程孝中， 許 勇， 葛永斌， 蒲順昌， 燕傲蕾， 張 宇， 徐 娟

(1.亳州師范高等?？茖W校,安徽亳州 236800;2.安徽省醫(yī)學科學研究院,安徽合肥 230061)

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碳源及植物生長調(diào)節(jié)劑對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響

程孝中1， 許 勇2*， 葛永斌1， 蒲順昌1， 燕傲蕾1， 張 宇1， 徐 娟1

(1.亳州師范高等專科學校,安徽亳州 236800;2.安徽省醫(yī)學科學研究院,安徽合肥 230061)

摘要[目的]研究不同碳源和植物生長調(diào)節(jié)劑對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響。[方法]以亳芍根莖為外植體，改變培養(yǎng)基中碳源(蔗糖、果糖、葡糖糖、麥芽糖、可溶性淀粉)和植物生長調(diào)節(jié)劑種類(6-BA、NAA、2,4-D)，考察亳芍愈傷組織增長量和芍藥苷積累量。[結(jié)果]碳源中，對亳芍愈傷組織的增長量以蔗糖最高，葡糖糖最有利于芍藥苷積累；組合使用植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA和2,4-D比單獨使用6-BA更有利于愈傷組織生長和芍藥苷積累，但高濃度的2,4-D抑制愈傷組織生長和芍藥苷積累。[結(jié)論]確定了亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的最佳碳源和植物生長調(diào)節(jié)劑組合，為葡萄糖30 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L。

關(guān)鍵詞亳芍；愈傷組織；碳源；植物生長調(diào)節(jié)劑；芍藥苷

Effects of Carbon Sources and Plant Growth Regulators on Callus Growth and Paeoniflorin Accumulation ofPaeonialactiflora

CHENG Xiao-zhong1,XU Yong2*,GE Yong-bin1et al (1. Bozhou Teachers College, Bozhou, Anhui 236800; 2. Anhui Academy of Medical Sciences, Hefei, Anhui 230061)

Abstract[Objective] To study the influence of different carbon sources and plant growth regulators on callus growth and paeoniflorin accumulation ofPaeonialactiflora.[Method] The callus ofPaeonialactifloraroot was used as materials.The callus increment and paeoniflorin accumulation was studied by manipulation of different carbon sources(sucrose,glucose,fructose,maltose,soluble starch) and plant growth regulators(6-BA,NAA,2,4-D).[Result] Sucrose was best for the increment of callus,but glucose was best for the paeoniflorin accumulation.Compared with 6-BA,combined utilization of 6-BA,NAA and 2,4-D was more conductive to increase the callus growth and paeoniflorin accumulation.Otherwise,high concentration of 2,4-D inhibited the callus growth and paeoniflorin accumulation.[Conclusion] The optimum carbon sources and plant growth regulators for callus growth and paeoniflorin accumulation was glucose 30 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L.

Key wordsPaeonialactiflora; Callus; Carbon sources; Plant growth regulators; Paeoniflorin

亳芍(Paeonialactiflora)即白芍，因產(chǎn)于亳州而得名，為毛茛科多年生草本植物，性微寒，味微苦而酸，有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙的作用，可以用來治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝炎、痛經(jīng)、發(fā)熱等疾病[1]。近年來人們對芍藥的藥用價值研究發(fā)現(xiàn)，其中主要成分芍藥苷(paeoniflorin)能夠通過抑制腎臟中的ICAM-1、IL-1、TNF-α等細胞因子，起到抗炎癥、抗氧化作用[2]。另外，芍藥苷通過調(diào)節(jié)腺苷A1受體減少痛疼，抑制前列腺素E2、白三烯B4來減少炎癥反應(yīng)，促進淋巴細胞增殖和分化來實施免疫保護[1]；在抑制血管發(fā)生[3]、抗過敏等方面均發(fā)揮了重要的作用[4]。但亳芍生長周期較長(3~4年)，加上原產(chǎn)地種植率下降，地道的亳芍產(chǎn)量急劇下降。組織培養(yǎng)技術(shù)既可以縮短生長周期，對藥材成分的含量又可以進行有效的質(zhì)量控制。由于碳源和植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物組織培養(yǎng)的2個重要因素，因此，筆者進行了碳源和植物生長調(diào)節(jié)劑對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響試驗，篩選出亳芍愈傷組織生長和芍藥苷含量較高的碳源以及植物生長調(diào)節(jié)劑，以期為進一步進行組織培養(yǎng)生產(chǎn)芍藥苷奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料亳芍采自亳州師范高等專科學校藥園(3年生)，取植株根、莖等部位為外植體。

