汪洋 高潔 喬海靈(鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床藥理研究所 河南鄭州 450052)

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牛血清白蛋白對(duì)人肝微粒體UGT2B7代謝齊多夫定的影響

汪洋 高潔 喬海靈
(鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床藥理研究所 河南鄭州 450052)

【摘要】目的 研究牛血清白蛋白對(duì)人肝微粒體尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine-5'-diphosphate glucuronosyl-transferase,UGT)2B7代謝活性的影響?方法 采用差速離心法制備人肝微粒體,以齊多夫定(3'-疊氮-3'-脫氧胸苷)為探針,考察人肝微粒體孵育體系中UGT2B7代謝活性,采用反相高效液相色譜法測(cè)定齊多夫定及其代謝物濃度?孵育體系分為兩組,分別為對(duì)照組和牛血清白蛋白組(含2%的牛血清白蛋白)?結(jié)果 在兩種人肝微粒體反應(yīng)體系中,UGT2B7代謝齊多夫定的動(dòng)力學(xué)行為均符合米曼式方程?對(duì)照組和牛血清白蛋白組齊多夫定的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下:Vmax分別為(1 359.0±135.8)和(1 268.4±300.1)pmol/(min·mg protein),Km分別為(368.0±64.3)和(111.4±6.9)μM,CLint分別為(3.7±0.4)和(11.4±2.7)μl/(min·mg protein)?與對(duì)照組相比,牛血清白蛋白組的Km顯著降低(P＜0.05),CLint明顯升高(P＜0.05)?結(jié)論 牛血清白蛋白可顯著影響人肝微粒體反應(yīng)體系UGT2B7催化活性,使UGT2B7代謝齊多夫定的Km降低?CLint升高?

【關(guān)鍵詞】牛血清白蛋白;人肝微粒體;尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B7;齊多夫定

人尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGTs)是催化內(nèi)源性和外源性物質(zhì)葡萄糖醛酸化的膜結(jié)合酶?葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是一種普遍的Ⅱ相代謝反應(yīng),在此反應(yīng)中UGTs催化尿苷-5'-二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)與親脂性底物結(jié)合,化合物的親水性增加,促進(jìn)其排泄,是機(jī)體重要的解毒途徑之一?人類迄今發(fā)現(xiàn)至少19種具有功能的UGTs,根據(jù)核苷酸序列的相似性分為4個(gè)家族:UGT1?UGT2?UGT3和UGT8[1],其中UGT1?UGT2在化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化時(shí)起主要作用?UGT2B7系UGT2B家族重要成員,在肝臟中含量較為豐富?UGT2B7不僅催化內(nèi)源性化合物如雄甾酮?雌三醇?膽酸?類維生素A,也參與催化許多臨床藥物如非甾體抗炎藥?麥考酚酸?齊多夫定?可待因?貝特類等,同時(shí)也是唯一催化嗎啡類的Ⅱ相代謝酶[2]?

體外代謝實(shí)驗(yàn)可有效排除體內(nèi)諸多因素的干擾,有利于直接觀察肝藥酶對(duì)底物的選擇性代謝,為進(jìn)一步的整體實(shí)驗(yàn)提供可靠的理論依據(jù)?人肝微粒體?人肝細(xì)胞?重組肝藥酶等體外系統(tǒng)已成功用于體內(nèi)肝臟藥物代謝研究的預(yù)測(cè)?目前,利用在人肝微粒體體系獲得的酶動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果如酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如Km和Vmax)及抑制常數(shù)(Ki)等,預(yù)測(cè)體內(nèi)的葡萄糖苷酸化程度也是比較常用的體外預(yù)測(cè)體內(nèi)的方法之一?但Lit-tle等[3]研究發(fā)現(xiàn)人肝微粒體中富含的亞麻酸和花生四烯酸等長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸是UGT2B7的底物,在UGT2B7代謝其他底物時(shí),脂肪酸可競(jìng)爭(zhēng)性抑制UGT2B7的活性,導(dǎo)致體外預(yù)測(cè)的UGT2B7活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其體內(nèi)的實(shí)際活性?Rowland等[4]研究發(fā)現(xiàn)人肝微粒體反應(yīng)體系中加入牛血清白蛋白,可減小脂肪酸的抑制作用,致UGT2B7 Km降低,CLint顯著增加,從而提高體外實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性?經(jīng)過一系列研究,Row-land提出“牛血清白蛋白效應(yīng)"理論,即牛血清白蛋白可消除人肝微粒體反應(yīng)體系中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸對(duì)UGTs的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,提高預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物清除率的準(zhǔn)確性?目前國(guó)內(nèi)尚無關(guān)于牛血清白蛋白對(duì)人肝微粒體中UGT2B7活性影響的報(bào)道?

