李允江，畢云生，張淑瑜，于燕莉

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

D-半乳糖對大鼠血清同型半胱氨酸含量及血管病理變化的影響

李允江，畢云生，張淑瑜，于燕莉

目的 研究D－半乳糖致大鼠衰老后血清同型半胱氨酸（hcy）的變化，并與正常鼠血管結(jié)構(gòu)組織比較。方法采用皮下注射D－半乳糖的方法制備大鼠衰老模型（n=10），另設(shè)10只為正常組。采用AU5800全自動生化檢測儀測定血清中hcy的含量，運用SPSS16分析hcy含量差異與正常組比較。結(jié)果hcy含量在兩組間差異顯著（6.7700±0.30203 vs 12.8400±0.62039 E2/mg·ml，P＜0.05）；模型組對血管引起正常組所沒有的較大變化。結(jié)論D－半乳糖能升高衰老大鼠血清中的hcy含量，并可改變血管的病理學(xué)指數(shù)。

D－半乳糖；血清；同型半胱氨酸（hcy）；病理學(xué)變化

D－半乳糖衰老動物模型目前已被眾多國內(nèi)外學(xué)者肯定和接受，該造模方法比其他幾種衰老模型得到的結(jié)果更加穩(wěn)定，但是，目前對于其致衰機制還不是特別清楚，不同文獻的檢測指標(biāo)也各有差異。秦紅兵等［1］研究發(fā)現(xiàn)D－半乳糖建立衰老模型能夠使小鼠的記憶功能出現(xiàn)下降，增加氧自由基產(chǎn)物的含量，降低機體的抗氧化能力以及降低小鼠的免疫功能，得出此模型可用于行為學(xué)、抗氧化，以及免疫等方面的抗衰老藥效研究。但是還沒有研究顯示此模型對血清中同型半胱氨酸（hcy）的影響。楊惠聰?shù)龋?］研究發(fā)現(xiàn)hcy是動脈粥樣硬化的危險因素，并且與冠狀動脈粥樣硬化病變程度呈正相關(guān)。王三敏［3］發(fā)現(xiàn)hcy是頸動脈粥樣硬化的獨立危險因素。張琛濤［4］研究發(fā)現(xiàn)冠心病血管病變支數(shù)和狹窄程度與血漿Hcy水平具高度相關(guān)性，病變程度越重、病變支數(shù)越多，血漿hcy水平越高。Wald等［5］研究發(fā)現(xiàn)血漿中的同型半胱氨酸含量與心血管疾病的發(fā)生成正相關(guān)。李艾帆［6］研究發(fā)現(xiàn)高hcy血癥是河南漢族腦梗死的獨立危險因素。任應(yīng)鵬等［7］研究發(fā)現(xiàn)hcy是獨立于T－chol以外的心腦血管疾病危險因子。所以說hcy目前已被廣泛證明是一種獨立的心腦血管疾病風(fēng)險的預(yù)測因子。隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展，醫(yī)療水平的提高，我國人口平均壽命不斷提高，老齡化問題日趨嚴重，目前我國老年人口在增速和數(shù)量上均為全球第一。聯(lián)合國的最新預(yù)測顯示，在21世紀(jì)中期，中國60歲（包含60歲）以上老人占總?cè)丝诘谋戎貙⑦_到36.5%這一歷史新高，屆時將高于美國等絕大部分發(fā)達國家。然而心腦血管方面的疾病是一個威脅老齡人口健康的重要疾病，心腦血管疾病在老年人中的死亡率占首位。所以說有效預(yù)測心腦血管疾病顯得尤為重要，但是目前還沒有報道D－半乳糖衰老大鼠血清中hcy的報道，筆者擬對其進行檢測，并將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠20只，SPF級，體重180～210 g，購買自山東大學(xué)實驗動物中心（動物合格證號：SCXK（魯）2013-0009）。飼養(yǎng)在濟南軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 D-半乳糖 （20141021，購自張家港市思普生化有限公司）、AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）、B600A型醫(yī)用低速離心機（河北省安新縣白洋離心機廠）、水合氯醛（規(guī)格：30 ml∶3 g，濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科制劑室自制，批號：20141221）和多聚甲醛溶液（自配）。

1.2 方 法

1.2.1 衰老大鼠模型的建立 將20只雄性Wistar大鼠按體重隨機分成兩組，正常組和模型組。先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，對照組10只，每只背部皮下注射生理鹽水1 ml/100 g·d，模型組10只，每只背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg·d，每周進行一次體重測量，根據(jù)新的體重對生理鹽水和D-半乳糖的注射劑量進行調(diào)整，連續(xù)45 d，完成衰老模型的建立。