1.2儀器與試劑SD25-12DTDN 超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；DIIG-9141A 電熱鼓風干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；GI54DWS 高壓蒸汽滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司)；SW-CJ-2FD 凈化工作臺(AIRTECH)；ZXSD-A1160 培養(yǎng)箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)；E2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)。芍藥苷標準品、植物激素均為阿拉丁產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗方法

1.3.1愈傷組織培養(yǎng)。取亳芍根、莖等外植體，洗潔精漂洗1遍，流動水洗至無泡沫。在超凈工作臺上，用75%酒精消毒1 min，再用無菌水洗滌3遍，0.1%升汞消毒6 min，再用無菌水洗滌3遍，無菌濾紙吸干殘留水分，剪切好的外植體接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。碳源篩選采用1/2MS 培養(yǎng)基，添加不同碳源30 g/L(表1)、6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.2 mg/L 、2,4-D 0.2 mg/L和瓊脂8 g/L，植物生長調(diào)節(jié)劑篩選采用1/2MS 培養(yǎng)基，添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑(表2~3)、蔗糖 30 g/L和瓊脂8 g/L。培養(yǎng)條件為溫度 25 ℃、濕度 60%、光照強度 2 000 lx、光周期 12 h/d。培養(yǎng)30 d后，干燥至恒重，粉碎過60目篩并計算愈傷組織增長量,愈傷組織增長量=收獲量/瓶數(shù)-接種量/瓶數(shù)。

1.3.2芍藥苷提取。稱取愈傷組織干粉1 g置50 mL容量瓶中，加入50%乙醇超聲提取30 min，冷卻后過0.45 μm濾膜，所得濾液冷凍干燥。

1.3.3芍藥苷含量測定。芍藥苷含量測定采用高效液相色譜法，色譜柱為C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈和0.1%磷酸(14∶86)；流速1 mL/min；檢測波長230 nm。以芍藥苷標準品為參考，其回歸方程為A=41 372C+24 462(R2=0.997 5)。

2結(jié)果與分析

2.1碳源對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響碳源是培養(yǎng)基中最基本的營養(yǎng)成分，提供了植物代謝中所需要的物質(zhì)和能量，因而對愈傷組織的生長有顯著影響。利用5種不同碳源進行試驗，結(jié)果表明(表1)，對亳芍愈傷組織增長量以蔗糖最高，可溶性淀粉的增長量最低，僅為蔗糖增長量的56%，果糖、麥芽糖和葡糖糖對亳芍愈傷組織增長量的影響無顯著差異；而對芍藥苷積累的影響中，以葡糖糖作為碳源時，愈傷組織的芍藥苷積累量最高，可溶性淀粉的芍藥苷積累最低，為葡糖糖的54%。

表1不同碳源對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響

Table1EffectsofdifferentcarbonsourcesoncallusgrowthandpaeoniflorinaccumulationofPaeonia lactiflora

碳源Carbonsources增長量Incrementg芍藥苷量Quantityofpaeoniflorinmg/g蔗糖Sucrose0.46±0.05a0.03300±0.00387b果糖Fructose0.37±0.04b0.02980±0.00293b葡糖糖Glucose0.40±0.03ab0.04217±0.00488a麥芽糖Maltose0.33±0.04b0.03083±0.00397b可溶性淀粉Solublestarch0.26±0.03c0.02283±0.00331c

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lower cases in the same column stand for significant differences among treatments (P<0.05)。

2.26-BA和NAA對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響由表2可見，當0.5 mg/L 6-BA與NAA聯(lián)合使用時，亳芍愈傷組織增長量和芍藥苷積累量均高于單獨使用6-BA，其中以0.5 mg/L 6-BA與0.2 mg/L NAA聯(lián)合使用效果最佳，愈傷組織增長量和芍藥苷積累均達最大值，但隨著NAA濃度增大，愈傷組織增長量和芍藥苷積累量出現(xiàn)下降趨勢。

表26-BA和NAA對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響

Table 2Effects of 6-BA and NAA on callus growth and paeoniflorin accumulation ofPaeonialactiflora

植物生長調(diào)節(jié)劑Plantgrowthregulators∥mg/L增長量Increment∥g芍藥苷量Quantityofpaeoniflorin∥mg/g6-BA0.50.32±0.04b0.03417±0.00556b6-BA0.5+NAA0.10.38±0.06ab0.03817±0.00354ab6-BA0.5+NAA0.20.45±0.66a0.04517±0.00542a6-BA0.5+NAA0.30.35±0.04b0.03583±0.00691b

