張珊珊，胡安勝，郭振濱，朱虹，李松（.空軍勤務(wù)學(xué)院，江蘇徐州000；.徐州兒童醫(yī)院，江蘇徐州000）

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反式和順式白藜蘆醇淬滅自由基能力研究

張珊珊1，胡安勝1，郭振濱1，朱虹1，李松2
（1.空軍勤務(wù)學(xué)院，江蘇徐州221000；2.徐州兒童醫(yī)院，江蘇徐州221000）

摘要：用乙醇從何首烏（Polygonum multiflorum Thunb）中提取白藜蘆醇單體，在254 nm紫外燈下照射18 min誘導(dǎo)成為順式單體。用HPLC純化分離出反式和順式白藜蘆醇，使用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA體系檢測兩種單體的淬滅羥自由基的能力。結(jié)果顯示，順式單體較反式單體具有更顯著地淬滅羥自由基的能力。

關(guān)鍵詞：何首烏；白藜蘆醇；自由基

白藜蘆醇作為一種天然產(chǎn)物，近來的醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究表明其對人體健康十分有益。白藜蘆醇廣泛分布于約70種高等植物中，如在一些傳統(tǒng)中草藥中以共軛或游離形式存在。白藜蘆醇具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗菌、類雌樣激素以及對心血管系統(tǒng)等與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的疾病均有明顯的作用[1]。近年來，有關(guān)白藜蘆醇抗氧化作用一直是人們研究的熱點(diǎn)，但大多采用生理指標(biāo)作判定，生物發(fā)光檢測技術(shù)對白藜蘆醇特別是順式異構(gòu)體的抗DNA氧化損傷進(jìn)行研究的國內(nèi)報道很少。

本試驗(yàn)使用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系產(chǎn)生·OH，·OH損傷DNA產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，檢測了從何首烏中提取的正式與反式白藜蘆醇對DNA損傷的抑制作用及其差別。

1試驗(yàn)材料與方法

1.1儀器

BPCL-4型微弱發(fā)光測量儀：中國科學(xué)院生物物理研究所設(shè)計并制造；Multispec-1501 Shimadzu二極管陣列檢測器：島津儀器公司；AKTA Purifier 900快速分子分離純化系統(tǒng)：安瑪西亞（中國）有限公司；2996型光電二極管陣列檢測器、1525型二元HPLC泵：Waters公司；C18色譜柱（DiamonsilC18，4.6mm×250mm，5 μm）；WD-9403C型紫外分析儀（300 nm透射、254 nm反射、365 nm反射）：北京市六一儀器廠；SPB-1型無噪音無油空氣壓縮機(jī)、8PN-3600型全自動氮?dú)獍l(fā)生器：北京色譜分析技術(shù)研究所；分析天平（MA200型電子天平）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市英峪予華儀器廠；索氏提取器、搗碎機(jī)、微量注射器等。

1.2試劑

反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99 %）、VC（分析純）、魯米諾（分析純）：Sigma公司；甲醇（色譜純）：迪馬公司；無水乙醇（分析純）：北京化工廠；無水硫酸銅（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；鄰啡羅啉（分析純）：天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；魚精DNA（分析純）：北京拜爾迪生物公司；30 %過氧化氫（分析純）、乙酸鈉、冰醋酸、硫酸亞鐵胺：北京化學(xué)試劑廠。

1.3材料

中藥何首烏：購自于徐州市同仁堂藥店。

1.4方法

1.4.1白藜蘆醇對照制備

精確稱取一定量的反式白藜蘆醇對照品，溶于甲醇，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的對照品溶液。于-40℃冰箱避光保存。254 nm特定波長累計照射1 min，誘導(dǎo)白藜蘆醇由反式結(jié)構(gòu)向順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。反式和順式白藜蘆醇紫外吸收光譜鑒定：在230 nm~300 nm范圍，利用二極管陣列檢測器（PDA）對誘導(dǎo)的Z-白藜蘆醇進(jìn)行定性分析[2]。

1.4.2何首烏中白藜蘆醇的萃取

采用攪碎機(jī)將何首烏粉碎至80目（原料含水量小于10 %）[3]。過80目篩后取20 g何首烏粉和50 mL體積分?jǐn)?shù)為95 %的乙醇一起置于搗碎機(jī)中，搗碎30 s，負(fù)壓抽濾，收集濾液，濾渣用50 mL體積分?jǐn)?shù)為95 %乙醇重復(fù)提取抽濾5次，合并濾液。冷凍干燥至原體積的1/4。

1.4.3高效液相色譜法純化白藜蘆醇

色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相中，A液為15 %乙腈和0.1 %的三乙胺水溶液，B液為100 %乙腈，梯度洗脫，20 min內(nèi)由100 %A液變?yōu)?00 %B液。流速為0.6 mL/min，紫外可見光檢測器波長為308 nm檢測，進(jìn)樣量20 mL。二極管陣列檢測器（PDA）的波長范圍為250 nm~400 nm。

