曹艷花，亞森·克力木，姚 粟，劉 洋，翟 磊，趙 婷，程 池*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司，新疆烏魯木齊 830000)

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特色飲料“生命營養(yǎng)液”內(nèi)源菌株CICC 10822的鑒定及生物學(xué)特性

曹艷花1，亞森·克力木2，姚 粟1，劉 洋1，翟 磊1，趙 婷1，程 池1*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司，新疆烏魯木齊 830000)

摘要[目的]鑒定特色飲料“生命營養(yǎng)液”內(nèi)源菌株CICC 10822并了解其生物學(xué)特性。[方法]采用傳統(tǒng)微生物學(xué)分離培養(yǎng)方法對30 ℃條件下分離得到的新疆埃杜升“生命營養(yǎng)液”細(xì)菌CICC 10822進行多相分類鑒定。[結(jié)果]菌株CICC 10822接觸酶反應(yīng)陰性，硝酸鹽還原陰性，淀粉水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性；能利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，不能利用麥芽糖、木糖、甘油、乳糖、甘露糖、山梨醇、纖維二糖、鼠李糖、阿拉伯糖，不液化明膠。利用基于形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析及16S rDNA和pheS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析的微生物多相分類鑒定技術(shù)，將菌株CICC 10822鑒定為酸魚乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)。[結(jié)論]試驗結(jié)果為今后開展針對該菌的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞生命營養(yǎng)液；CICC 10822；鑒定；酸魚乳桿菌；生物學(xué)特性

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)食品除其經(jīng)典的營養(yǎng)作用外，還被發(fā)現(xiàn)有保健功能。新疆埃杜升“生命營養(yǎng)液”是以核桃、巴旦木、杏仁、黃豆、綠豆、大米以及干、鮮果類和蔬菜類等50多種天然食品為原料，經(jīng)獨特的方法多次發(fā)酵制備而成的特色功能性飲料，已申請獲得發(fā)明專利[1]。在新疆地區(qū)維吾爾族常飲用“生命營養(yǎng)液”用于營養(yǎng)保健，其富含蛋白質(zhì)、粗脂肪、維生素、礦物質(zhì)、纖維素和功能因子，能夠有效提供充足營養(yǎng)、提高人體免疫力，對多種炎癥的控制和輔助治療具有積極的效果[2]。

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院已對新疆埃杜升“生命營養(yǎng)液”這種特色發(fā)酵制品初步進行了微生物的研究，發(fā)現(xiàn)其對常見食源性致病菌均有抑菌能力，對常見益生菌無抑菌能力。例如，“生命營養(yǎng)液”對沙門氏菌腸亞種(Salmonellaentericasubsp.enterica)、出血性大腸埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC O 157∶H7)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等多種致病菌具有抑菌活性[3]；“生命營養(yǎng)液”具有體外抗HIV-1活性[4]。基于此，筆者以自“生命營養(yǎng)液”中分離篩選得到的細(xì)菌菌株CICC 10822為研究對象，對其進行多相分類鑒定及相關(guān)酶活性、碳源利用等生物學(xué)特性研究，以期為進一步研究其生物功能與“生命營養(yǎng)液”功效性成分之間的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。供試菌株為中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院自新疆埃杜升“生命營養(yǎng)液”中分離獲得，樣品由新疆埃杜升生物開發(fā)有限公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基。MRS培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3主要試劑。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶及DNA Marker等購自天根生化科技有限公司；生理生化鑒定管購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1菌株分離、純化與保藏。采用稀釋平板涂布法[3]對“生命營養(yǎng)液”中細(xì)菌進行分離篩選。梯度稀釋以制備1×10-6～1×10-2的系列稀釋液，涂布MRS平板，并置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待單菌落出現(xiàn)后，采用劃線法轉(zhuǎn)接至MRS斜面培養(yǎng)后置于4 ℃保藏。同時將分離的菌株保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2.2形態(tài)學(xué)觀察。將菌株CICC 10822接種于MRS固體培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察其特征，并利用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征[3]。

1.2.3生理生化特征鑒定。采用生理生化鑒定管對菌株CICC 10822的酶活性、碳源利用等生理生化特征進行檢測，具體操作方法按生理生化鑒定管說明書進行。

1.2.416S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析。 采用Tiangen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取CICC 10822菌株基因組DNA，具體方法參見說明書。 采用27F和1492R為引物擴增細(xì)菌CICC 10822的16S rDNA[5-7]。測定序列通過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行比對及近緣種序列相似度計算[8]，并將測定序列提交至GenBank。利用ClustalX 1.83按照最大同源性的原則對測定序列及其模式菌株序列進行比對，并用MEGA 5.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]，自展值設(shè)為1 000分析評估進化樹的穩(wěn)定性，對菌株CICC 10822進行系統(tǒng)發(fā)育分析[7，10]。