齊多夫定口服吸收良好,主要經(jīng)肝臟中UGT2B7催化失活,生成齊多夫定葡萄糖苷酸?齊多夫定是體內(nèi)?體外研究UGT2B7活性公認(rèn)的探針,可通過研究其在人肝微粒體孵育系統(tǒng)的固有清除率來推測(cè)人體內(nèi)的清除率?本研究國(guó)內(nèi)首次考察了牛血清白蛋白對(duì)正常人肝微粒體UGT2B7代謝齊多夫定的影響,以期為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物代謝提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物和試劑 牛血清白蛋白(BSA,Sigma公司,批號(hào)1001116884,CAS 9048-46-8,純度≥98%);尿苷二磷酸-α-D-葡萄糖醛酸(UDP-GA,三鈉鹽,Sigma公司,批號(hào)1001595481,CAS63700-19-6,純度98%～100%);丙甲菌素(批號(hào)063M4008V,CAS27061-78-5,純度≥98%);齊多夫定(3'-疊氮-3'-脫氧胸苷,廈門邁克制藥有限公司,批號(hào)031102,純度>99%);齊多夫定-β-D-葡萄糖苷酸(Toronto Research Chemicals Inc,批號(hào)A825050);磷酸二氫鉀(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司,分析純,純度≥99.5%);磷酸氫二鉀(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,分析純,純度≥99.0%);氯化鎂(北京北伐精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司);高氯酸(天津市鑫源化工廠,純度70.0%～72.0%);EDTA(湖南湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所);甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司,批號(hào)433722-05126,色譜純,純度≥99.9%);乙腈(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司,批號(hào)432079-06517,色譜純,純度≥99.9%);異丙醇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,分析純,純度≥99.7%);蔗糖(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,分析純);無水乙醇(天津市登科化學(xué)試劑有限公司,分析純,純度≥99.7%);磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純,純度≥85.0%);鹽酸(洛陽市化學(xué)試劑廠,分析純,純度36.0%～38.0%)?實(shí)驗(yàn)用水均為超純水?

1.2 儀器 美國(guó)安捷倫HP1100高效液相色譜分析系統(tǒng),二極管陣列檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器,美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn);6L-88B型旋渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;HH.W21.420型電子恒溫水箱,北京市光明醫(yī)療儀器廠;賀利氏低溫高速離心機(jī)(Kendro La-boratory Products);Milpore超純水系統(tǒng)?

1.3 治療方法

1.3.1 人肝微粒體的制備與蛋白濃度的測(cè)定 收集肝血管瘤患者肝標(biāo)本6例,年齡30～67歲,男性4例,女性2例,吸煙史?飲酒史患者均為2例,近期均未使用影響UGT酶活性的藥物,肝功能均正常?本試驗(yàn)方案經(jīng)鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者簽署知情同意書?肝臟標(biāo)本收集后立即用預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液洗滌,濾紙將水分吸干,分裝至凍存管中,液氮保存?

采用差速離心法制備HLMs?所用試劑和器材均于4℃預(yù)冷?液氮保存的肝臟于冰上解凍,稱重,加入相當(dāng)于3倍肝臟重量的重懸液1(含0.15 M KCl,0.002 M EDTA),制備肝勻漿?將肝勻漿置于離心管中,9 000 g離心20 min(4℃),取上清液?將上清液100 000 g離心60 min(4℃)?棄上清,加入Tris-HCl緩沖液(0.15 M,pH7.6)洗滌1次,100 000 g離心60 min(4℃)?所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(含0.21 mol/L蔗糖,pH7.4)重懸,分裝,-80℃保存待用?Bradford法測(cè)定微粒體蛋白濃度?

1.3.2 齊多夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取0.267 2 g齊多夫定標(biāo)準(zhǔn)品于10 ml容量瓶中,用甲醇溶解,定容,得100 mM的齊多夫定標(biāo)準(zhǔn)液?準(zhǔn)確吸取5 ml該標(biāo)準(zhǔn)液至10 ml容量瓶中,用甲醇定容,得50 mM標(biāo)準(zhǔn)液?分別依次用甲醇倍比稀釋成濃度為25 000?12 500?6 250?3 125?1 560?780?390和195μM的齊多夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液?