1.2.2 指標(biāo)檢測 造模結(jié)束后，對所有大鼠禁食12 h，不禁水，12 h后大鼠用水合氯醛麻醉取靜脈血置于真空取血管中，輕微晃動使抗凝藥與血液混合充分后靜置片刻后于3000 r/min離心10 min，用液槍分離血清和血漿，分別置于Ependoff管保存在-80℃的超低溫冰箱中備用，取各血清適量于全自動AU5800生化測定儀測定hcy的含量。胸主動脈取出后小心剔除脂肪組織，避免破壞血管的組織結(jié)構(gòu)，浸泡于多聚甲醛溶液中進行固定，保存于4℃的冰箱中以備做病理切片。對血管內(nèi)中外膜進行HE染色，在光鏡下觀察組織病理學(xué)的改變。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS16統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05認為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血清中hcy含量的測定 兩組間存有顯著性差異 （6.7700±0.30203 vs 12.8400±0.62039 E2/mg· ml，P＜0.05）。D-半乳糖衰老大鼠模型的血清hcy含量明顯比正常組高。說明D-半乳糖能夠使大鼠血清中的hcy含量升高。

2.2 血管病理組織切片檢查 模型組胸主動脈血管在鏡下可以看到血管管腔不規(guī)則，局部血管壁增厚，部分內(nèi)皮細胞腫脹，局部內(nèi)皮細胞脫失，血管內(nèi)膜及管壁水腫并伴有少量炎性細胞浸潤，血管壁纖維組織及平滑肌出現(xiàn)增生的現(xiàn)象。說明D-半乳糖對血管的結(jié)構(gòu)功能產(chǎn)生了較大影響，并與hcy的高水平相互佐證。而正常組的血管管腔很規(guī)則，內(nèi)皮細胞也未見腫脹，內(nèi)膜光滑，未見脂質(zhì)沉淀，血管膜及血管壁未見纖維組織及平滑肌的增生，沒有炎性細胞浸潤的現(xiàn)象。見圖1。

圖1 兩組大鼠血管病理組織切片結(jié)果比較

3 討論

心腦血管疾病是指血液黏稠、動脈粥樣硬化、高脂血癥、高血壓等因素所導(dǎo)致的心和大腦以及全身組織發(fā)生缺血性或出血性的疾病，通常統(tǒng)稱為心血管疾病和腦血管疾病，是當(dāng)前嚴重威脅人類健康和生命的疾病之一［7］。Wald等［5］研究顯示血漿hcy水平和血管危險性之間呈劑量依賴關(guān)系，即hcy每升高5 μmol/L，腦卒中風(fēng)險升高59%，缺血型心臟病風(fēng)險升高32%，Hcy每降低3 μmol/L，腦卒中風(fēng)險降低24%，缺血型心臟病風(fēng)險降低16%，呈明顯的正相關(guān)。同型半胱氨酸（homocysteine，hcy）是蛋氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物，其有兩種存在形式，一種是含二硫基的氧化型，一種是含硫基的還原型，但是還原型只占極少數(shù)部分。

膽固醇和心腦血管疾病的緊密聯(lián)系已經(jīng)與現(xiàn)在越來越多的臨床案例不相符合，有一半以上的心腦血管疾病患者的血常規(guī)檢驗報告顯示他們的膽固醇并不高。對于心腦血管疾病的危險因素有些是非人為可以改變的，比如性別，遺傳等因素，目前可以干預(yù)的危險因素有高脂血癥，高血壓等，但并不是每個心腦血管疾病患者都存在這些癥狀，有些心腦血管疾病患者并不具備這些癥狀，所以尋找新的、準(zhǔn)確的心腦血管預(yù)測風(fēng)險因子顯得非常必要。

