹腔注射液體石蠟油 0.5 mL/只，7 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞(3～5)×106/只，10 d后，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來(lái)純化腹水，經(jīng)紫外測(cè)定抗甲氧芐啶單克隆抗體的含量。

1.2.6膠體金標(biāo)記抗體。調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.0，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時(shí)逐滴加入甲氧芐啶的單克隆抗體，1 h后加入抗體量相當(dāng)?shù)腜EG，充分反應(yīng)30 min后加入抗體量相當(dāng)?shù)腂SA，加完后，繼續(xù)攪拌30 min。在9 000 r/min下離心30 min獲得均一性金標(biāo)抗體沉淀，再加PNPB重懸備用。

1.2.7膠體金快速檢測(cè)裝置的組裝。在底板上，沿同一方向依次將樣品墊、噴涂有甲氧芐啶-BSA(檢測(cè)線)和兔抗鼠IgG(質(zhì)控線)的硝酸纖維素膜及吸水紙依次搭接粘連；反應(yīng)杯內(nèi)加入膠體金標(biāo)記抗體，凍干。裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1.2.8檢測(cè)方法。取200 μL奶樣品于微孔中混勻，(40±2)℃溫育3 min，插入試紙條，(40±2)℃溫育3 min后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.2.9檢測(cè)裝置的性能測(cè)定。

1.2.9.1檢測(cè)限、假陽(yáng)性率、假陰性率。取陰性牛奶樣本，添加甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品至濃度分別為0、1、2、3、4、5、10、15 ng/L，每個(gè)濃度重復(fù)5次，樣品處理后用檢測(cè)裝置檢測(cè)，判定檢測(cè)限、假陽(yáng)性率及假陰性率。

1.2.9.2特異性。取陰性牛奶樣本，添加甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為2 ng/L，其他藥物添加為20 ng/L，每個(gè)濃度重復(fù)5次，樣品處理后用檢測(cè)裝置檢測(cè)，判定其特異性。

1.2.9.3重復(fù)性。分別取3個(gè)不同批次的牛奶樣品，使用檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)，判斷其重復(fù)性。

1.2.9.4兼容性。分別取不同性質(zhì)奶品，添加甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0及2 ng/L，使用檢測(cè)裝置進(jìn)行檢測(cè)，判斷其樣品適用性。

1.2.9.5穩(wěn)定性。將產(chǎn)品分別置于37及50 ℃環(huán)境，隔一定天數(shù)取出裝置進(jìn)行檢測(cè)，判斷其穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)限、假陽(yáng)性率及假陰性率檢測(cè)裝置濃度設(shè)置如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。當(dāng)添加甲基芐胺濃度為0～1ng/L時(shí)，檢測(cè)線(T)顏色較對(duì)照線(C)深，結(jié)果為陰性；當(dāng)添加量為2 ng/L時(shí)，T線顏色與C線相當(dāng)，結(jié)果為弱陽(yáng)性；當(dāng)添加量為3～15 ng/L時(shí)，T線顏色遠(yuǎn)弱于C線，此時(shí)為強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果。因此，該試紙條的檢測(cè)限為3 ng/L，假陽(yáng)性率及假陰性率均為0%。

注：“-”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，“+”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

2.2特異性與常見藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)率的測(cè)定，結(jié)果如表2。當(dāng)加入10倍量常見藥物時(shí)，對(duì)其檢測(cè)效果無(wú)明顯影響，因此該檢測(cè)裝置對(duì)甲氧芐啶具有較高的特異性。

2.3重復(fù)性分別購(gòu)買3批牛奶樣品，每批次取10個(gè)樣品，分別為陰性樣本及2 ng/L添加，進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)。結(jié)果如表3所示，在不同批次的牛奶樣品中，檢測(cè)結(jié)果一致。因此，該檢測(cè)裝置具有較好的重復(fù)性。