1.3.3 孵育反應(yīng) 兩種孵育體系總體積均為100μl?對(duì)照組:PBS(50μM,pH=7.4,0%牛血清白蛋白),微粒體蛋白(0.2 mg/ml),丙甲菌素(50μg/mg蛋白),蔗糖(0.25 M)?牛血清白蛋白組:PBS(50μM,pH=7.4,2%牛血清白蛋白),其余組分相同?事先加入系列濃度的齊多夫定標(biāo)準(zhǔn)液于氮?dú)?室溫)下吹干?在37℃預(yù)孵育5 min,加入U(xiǎn)DPGA(5 mM)啟動(dòng)反應(yīng),孵育時(shí)間為60 min?

1.3.4 樣品處理及色譜條件 樣品處理孵育60 min后,冰浴加入高氯酸10μl終止反應(yīng),渦旋混勻30 s,離心10 min(12 000 rpm),取上清75μl,15μl進(jìn)樣?色譜條件色譜柱:Diamonsil C18柱(5μm,250 mm× 4.6 mm,5μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相為乙腈:磷酸鉀緩沖液(20 mM,pH=2.2)=12∶88(v/v);流速:1.0 ml/min,二極管陣列檢測(cè)器,波長(zhǎng)266 nm;進(jìn)樣量15μl?

1.3.5 人肝微粒體中齊多夫定葡萄糖苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取10 mg齊多夫定葡萄糖苷酸(95%),溶于1 ml超純水中,得20 844.5μM的儲(chǔ)備液?依次倍比稀釋,得一系列濃度的齊多夫定葡萄糖苷酸標(biāo)準(zhǔn)液:10 422.3?5 211.2?2 605.6?1 302.8?651.4?325.7? 162.8?81.4?40.7?20.4和10.2μM?

分別于孵育體系中加入系列濃度的齊多夫定葡萄糖苷酸對(duì)照品10μl(不加UDPGA),使其濃度分別為1.02?2.04?4.07?8.14?16.28?32.57?65.14和130.28μM,按照“1.3.4樣品處理及色譜條件"項(xiàng)下步驟操作?記錄樣品峰面積(A),樣品峰面積對(duì)齊多夫定葡萄糖苷酸濃度(C)作回歸曲線?

1.3.6 酶活性的測(cè)定 以探針?biāo)幬锏霓D(zhuǎn)化程度(Turnover)作為酶活性指標(biāo),具體表示為TR [pmol/(min·mg)]=(△C×1000)/(B×T),其中△C為代謝產(chǎn)物齊多夫定葡糖苷酸濃度(μM),B為微粒體蛋白的濃度(mg/ml),T為孵育時(shí)間(min)?

1.3.7 人肝微粒體孵育條件的優(yōu)化 最適孵育時(shí)間的確定:體系加入U(xiǎn)DPGA啟動(dòng)反應(yīng),分別于37℃孵育20?40?60?80?100和120 min,考察孵育時(shí)間對(duì)齊多夫定代謝的影響?最適蛋白濃度的確定:于反應(yīng)體系中加入不同蛋白濃度0.1?0.2?0.3?0.4?0.6和0.8 mg/m l,考察微粒體蛋白濃度對(duì)齊多夫定代謝的影響?

1.3.8 人肝微粒體齊多夫定酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定反應(yīng)體系中底物齊多夫定的濃度分別為19.5?39.0?78.0?156.0?312.5?625.0和1 250.0μM,以代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化程度(TR)為反應(yīng)速度?

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Prism 5.0進(jìn)行齊多夫定葡萄糖苷酸的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km?Vmax和CLint的計(jì)算?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均由SPSS 17.0軟件包完成?對(duì)照組與牛血清白蛋白組UGT2B7代謝的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性 在本實(shí)驗(yàn)條件下,齊多夫定葡萄糖苷酸有較大的色譜峰,肝微粒體中的雜質(zhì)?齊多夫定的色譜峰不干擾樣品峰,在該色譜條件下,齊多夫定葡萄糖苷酸?齊多夫定的保留時(shí)間分別為8.2?20.2 min左右(見圖1),說明該方法的專屬性較高?