1.2.5持家基因序列分析。以菌株CICC 10822基因組DNA為模板，采用苯丙氨酰tRNA合成酶α亞基基因(pheS)特異性引物進行擴增，正向引物(pheS-21F)為5′-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3′，反向引物(pheS-22R)為5′-CCWARVCCRAARGCAAARCC-3′[5]。PCR擴增并測序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]，自展值設(shè)為1 000分析評估進化樹的穩(wěn)定性，進行系統(tǒng)發(fā)育分析[7，10]。

2結(jié)果與分析

2.1菌株CICC 10822的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察經(jīng)過分離純化獲得的菌株命名為B4，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌株保藏編號為CICC 10822。CICC 10822在MRS培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h，菌落為圓形，不透明，乳白色，濕潤，邊緣整齊(圖1a)；光學(xué)顯微鏡觀察顯示菌體大小為0.4×(1.2～4.0) μm，呈桿狀，單個排列或者成對排列，革蘭氏陽性(圖1b)。

2.2菌株CICC 10822生理生化特征分析經(jīng)生理生化鑒定管對菌株CICC 10822的酶活性、碳源利用等生理生化特征進行檢測，結(jié)果表明CICC 10822接觸酶反應(yīng)陰性，硝酸鹽還原陰性，淀粉水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性。能利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，不能利用麥芽糖、木糖、甘油、乳糖、甘露糖、山梨醇、纖維二糖、鼠李糖、阿拉伯糖，不液化明膠(表1)。

2.316S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析菌株CICC 10822的16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物大小約為1 500 bp，在GenBank上的登錄號為KM259929。將該序列通過EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行比對，比對結(jié)果顯示同CICC 10822的16S rDNA序列相似性高于97%的序列只有2個，都是乳桿菌屬的模式菌株序列，其中菌株CICC 10822同酸魚乳桿菌(Lactobacillusacidipiscis)模式株的16S rDNA序列相似性最高為99.73%，同Lactobacilluspobuzihii模式株的16S rDNA序列相似性為98.32%。以同科不同屬的片球菌屬的PediococcusdamnosusJCM 5886T序列為外群，構(gòu)建CICC 10822與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。通過16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將菌株CICC 10822鑒定為乳桿菌屬(Lactobacillussp.)。

2.4持家基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析菌株CICC 10822的pheS基因PCR擴增產(chǎn)物大小約為500 bp，在GenBank上登錄號為KM259930。通過Blast軟件進行比對，結(jié)果顯示CICC 10822菌株pheS基因序列與酸魚乳桿菌(Lactobacillusacidipisci)模式菌株序列相似性最高為98.00%，而同乳桿菌屬其余菌株pheS基因序列相似性均低于96.00%。以同科不同屬的片球菌屬的PediococcusdamnosusLMG 11484T序列為外群，構(gòu)建CICC 10822與相關(guān)近緣模式菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。pheS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株CICC 10822被鑒定為酸魚乳桿菌(Lactobacillusacidipisci)。

表1菌株CICC 10822的生理生化特征

Table 1The physiological and biochemical characteristics of strain CICC 10822

注：“+”.陽性；“-”.陰性。

Note：“+”.Positive；“-”.Negative.

2.5菌株CICC 10822多相分類鑒定結(jié)果通過形態(tài)學(xué)觀察并進行16S rDNA和pheS持家基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)

合微生物代謝類型差異，檢測微生物對各種基質(zhì)代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒定評價待檢微生物的分類學(xué)地位。結(jié)合菌體形態(tài)及菌落形態(tài)特征觀察、生理生化特征分析及16S rDNA和pheS持家基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，“生命營養(yǎng)液”菌株CICC 10822被鑒定為酸魚乳桿菌(Lactobacillusacidipisci)。