2.4兼容性由表4可見，檢測(cè)裝置對(duì)不同的奶品均表現(xiàn)出優(yōu)良的檢測(cè)性能，具有優(yōu)良的兼容性。

2.5穩(wěn)定性檢測(cè)裝置分別置于37及50 ℃條件下，對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行跟蹤。在不同時(shí)間抽取裝置對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每次檢驗(yàn)陰性及陽(yáng)性樣品各5個(gè)。由表5可見，該裝置檢測(cè)穩(wěn)定性高，在37 ℃條件下可存放35 d，在50 ℃條件下存放6 d對(duì)其質(zhì)量無(wú)影響。

注：“-”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，“+”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

表3不同批次奶樣品甲氧芐啶重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

Table 3Repeatable detection results of trimethoprim in different batches of milk

注：“-”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，“+”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

表4不同奶樣品甲氧芐啶重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

Table 4Repeatable detection results of trimethoprim in different milk samples

注：“-”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，“+”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

注：“-”表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，“+”表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

Note：“-” indicated negative detection results；“+” indicated positive detection results.

3結(jié)論與討論

該研究基于膠體金免疫層析原理開發(fā)了一種快速檢測(cè)牛奶中甲氧芐啶的檢測(cè)裝置。該裝置對(duì)牛奶中甲氧芐啶的

檢測(cè)限達(dá)到2 ng/L，檢測(cè)時(shí)間僅需6 min，而且對(duì)甲氧芐啶的特異性較高，添加10倍量的磺胺嘧啶、氯霉素及四環(huán)素藥物對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。此外，該裝置重復(fù)性好，穩(wěn)定性高，易于保存，在37 ℃條件可存放35 d，50 ℃存放6 d對(duì)其質(zhì)量無(wú)影響。

隨著生活水平的提高，人們對(duì)食品安全的要求也越來(lái)越高，甲氧芐啶作為一種抗菌增效劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用，其殘留對(duì)人類健康可能造成危害，因此對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義。該試驗(yàn)研發(fā)的甲氧芐啶快速檢測(cè)裝置，較傳統(tǒng)的質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法具有成本、操作難度、時(shí)間及便捷性上的極大優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用于牛奶甲氧芐啶的現(xiàn)場(chǎng)篩查和檢測(cè)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

參考文獻(xiàn)

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[2] 邵耀東，胡彬，趙小華，等.高效液相色譜法測(cè)定甲氧芐啶含量[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33(5)：81-84.

[3] 英瑜，李健.水產(chǎn)品中磺胺二甲嘧啶間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法的建立[J].海洋水產(chǎn)研究，2005，26(4)：46-52.

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Development of a Rapid Detection System for Trimethoprim in Milk

LI Xiao-na1,2, LI Jun-xiu1, FU Hui1, YAN Yi-yong1*

(1. Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, Guangdong 518000; 2. Shenzhen Total-Test Technology Co., Ltd., Shenzhen, Guangdong 518000)

Key wordsMilk; Trimethoprim; Colloid gold; Rapid detection

Abstract[Objective] To research a rapid detection system for trimethoprim in milk, and to provide methods for the rapid screening of milk quality and the trimethoprim content in milk. [Method] Antigen was prepared. Antibody was obtained through immunity. Sample detection performance of colloidal gold immunochromatography system was found out. [Result] This system had a detection limit as low as 2 ng/L，and the false positive rate and false negative rate were both 0%. There was no cross reaction with common three mixed additives with high specificity. Result of repeatability in different batches was highly consistent. This system had high stability and was easy to preserve. The quality was not affected when milk was stored at 37 ℃ for 35 d or 50 ℃ for 6 d. [Conclusion] This system has short detection time, is simple, repeatable and stable, and is suitable for the rapid screening and detection of trimethoprim in milk.

基金項(xiàng)目深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)深圳市生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(GCZX20140509163151273)；廣東省科學(xué)技術(shù)廳促進(jìn)科技服務(wù)業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013B040402001)。

作者簡(jiǎn)介李曉娜(1988- )，女，廣東揭陽(yáng)人，從事食品檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事化學(xué)生物學(xué)研究。

收稿日期2015-12-16

中圖分類號(hào)S 851.34+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-063-03