圖1 人肝微粒體中齊多夫定及其代謝物的高效液相色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以齊多夫定葡萄糖苷酸樣品峰面積對(duì)濃度作回歸曲線,得方程為C=0.120 9A+0.080 7(r=1),表明齊多夫定葡萄糖苷酸在10.2～130.28μM范圍內(nèi)線性良好?該方法的靈敏度為10.2μM?

2.1.3 精密度和相對(duì)回收率 該方法的批間?批內(nèi)RSD分別為1.10%～3.66%和1.07%～3.84%,均小于5%;齊多夫定葡萄糖苷酸的相對(duì)回收率為100.05%～103.15%(表1)?結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)方法的精密度和相對(duì)回收率均符合生物樣品分析要求?

2.1.4 人肝微粒體孵育時(shí)間和蛋白濃度的選擇 考察齊多夫定葡萄糖苷酸生成量與孵育時(shí)間關(guān)系的結(jié)果顯示,孵育時(shí)間為60 min時(shí),齊多夫定葡萄糖苷酸生成量較大,因此選擇孵育時(shí)間為60min(圖2-A)?考察齊多夫定葡萄糖苷酸的生成量與蛋白濃度關(guān)系的結(jié)果表明,蛋白濃度在0.1～0.8 mg/ml范圍內(nèi)齊多夫定葡萄糖苷酸生成的量與蛋白濃度基本呈線性?綜合實(shí)驗(yàn)條件,在保證檢測(cè)靈敏度的情況下,本實(shí)驗(yàn)選擇微粒體蛋白濃度為0.2 mg/ml(圖2-B)?

表1 精密度和相對(duì)回收率(n=5)

圖2 人肝微粒體孵育時(shí)間(A)和蛋白濃度(B)對(duì)齊多夫定代謝的影響

2.2 牛血清白蛋白對(duì)UGT2B7代謝活性的影響 人肝微粒體反應(yīng)體系中齊多夫定葡萄糖苷酸的酶動(dòng)力學(xué)符合米曼氏方程,對(duì)照組和牛血清白蛋白組的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2?與對(duì)照組相比,牛血清白蛋白組UGT2B7代謝齊多夫定的Km顯著性降低(P＜0.05),CLint顯著性升高(P＜0.05)?結(jié)果表明,牛血清白蛋白顯著影響人肝微粒體中UGT2B7的催化活性?

表2 人肝微粒體中齊多夫定葡萄糖苷酸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

3 討論

藥物在人體內(nèi)肝臟代謝清除率的體外預(yù)測(cè)已經(jīng)日趨成熟,可通過體外研究數(shù)據(jù)估算藥物體內(nèi)的代謝清除率?目前,人源性肝細(xì)胞和肝微粒體的可獲得性,人肝細(xì)胞由新鮮制備到冷凍保存,使人體內(nèi)藥物肝臟代謝清除率體外預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性得到很大改善?但藥物代謝清除率的預(yù)測(cè)還存在一些問題?Lwatsubo等[5]對(duì)25種不同化合物的體內(nèi)外清除率進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)50%的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相比誤差在3倍范圍之內(nèi),而70%的結(jié)果在5倍誤差范圍之內(nèi)?

Uchaipichat等[6]體外研究發(fā)現(xiàn),藥物葡萄糖苷酸化過程獲得的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如Km和Vmax)及抑制常數(shù)(Ki)也常常低估體內(nèi)的葡萄糖苷酸化程度?肝微粒體中的亞麻酸?亞油酸和花生四烯酸等長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸可被UGT2B7催化代謝生成其葡萄糖苷酸化產(chǎn)物?當(dāng)UGT2B7催化代謝其他化合物時(shí),長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制UGT2B7的活性?Nenad等[7]采用UGT2B7重組酶和混合人肝微粒體研究發(fā)現(xiàn),牛血清白蛋白可影響UGT2B7的催化活性?Miners等[8-9]報(bào)道體外反應(yīng)體系中的牛血清白蛋白可使UGT2B7的活性明顯增強(qiáng),加入牛血清白蛋白,Km約降低了一個(gè)數(shù)量級(jí),顯著提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性?因此研究經(jīng)UGT2B7代謝的藥物時(shí),人肝微粒體中加入牛血清白蛋白可消除長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸對(duì)UGT2B7的抑制作用,提高體外代謝實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物清除率的準(zhǔn)確性?