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lower cases in the same column stand for significant differences among treatments (P<0.05)。

2.36-BA、NAA和2,4-D相互作用對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響 在6-BA和NAA基礎(chǔ)上添加2,4-D后，低濃度和高濃度的2,4-D均能影響愈傷組織增長量和芍藥苷積累量，只有適當濃度的2,4-D(0.2 mg/L)可以增加愈傷組織的增長和芍藥苷積累(表3)。但6-BA、NAA和2,4-D聯(lián)合使用比單獨使用6-BA效果好(表2~3)。

表3 6-BA、NAA和2,4-D相互作用對亳芍愈傷組織生長和芍藥苷積累的影響

Table 3Effects of interaction of 2,4-D, NAA and 6-BA on callus growth and paeoniflorin accumulation ofPaeonialactiflora

植物生長調(diào)節(jié)劑Plantgrowthregulators∥mg/L增長量Increment∥g芍藥苷量Quantityofpaeoniflorin∥mg/g6-BA0.5+NAA0.20.45±0.07b0.04517±0.00542b6-BA0.5+NAA0.2+2,4-D0.10.41±0.03b0.04483±0.00605b6-BA0.5+NAA0.2+2,4-D0.20.53±0.04a0.05467±0.00472a6-BA0.5+NAA0.2+2,4-D0.30.40±0.03b0.04117±0.00436b

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lower cases in the same column stand for significant differences among treatments (P<0.05)。

3結(jié)論與討論

該試驗結(jié)果表明,以30 g/L蔗糖作為碳源時亳芍愈傷組織增長量最高，而以30 g/L葡糖糖作為碳源時芍藥苷積累最高，試驗結(jié)果與凌慶枝等[5]的研究結(jié)論一致。植物細胞在培養(yǎng)基中不能自養(yǎng)，需要外界提供碳源進行新陳代謝，而碳源的來源有多種，在組織培養(yǎng)中，以蔗糖、果糖、葡糖糖、麥芽糖等應(yīng)用較多。不同植物組織培養(yǎng)的最適碳源有差異，但大部分植物是以蔗糖作為碳源，如水母雪蓮[6]、甜葉菊[7]、杜仲[8]等。這是因為蔗糖可以提供細胞生長所需要的滲透壓，并作為次生代謝物積累的物質(zhì)來源；而芍藥苷的積累以葡糖糖為最佳，這可能與葡萄糖可以直接被細胞吸收，并直接進入糖酵解途徑有關(guān)。

該試驗發(fā)現(xiàn)，植物生長調(diào)節(jié)劑對亳芍愈傷組織增長量以及芍藥苷累積量均有較大影響。單獨使用6-BA時，亳芍愈傷組織增長量及芍藥苷積累均不及組合使用植物生長調(diào)節(jié)劑，6-BA 與NAA 組合使用時，當NAA濃度達0.2 mg/L時，能夠促進愈傷組織增長量和芍藥苷積累，低濃度與高濃度的NAA均未能顯著促進愈傷組織增長和芍藥苷積累，且愈傷組織增長與芍藥苷增長相關(guān)。這種規(guī)律同樣出現(xiàn)在6-BA、NAA、2,4-D 3種生長調(diào)節(jié)劑組合使用時。

植物組織培養(yǎng)中，生長調(diào)節(jié)劑既可以促進細胞分裂，也可以影響細胞分化，這主要與生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度有關(guān)[9-10]，6-BA主要促進愈傷組織生長，NAA可以促進生根，而2，4-D既可以促進愈傷組織生長，也可以促進生根，將3種生長調(diào)節(jié)劑組合使用時，可以控制亳芍器官發(fā)生模式[11]，但不同植物的組織培養(yǎng)使用的組合是不同的。該試驗篩選出的組合能夠促進亳芍愈傷組織增長的同時，也能顯著地促進芍藥苷積累。但各種激素相互作用的機制尚不清楚，有待進一步研究。

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收稿日期2015-12-28

作者簡介程孝中(1983- )，男，安徽安慶人，講師，在讀博士，從事中草藥組織培養(yǎng)和內(nèi)生菌研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事分子生物學及生物化學方面研究。

基金項目安徽省高校自然科學基金項目(KJ2014A167)；亳州師范高等?？茖W校校級科研項目(BZSZKYXM201304)。

中圖分類號Q 567.23+9;Q 813.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-136-02