巢浩界 張銘

臨床研究

時間分辨熒光免疫分析技術檢測乙肝病毒標志物優(yōu)越性的探討

巢浩界 張銘

目的建立時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測乙肝病毒標志物5項指標的方法，并與酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行比較分析。評價TRFIA的性能，以期提高乙肝病毒標志物定量檢測的診斷價值。方法收集329 份血清標本，用TRFIA檢測乙肝病毒標志物，并與ELISA檢測的結果進行比較分析。結果兩種方法檢測乙肝病毒標志物的結果一致率較好〔乙肝表面抗原(HBsAg) 為99.4%，乙肝表面抗體(HBsAb)為98.8%，乙肝E抗原(HBeAg)為99.1%，乙肝E抗體(HBeAb)為98.2%，乙肝核心抗體(HBcAb)為97.6%〕;TRFIA陽性檢出率大于ELISA(HBsAg:90比88，HBsAb: 115比111，HBeAg:45比42，HBeAb:211比205，HBcAb:246比238，P均＜ 0.05)。TRFIA的 敏感度和特異度均優(yōu)于ELISA(敏感度:97.80%比91.21%，特異度:99.58%比97.89%，P均＜ 0.05); TRFIA的批內和批間變異系數(shù)(CV)均優(yōu)于ELISA(批內CV:3.19%比5.99%，批間CV:4.68%比7.55%，P均＜ 0.05)。結論TRFIA作為一項具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物技術，對乙肝病毒標志物的檢測效能高于ELISA。

時間分辨熒光免疫分析法;乙肝病毒標志物;酶聯(lián)免疫吸附試驗

20世紀70年代芬蘭科學家Soini和Hemmia首先引入了“時間分辨熒光免疫分析”的概念?；诜派湫悦庖叻治黾夹g具有放射性污染的缺點，20世紀80年代Soini和Kojola發(fā)明了時間分辨熒光免疫分析技術［1-2］，有別于傳統(tǒng)的熒光免疫分析技術，這是一種將熒光物質和時間分辨技術相結合的技術，其基本原理是用銪(Eu3+)、鋱(Te3+)及釤(Sm3+)、鏑(De3+)等示蹤物來標記抗原抗體、多肽、激素、核酸探針等微量物質，形成鑭系元素標記的抗原抗體結合物，最后待背景上的短壽命熒光完全淬滅后，再測量產物上的長壽命熒光強度和相對熒光強度的比值得出最終的結果［3］。時間分辨熒光免疫分析技術分別以不同的波長且分時間段測量標記物上的熒光強度，利用發(fā)射光和激發(fā)光之間的Stokes位移可以有效地消除標本中的非特異熒光物質的干擾，最常用的示蹤物為鑭系元素，以此來標記抗原、抗體，具有制備簡單、儲存時間長、線形范圍寬、高敏感度、特異度、對多種被檢物質同時測定的優(yōu)點?，F(xiàn)對本院采用該方法檢測乙肝病毒標志物的優(yōu)越性進行探討，報告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器 Anytest2000型時間分辨儀由新波公司生產;運用伯樂洗板機洗板及伯樂酶標儀，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑由珠海麗珠試劑有限公司提供。

1.2 標本來源 隨即選取2015年1月至5月常州市婦幼保健院婦科和產科住院患者共329例，靜脈采血，分離血清，-20℃保存。乙肝病毒血清標志物質控品購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心，批號090040。

1.3 實驗方法 采用ELISA定性檢測和時間分辨免疫熒光法(TRFIA)定量檢測329份血清標本和質控樣品的的乙肝兩對半。

1.4 結果判斷 TRFIA的陽性判斷標準為乙肝表面抗原(HBsAg)≥0.2 μg/L、乙肝表面抗體(HBsAb) ≥10 U/L、乙肝E抗原(HBeAg)≥0.5 PEIU/mL、乙肝E抗體(HBeAb)≥0.2 PEIU/mL、乙肝核心抗體(HBcAb)≥0.9 PEIU/mL。

1.5 統(tǒng)計學處理 實驗所得的數(shù)據(jù)全部采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料的結果以均數(shù)±標準差(±s)表示;采用χ2檢驗對計數(shù)資料分析;P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TRFIA和ELISA檢測329份血清標本的結果

兩種方法測定標本HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的結果符合率經(jīng)配對χ2檢驗差異均有統(tǒng)計學意義(P均＜ 0.05)。見表1。