Michael等[10]研究證實(shí),齊多夫定比嗎啡?可待因更適合作為UGT2B7的特異性探針?齊多夫定是一種有效的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,可有效抑制病毒復(fù)制,降低艾滋病的傳染性,重建患者的免疫功能,其在體內(nèi)經(jīng)UGT2B7催化生成齊多夫定葡萄糖苷酸?本研究以齊多夫定為探針,在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了牛血清白蛋白對(duì)人肝微粒體中UGT2B7代謝活性的影響?研究發(fā)現(xiàn)微粒體反應(yīng)體系中加入2%的牛血清白蛋白后,UGT2B7代謝齊多夫定的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生改變,Km明顯降低(P＜0.05),CLint顯著升高(P＜0.05)?證實(shí)牛血清白蛋白消除了反應(yīng)體系中固有存在的抑制劑對(duì)UGT2B7的抑制作用,進(jìn)而增強(qiáng)了其代謝活性?因此研究UGTs參與代謝的藥物,尤其是UGT2B7參與代謝的藥物,進(jìn)行人肝微粒體代謝實(shí)驗(yàn)應(yīng)加入一定量的牛血清白蛋白,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果盡可能準(zhǔn)確地反映體內(nèi)藥物代謝過程?

本研究還在國(guó)內(nèi)首次建立了人肝微粒體中齊多夫定葡萄糖苷酸的高效液相測(cè)定方法?齊多夫定在266 nm處存在最大吸收峰,在此波長(zhǎng)條件下,齊多夫定葡萄糖苷酸也存在很強(qiáng)的吸收,且孵育體系中的其他物質(zhì)不干擾樣品峰,最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm?曾嘗試采用甲醇-水作為流動(dòng)相,在此條件下,雖然齊多夫定峰形良好,但齊多夫定葡萄糖苷酸的色譜峰拖尾非常嚴(yán)重?因此考察了乙腈-磷酸鹽緩沖液(20 mM, pH=2.2)流動(dòng)相及不同比例對(duì)分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸鹽緩沖液比例為12∶88時(shí)兩種物質(zhì)的分離度和柱效均比較理想,故加以選用?實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,本研究建立的人肝微粒體中齊多夫定葡萄糖苷酸的高效液相色譜測(cè)定方法,操作簡(jiǎn)便?靈敏度高?重現(xiàn)性好?專屬性強(qiáng),為UGT2B7的體外活性測(cè)定奠定了基礎(chǔ)?

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Effects of bovine serum album in on zidovudine glucuronidated by UGT2B7 in human liver m icrosomes

Wang Yang,Gao Jie,Qiao Hailing
(Department of Clinical Pharmacology,School of Medicine,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China)

【Abstract】Objective To investigate the efect of bovine serum albumin(BSA)on the activities of UDP-glucuronosyltrans-ferase(UGT)2B7 in human livermicrosomes(HLMs).M ethods HLMswere prepared by diferential centrifugationmethods.The kinetics of glucuronidation of zidovudine(AZT,3'-azido-3'-deoxy-thymidine),a selective UGT2B7 substrate,was measured to reflect the activity of UGT2B7 in HLMs.The formations of AZT and itsmetabolite,AZT-β-D-glucuronide,were analyzed using a reversed-phase high-performance liquid chromatography.Incubation systems were divided into two groups.One was control group and the other was BSA group which included 2%BSA.Results UGT2B7-dependent AZT glucuronida-tion in control and BSA groups showed that the results were consistent with a typical Michaelis-Menten equation.The enzyme kinetics parameters of AZT in controland BSA groupswere as folows:the Vmaxwere(1 359.0±135.8)and(1 268.4±300.1)pmol/(min·mg protein),the Kmwere(368.0±64.3)and(111.4±6.9)μM,the CLintwere(3.7±0.4)and(11.4± 2.7)μl/(min·mg protein),respectively.Compared with control group,the Kmvalue of UGT2B7 was significantly decreased and the CLintvalue was significantly increased in the BSA group (P＜0.05).Conclusion The activity of UGT2B7 in HLMs wasbook=11,ebook=17significantly influenced by BSA which decreased the value of Kmand increased the value of CLint.

【Key words】bovine serum albumin;Human livermicrosomes;UGT2B7;zidovudine

(收稿日期:2015-09-01)

通訊作者:喬海靈,E-mail:qiaohl@zzu.edu.cn?

【中圖分類號(hào)】R 96

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.01.002