hcy是人體生命活動代謝的正常產(chǎn)物，當(dāng)人們食用含蛋氨酸的蛋白質(zhì)后，就會通過體內(nèi)的蛋氨酸代謝途徑生成，是谷胱甘肽以及S-AMe生成的中間產(chǎn)物。其中S-AMe是人體內(nèi)良好的甲基供體，是一種不可或缺的生命物質(zhì)，能夠保證體內(nèi)的生化反應(yīng)按照正確而有效的方式進行。也就是說食用的蛋氨酸先轉(zhuǎn)換為hcy，再經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽和S-AMe。但是一旦機體由于種種原因而缺乏維生素B族的一些元素，葉酸以及個別金屬元素比如鋅等，就會使生化反應(yīng)的某些環(huán)節(jié)因缺少反應(yīng)物而無法完成正常的轉(zhuǎn)化過程，利用hcy的反應(yīng)受到影響，就會使體內(nèi)hcy含量升高，由于生成谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的途徑受到阻礙，它們在體內(nèi)的含量因此而降低。然而Umphrey等［8］研究證明hcy是心腦血管疾病危險的始動因子。高hcy能夠損傷血管內(nèi)皮功能，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。郭雪微等［9］研究發(fā)現(xiàn)隨著hcy水平增高，血白細胞表面黏附分子CD11b、CD18表達明顯增加，從而增加炎性反應(yīng)。本實驗的胸主動脈血管病理組織切片的特征也與此相符。至于產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，谷兆俠等［10］研究發(fā)現(xiàn)hcy能夠刺激氧化應(yīng)激反應(yīng)而造成體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量的升高。之前的研究證明D-半乳糖致Wistar大鼠衰老模型的方法能夠升高大鼠體內(nèi)SOD，MDA的水平，并與其他學(xué)者的報道相符。Cui等［11］研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖是一種機體本身就含有的代謝產(chǎn)物，當(dāng)注射一定劑量的半乳糖后，原有的代謝途徑無法及時有效地利用D-半乳糖，就會造成大量D-半乳糖堆積在細胞內(nèi)，不能通過eLilo和醛糖還原酶通路及時代謝，過量的D-半乳糖就會在半乳糖氧化酶作用下，生成醛類、H2O2以及超氧陰離子，從而對機體產(chǎn)生損傷。這一代謝機制是D-半乳糖致衰的機制，也是其優(yōu)點，利用機體本身具有的代謝中間產(chǎn)物干預(yù)機體的生命活動不會產(chǎn)生額外的損傷，顯示出了良好的造模方法。肖航等［12］研究發(fā)現(xiàn)用含10 g/L的D-半乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)出生3 d內(nèi)SD乳鼠純化的心臟成纖維細胞72 h后，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖能縮短SD乳鼠心臟成纖維細胞端粒的長度。伴隨著基因的復(fù)制，細胞生長繁殖，宏觀上就是人年齡的增長，端粒的長度在不斷的縮短，當(dāng)短到一定程度時則無法完成細胞的復(fù)制，生命體就會隨之結(jié)束。劉克明等［13］研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖導(dǎo)致的大鼠衰老模型雖然某些指標(biāo)接近自然衰老的大鼠，但是很多方面（比如免疫力，行為等）與自然衰老的大鼠相比還存在較大的差異。D-半乳糖模型鼠是由化學(xué)損傷造成的，難以真實反映衰老的生理生化改變。因此D-半乳糖模型鼠可能不宜應(yīng)用于免疫、行為等方面的衰老研究。也就是說D-半乳糖只適用于部分衰老的研究，本課題的目的就是證明D-半乳糖能否提高大鼠血清中hcy的水平以便進而用此模型進行血管抗衰老研究，因為hcy是心腦血管疾病的獨立風(fēng)險預(yù)測因子，但是目前還沒有實驗證據(jù)顯示D-半乳糖能夠升高hcy的水平。

該實驗采取的是醫(yī)院臨床上常用的生化分析儀，對臨床監(jiān)測更具有現(xiàn)實意義，全自動生化分析儀相比高效液相色譜法具有顯著的優(yōu)點，迅速，準(zhǔn)確，并且能有效地避免人為操作誤差。本實驗的研究結(jié)果證明D-半乳糖能夠提高大鼠血清hcy的水平，并且胸主動脈血管病理組織表現(xiàn)出了一系列的病理特征，從組織上佐證了這一結(jié)論。提示D-半乳糖致大鼠衰老模型可以用來做血管衰老的實驗研究，并且可以用hcy的水平為指標(biāo)。

［1］秦紅兵，楊朝曄，范憶江，等.D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠模型的建立和評價［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（7）：1275-1278.

［2］楊惠聰，吳阿陽，林 潔，等.血漿中CRP、Hcy、LDL、HDL含量與動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2011，20（8）：2433-2437.

［3］王三敏.hcy、mif與頸動脈粥樣硬化相關(guān)性研究［D］.蚌埠：蚌埠醫(yī)學(xué)院，2013.

［4］張琛濤.HCY與冠心病、高血壓病的相關(guān)性研究［D］.桂林：桂林醫(yī)學(xué)院，2013.

［5］Wald DS，Law M，Morris JK.Homocysteine and cardiovascular disease：evidence on causality from a meta-nalysis［J］.BMJ，2002，325（7374）：1202.

［6］李艾帆.hcy及其代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性與河南漢族腦梗死的相關(guān)性研究［D］.鄭州：鄭州大學(xué)，2014.

［7］馮變玲.基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的心腦血管用藥ADR關(guān)聯(lián)模型構(gòu)建研究［D］.天津：天津大學(xué)，2012.

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［2016－03－12收稿，2016－04－10修回］ ［本文編輯：韓仲琪］

In
fluence of D-galactose on serum hcy levels and vessel pathological changes of rats

LI Yun－jiang①，BI Yun－sheng，ZHANG Shu－yu，et al.①Shandong University of TCM and Materia Medica，Jinan，Shandong 250000，China

Objective To study the changes of serum hcy of aging rats induced by D－galactose，and explore the influence of it on pathological exchanges of vessels.MethodsThe rat aging model was made by subcutaneous injection of D－galactose（n=10，as model group）；other 10 rats were selected as normal control group. The content of hcy in serum was detected by AU5800 automatic biochemical analyzer.By using SPSS16 the difference of hcy content was compared between two groups.ResultsSignificant difference possessed between two groups（P＜0.05）in hcy content（6.7700±0.30203 vs 12.8400±0.62039 E2/mg·ml）.While，the pathological changes of vessels in control group and model group also provided relevant proof.ConclusionD－galactose could increase the content of hcy in serum of aging rats，and make vessels resulting in pathological change.

D－galactose；Serum hcy；Pathological change

R339.34：C913.6

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.09.022

250000山東濟南，山東中醫(yī)藥大學(xué) ［李允江 （在讀碩士）］；250031山東濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院（李允江，畢云生，張淑瑜，于燕莉）

于燕莉，Email：yuyanli323@sohu.com