表1 TRFIA和ELISA檢測329份血清標本乙肝兩對半的比較

TRFIA對乙肝病毒的檢出敏感度和特異度明顯優(yōu)于ELISA(P均＜ 0.05)。見表2。

表2 TRFIA和ELISA檢測乙肝病毒的敏感度和特異度比較

2.2 準確度 將濃度為126.8 μg/L的HBsAg血清樣本分別加入到50、200、400 μg/L標準參考品中進行回收試驗?；厥章史謩e為97.2%、96.5%、98.6%，平均97.4%。

2.3 精密度 隨機選取高、中、低值3份混合血清樣品HBsAg 濃度分別為35.5、264.3、659.7 μg/L)，按操作步驟操作，20孔平行測定，TRFIA批內和批間變異系數(shù)(CV)分別平均為3.19%和4.68%，均優(yōu)于ELISA(P均＜ 0.05)。見表3～4。

表3 HBsAg 批內精密度測試(n = 20)

表4 HBsAg 批間精密度測試(n = 20)

2.5 靈敏度 重復測定陰性標本20次，計算檢測結果的均值+2倍標準差，也就是所能檢測的最低抗原濃度。ELISA的最低檢出濃度為5 μg/L，TRFIA 為0.5 μg/L。

3 討論

試驗結果明顯可以看出，兩種方法檢測乙肝病毒兩對半的結果一致率較好，但TRFIA陽性檢出率和敏感度均大于ELISA，可以減少一些極低濃度HBsAg、HBeAg患者的假陰性率。

TRFIA具有很高的穩(wěn)定性和靈敏度，近年來在國內外得到廣泛的認可，同時國內多家公司在時間分辨技術基礎上開發(fā)的乙肝兩對半試劑，填補了我國檢驗界在乙肝微量檢測方面的空白，是對乙肝標志物微量檢測方面革命性的突破。有文獻表明，在很多乙肝病毒(HBV)感染的患者中，HBsAg呈低水平存在［4］，在血清中含量很低，不易檢出，很容易造成漏檢。目前，對HBsAg的檢測方法仍然普遍采用傳統(tǒng)的ELISA，這在一定程度上造成了相當一部分HBsAg低水平的人群被大量漏檢。吳宗華等［5］針對大樣本非肝炎患者的檢測結果表明，HBsAg小于5 ng/mL以下者在檢測總人群和陽性患者中的比例分別為2.34%和23.16%。通過TRFIA定量檢測“乙肝兩對半”發(fā)現(xiàn)，部分ELISA單項抗-HBc陽性標本用TRFIA能夠檢測出HBsAg。

TRFIA的優(yōu)越性體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，急性乙肝早期，HBsAg含量極微，采用傳統(tǒng)酶法通常檢測不出;而TRFIA能及早檢出HBsAg，可以印證是否感染于HBV，減少窗口期時間。其二，在有些慢性乙肝患者中，分泌到血清中的HBsAg量極少，產生的HBsAb亦量少，采用一般的酶法檢測通常也為陰性;而TRFIA的高敏感性可以避免這種情況的發(fā)生，為臨床及時有效的診斷治療疾病提供了可靠的依據(jù)。其三，為其他肝病的鑒別診斷提供依據(jù)，如病毒性肝炎、酒精性肝炎等臨床癥狀、體征及肝功能極其相似，唯一的方法是找到病原體，才能有效的診斷疾病。因此，TRFIA定量檢測乙肝兩對半正逐步成為現(xiàn)代檢測乙型肝炎血清學標志物新的發(fā)展方向。

TRFIA極大地提高檢測分析的敏感性，因此在很多急性乙肝感染的早期或慢性乙肝患者中HBsAg往往小于2 μg/L，采用高靈敏度的TRFIA可以及時檢出HBsAg，佐證了HBV感染，且能夠同時檢測出乙肝病毒前S1抗原(perS1)，兩者相互印證［6］。在病程觀察中TRFIA能及早檢出HBsAg，印證HBV感染，減少窗口期時間;在病毒變異或低水平的二次感染時可以采用TRFIA檢測出血清中極微量的HBsAg和HBsAb。TRFIA定量檢測乙肝兩對半，可以動態(tài)觀察病情并為臨床及時有效的診斷治療疾病提供可靠的依據(jù)。定量檢測HBsAg和HBsAb的濃度變化，可以診斷急性乙肝是否處于恢復期;定量檢測HBsAg和HBeAb的濃度變化，可以為病情變化和治療效果提供依據(jù);定量檢測HBcAb濃度的變化可以反映病毒感染的狀態(tài)及是否感染后處于恢復期。