1.4.4化學(xué)發(fā)光法檢測竹葉提取物體外抗DNA損傷的能力

本試驗(yàn)采用Cu2+催化H2O2產(chǎn)生·OH，·OH又能導(dǎo)致DNA的氧化損傷，經(jīng)鄰菲啰啉增強(qiáng)發(fā)光，在化學(xué)發(fā)光儀上測定發(fā)光值。具體方法如下：用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH5.5）配制CuSO4-Phen-VC-DNA溶液，使Cu2+、Phen、VC、DNA終濃度分別為5×10-5mol/L、3.5× 10-4mol/L、3.5×10-4mol/L、1 μg/mL。取該溶液1 mL，放入發(fā)光儀樣品池中，再加入0.1 mL不同濃度的黃酮（對照組用去離子水代替）。立即放入樣品槽中測化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線，于120 s時加入200 μL 3 %的H2O2溶液，在高壓值定為1100V，系統(tǒng)噪聲值小于100，48℃恒溫下測量化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)曲線。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

在進(jìn)行白藜蘆醇定量分析時要嚴(yán)格避光，防止見光分解[4]。

2結(jié)果與分析

2.1反式和順式白藜蘆醇的純化

利用1.4.3所設(shè)置的色譜條件，將何首烏中的反式白藜蘆醇以及誘導(dǎo)后的順式白藜蘆醇進(jìn)行分離（如圖1）在色譜條件上可以清晰的看出經(jīng)過誘導(dǎo)以后，出現(xiàn)了順式白藜蘆醇。與對照品吸收光譜一致。

圖1紫外光誘導(dǎo)前后萃取液的RP-HPLC色譜圖Fig.1 RP-HPLC profiles of extracts before and after UV-induced isomerisation

在上述色譜條件下，在檢測器出口收集白藜蘆醇組分?？啥啻问占?，合并收集液，用氮?dú)獯蹈扇軇?，得到反式和順式白藜蘆醇濃縮物。

2.2反式和順式白藜蘆醇對CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化學(xué)發(fā)光體系中·OH引起的DNA氧化損傷的保護(hù)作用

將順式不同濃度的白藜蘆醇加入發(fā)光體系中進(jìn)行抗氧化的檢測，進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，繪制成圖表，見圖2。

圖2順式白藜蘆醇在CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA體系中化學(xué)發(fā)光Fig.2 Photon count of CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA reaction with Z-resveratrol as hydroxyl radical quencher

由圖2可看出，與對照I和VI比較，IV和V對·OH造成的DNA氧化損傷有明顯的抑制作用。因III的峰高明顯比對照I低，但又比對照VI稍高，因此，抑制DNA損傷的下限濃度可暫定為III= 0.1 μg/mL左右。

將反式不同濃度的白藜蘆醇加入發(fā)光體系中進(jìn)行抗氧化的檢測，進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，繪制成圖表，見圖3。

圖3反式白藜蘆醇在CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA體系中的化學(xué)發(fā)光圖Fig.3 Photon count of CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA reaction with Z-resveratrol as hydroxyl radical quencher

為了避免體系自身衰減對低濃度樣品（II和III）試驗(yàn)的影響，可通過與甲醇對照組比較出峰時間的變化和峰高的變化，來判斷低濃白藜蘆醇Z-單體是否有抑制·OH對DNA造成損傷的作用（圖4、圖5）。

圖4反式和順式白藜蘆醇樣品含量的變化對光子計數(shù)值的影響Fig.4 Influence of E-and Z-resveratrol amounts on the maximum photon count

由上圖可看出，濃度較低時，反式和順式得出峰時間大致相同，濃度較高的4號和5號樣品在出峰時間上出現(xiàn)了明顯的區(qū)別。可得出反式白藜蘆醇延遲DNA氧化損傷效果較順式異構(gòu)體好。

圖5反式和順式白藜蘆醇樣品含量的變化對和出現(xiàn)時間的影響Fig.5 Change of E-and Z-resveratro content of sample and time of appearance

由上圖看出，兩樣品的濃度順序大致相同，反式單體對峰高的抑制效果比順式單體稍好一些。

3　結(jié)論

由以上數(shù)據(jù)可得出結(jié)論：反式白藜蘆醇對CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA體系中羥自由基氧化損傷DNA有顯著抑制作用；并且這種抑制作用好于順式異構(gòu)體。

參考文獻(xiàn)：

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Study on Free Radical by E-and Z-isomers of Resveratrol

ZHANG Shan-shan1，HU An-sheng1，GUO Zhen-bin1，ZHU Hong1，LI Song2
（1. The air force institute of service，Xuzhou 221000，Jiangsu，China；2. Xuzhou Children's Hospital，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract：This experiment used the ethanol from polygonum multiflorum thunb extract resveratrol monomer，on the 254 nm under UV light irradiation induced by 18 min into CIS monomer. With HPLC isolation and purification of a trans and CIS resveratrol，the ability to use CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA system for detection of two kinds of monomer quenching hydroxyl free radical. The results showed，compared with the trans CIS monomer monomer has the ability to significantly quenching hydroxyl free radical.

Key words：polygonum multiflorum thunb；resveratrol；free radieal

收稿日期：2015-04-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.044

作者簡介：張珊珊（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品安全與檢測。