3結(jié)論與討論

該研究對菌株CICC 10822的菌體形態(tài)及菌落形態(tài)特征進行觀察，經(jīng)生理生化鑒定管對菌株CICC 10822的酶活性、碳源利用等生物學(xué)特征進行檢測，結(jié)果表明CICC 10822接觸酶反應(yīng)陰性，硝酸鹽還原陰性，淀粉水解陰性，精氨酸雙水解酶陰性。能利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，不能利用麥芽糖、木糖、甘油、乳糖、甘露糖、山梨醇、纖維二糖、鼠李糖、阿拉伯糖，不液化明膠，其生理生化結(jié)果符合乳桿菌屬(Lactobacillussp.)的特征[11-13]。通過16S rDNA的PCR擴增與測序，采用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行序列比對并利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，菌株CICC 10822被鑒定為乳桿菌屬。進一步通過pheS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，序列比對結(jié)果顯示CICC 10822同酸魚乳桿菌模式菌株的親緣關(guān)系最近為98.00%，與乳桿菌屬其余菌株相似性均低于96.00%。綜上，結(jié)合菌體形態(tài)、菌落形態(tài)特征觀察及生理生化特征分析，通過16S rDNA和pheS持家基因系統(tǒng)發(fā)育分析，確定新疆埃杜升“生命營養(yǎng)液”菌株CICC 10822為酸魚乳桿菌。

酸魚乳桿菌由Tanasupawat 等[14]于2000年從發(fā)酵的魚中分離獲得。酸魚乳桿菌的分類地位屬于細(xì)菌界厚壁菌門乳桿菌科乳桿菌屬的菌種。塞浦路斯干奶酪乳桿菌(Lactobacilluscypricasei)由Lawson等[15]于2001年從芝士奶酪中分離獲得，后經(jīng)Naser等[16]于2006年研究報道證實Lawson等于2001年發(fā)表的塞浦路斯干奶酪乳桿菌是酸魚乳桿菌的同物異名。該研究中自新疆埃杜升“生命營養(yǎng)液”中發(fā)現(xiàn)并分離得到CICC 10822為酸魚乳桿菌尚屬國內(nèi)首次。研究發(fā)現(xiàn)CICC 10822能夠利用葡萄糖、果糖、核糖和半乳糖，CICC 10822在“生命營養(yǎng)液”發(fā)酵過程中的作用和功能以及“生命營養(yǎng)液”功效性成分物質(zhì)產(chǎn)生方面是否發(fā)揮一定的作用，還有待于進一步的發(fā)酵試驗和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用研究。該研究利用微生物多相分類鑒定技術(shù)對菌株CICC 10822的分類地位進行全面準(zhǔn)確的鑒定，為今后開展其生物學(xué)功能的相關(guān)研究、充分利用該菌的生物活性和代謝產(chǎn)物、實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)利用價值奠定了微生物資源基礎(chǔ)。

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Identification and Biological Characteristics of Bacterial Strain CICC 10822 Isolated from Aldos Life Nutrition Liquid

CAO Yan-hua1, Yasin kirim2, YAO Su1, CHENG Chi1*et al

(1. China Industrial Microbial Strains Preservation and Management Center, China Food Fermentation Industry Research Institute, Beijing 100015; 2. Xinjiang ALDOS Biological Development Co. Ltd., Urumqi, Xinjiang 830000)

Key wordsLife nutrition liquid; CICC 10822; Identification;Lactobacillusacidipiscis; Biological characteristics

Abstract[Objective] The aim was to identify bacterial strain CICC 10822 isolated from Aldos life nutrition liquid and under the biological characteristics. [Method] By using the traditional microbiology separation and culture method, bacterial strain CICC 10822 isolated from Xinjiang Aldos life nutrition liquid in 30 ℃ was classified and identified. [Result] Strain CICC 10822 contact enzyme reaction was negative, nitrate reduction was negative, starch hydrolysis was negative, and arginine was negative. It could utilize glucose, fructose, ribose and galactose, and could not use maltose, xylose, lactose, glycerol, mannitol, sorbitol, cellobiose, rhamnose, arabinose, liquefied gelatin. By using microbial taxonomy and identification technology based on morphological observation, physiological and biochemical characteristics analysis, phylogenetic analysis of 16S rDNA andpheSgene sequences, strain CICC 10822 was identified asLactobacillusacidipiscis. [Conclusion] The results lay a foundation for study on the bacterial biological functions in the future.

基金項目國家微生物資源平臺專項(NIMR2016-4)；中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院科技發(fā)展基金(博士基金)項目(2012KJFZ-BS-01)。

作者簡介曹艷花(1985- )，女，黑龍江訥河人，工程師，碩士，從事微生物分類鑒定研究。*通訊作者，教授級高級工程師，從事微生物學(xué)研究。

收稿日期2016-02-19

中圖分類號TS 275.4

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-107-04