判斷機體是否具有中和HBV感染的免疫力要看HBsAb的含量，ELISA可以檢測出來含量在10 U/L以上的樣本，呈現(xiàn)陽性結果，且ELISA只能夠作出陰陽性的定性判斷;而TRFIA能夠精確檢測出HBsAb的含量［7］。定量檢測HBV表面抗原HbsAg濃度的最佳診斷臨界點是5.03×106U/L，超過臨界點的患者需要監(jiān)測并治療［8］。機體對HBV入侵的抵抗能力和保護時間與HBsAb含量呈正相關。對于HBsAb含量較低的人群，應該加強注射一次乙肝疫苗，使 HBsAb的濃度提高起到預防作用。

TRFIA動態(tài)、定量檢測乙肝兩對半的抗原抗體陽性模式能幫助臨床分析機體免疫反應的機制，判斷臨床轉歸，及時預測耐藥病毒株的出現(xiàn)和監(jiān)測停藥反彈，對指導臨床治療能起到積極的指導作用。因此，TRFIA作為一項具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男屡d的生物技術，將會對臨床和科研產生更大的促進作用。

1 Hemmil? I， Dakubu S， Mukkala VM， et al. Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays. Anal Biochem，1984，137: 335-343.

2 Kristjánsson S， Stranneg?rd IL， Wennergren G. Inflammatory markers in childhood asthma. Ann Med，1996，28:395-399.

3 Kim HY， DeKruyff RH， Umetsu DT. The many paths to asthma: phenotype shaped by innate and adaptive immunity. Nat Immunol，2010，11:577-584.

4 潘繼文.時間分辨熒光免疫分析技術檢測乙型肝炎病毒血清學標志物評價.檢驗醫(yī)學與臨床，2011，8:3030-3031.

5 吳宗華. TRFIA與ELISA法檢測乙肝病毒血清學標志物的分析與比較.臨床醫(yī)學工程，2012，19:1967-1968.

6 劉榮靜，習浩，林列坤.乙型肝炎病毒表面抗原弱反應性標本的檢測及臨床意義.檢驗醫(yī)學與臨床，2010，7:404-405.

7 蔡軍，劉曉麗.時間分辨熒光免疫分析法測定乙肝HBsAg的臨床意義.山西醫(yī)科大學學報，2011，42:406-408.

8 覃彥平，柯柳華，蔣義生，等.回顧性分析慢性乙型肝炎患者血清HBsAg與HBV DNA水平的關聯(lián)性.實用檢驗醫(yī)師雜志，2014，6: 164-167.

(本文編輯:李銀平)

Study on the superiority of hepatitis B virus markers detected by time resolved fluorescence immunoassay

CHAO Hao-jie, ZHANG Ming. Maternal and Child Care Service Centre in Changzhou, Changzhou 213000, Jiangsu, China

ObjectiveTo establish a method for the determination of 5 markers of hepatitis B virus by time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA) and compare the results with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . To evaluate the performance of TRFIA in order to improve the diagnostic value of quantitative detection of HBV markers .Methods329 serum samples were collected and TRFIA was used to detect HBV markers, and the results were compared with those of ELISA .ResultsThe results of the two methods for detection of HBV markers were in good agreement［Hepatitis B surface antigen (HBsAg) was 99.4%, Hepatitis B surface antibody (HBsAb) was 98.8%, Hepatitis B virus E antigen (HBeAg) was 99.1%, Hepatitis B virus E antibody (HBeAb) was 98.2%, Hepatitis B virus core antibody (HBcAb) was 97.6%］. The positive detection rate of TRFIA was higher than that of ELISA (HBsAg: 90 vs. 88, HBsAb: 115 vs. 111, HBeAg: 45 vs. 42, HBeAb: 211 vs. 205, HBcAb: 246 vs. 238, P all ＜ 0.05) . The sensitivity and specificity of TRFIA were better than ELISA (sensitivity: 97.80% vs. 91.21%, specificity: 99.58% vs. 97.89%, P all ＜ 0.05) . TRFIA was better than ELISA in batch and batch coefficient of variation (CV) in batch CV: 3.19% vs. 5.99%, batch CV: 4.68% vs. 7.55%, P all ＜ 0.05 .ConclusionTRFIA as a new biotechnology with great development potential , is more effective than ELISA in detecting HBV markers .

Time-resolved fluorescence immunoassay . Hepatitis B virus markers . enzyme-linked immunosorbent assay

213000 江蘇常州，常州市婦幼保健院

張銘，Email:zmzw0701@163.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2016.04.006

2016-10-20)