陳明亮， 張麗麗，秦路平， 周志疆*

(1.江蘇豐收大地種業(yè)發(fā)展有限公司,江蘇鹽城 224100；2.第二軍醫(yī)大學(xué),上海 200433)

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藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)

陳明亮1， 張麗麗1，秦路平2， 周志疆1*

(1.江蘇豐收大地種業(yè)發(fā)展有限公司,江蘇鹽城 224100；2.第二軍醫(yī)大學(xué),上海 200433)

摘要[目的]建立藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)方法。[方法]以藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)率、誘導(dǎo)時(shí)間、外觀形態(tài)作為評(píng)價(jià)參數(shù)，研究了外植體、激素種類及配比、外源添加物椰乳和活性炭濃度對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響。[結(jié)果]適宜的外植體是藏紅花種球，適宜的激素種類及配比是MS+ KT 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，適宜的椰乳濃度是100 mL/L，活性炭濃度是3 g/L。[結(jié)論]建立的藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)體系穩(wěn)定性好，增殖速度較快，為工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞藏紅花； 愈傷組織 ；植物激素； 椰乳

Callus Induction ofCrocussativusL.

CHEN Ming-liang1,ZHANG Li-li1,QIN Lu-ping2, ZHOU Zhi-jiang1*(1.Jiangsu Fengshou Seed Industry Development Co.,Ltd.,Yancheng,Juangsu 224100; 2.The Second Military Medical University,Shanghai 200433)

Abstract[Objective] To establish a callus induction method forCrocussativusL.[Method] The explant,hormone type and combination,additives (coconut milk and active carbon) concentration were optimized.The appearance,callus induction rate and induction time were taken as the evaluation parameters.[Result] The proper explant wasC.sativusseedball; proper hormone type and combination was MS + 0.5 mg/L KT + 2.0 mg/L NAA.The suitable concentrations of coconut milk and active carbon in culture medium were 100 mL/L and 3 g/L,respectively.[Conclusion] This callus induction system forC.sativushas good stability and rapid multiplication rate,which lays foundation for the industrialized production.

Key wordsCrocussativusL.; Callus; Plant hormones; Coconut milk

藏紅花(CrocussativusL.)，又名番紅花、西紅花，為鳶尾科番紅花屬球根類多年生草本植物，原產(chǎn)西班牙、南歐各國(guó)及伊朗等地[1]，后經(jīng)印度傳入西藏。在《本草綱目》中，以番紅花為其正名，被列入卷十五草部鳶草類[2]。

藏紅花在染料、香料、功能性食品及保健品開發(fā)，婦科用藥及抗癌抗腫瘤制藥方面廣泛應(yīng)用。藏紅花柱頭入藥，其有效成分如藏紅花苷、藏紅花苦苷、藏紅花酸和藏紅花醛，具有明顯的抗癌作用，是新型抗癌藥物的研究熱點(diǎn)。但藏紅花種質(zhì)資源嚴(yán)重缺乏，價(jià)格昂貴，一直被譽(yù)為“植物黃金”[3]。

在傳統(tǒng)栽培條件下，藏紅花無法進(jìn)行有性繁殖，只能通過球莖繁殖，而且栽培過程中球莖退化現(xiàn)象嚴(yán)重[4]。組織培養(yǎng)技術(shù)不但可以快速、大量地生產(chǎn)藏紅花種苗或微型種球，用于快速繁殖，有效地解決藏紅花資源短缺的問題。另外藏紅花組織培養(yǎng)還可以獲得大量的細(xì)胞，從細(xì)胞中直接提取有效活性物質(zhì)，不受環(huán)境的限制。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的研究較多[5-10]，但研究結(jié)果差異較大，所得愈傷組織很不穩(wěn)定，不利于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)。筆者研究藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)條件，旨在為藏紅花組織培養(yǎng)的工廠化生產(chǎn)提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料藏紅花種球由鹽城市近海生物研發(fā)中心提供，幼葉采自種球種植后的新葉。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體消毒。藏紅花種球：洗掉種球表面的泥沙，切除病斑部分，用自來水沖洗1 h，蒸餾水清洗2次；然后在超凈工作臺(tái)中將種球放入75%乙醇中振蕩浸泡30 s，用無菌蒸餾水清洗2次，再放入0.1% HgCl2溶液中振蕩浸泡10 min，用無菌蒸餾水清洗6~8次。

幼葉：藏紅花葉片每天噴施0.05%多菌靈，3 d后摘取幼葉用蒸餾水清洗后，在超凈工作臺(tái)中將幼葉浸泡于75%乙醇中10 s，無菌蒸餾水清洗2次，再將葉片浸泡于0.1% HgCl2溶液中3 min，用無菌蒸餾水清洗6~8次。

1.2.2接種。將消毒后的藏紅花種球切成1 cm3大小，幼葉切成0.5~1.0 cm大小，接種于預(yù)先配制好的培養(yǎng)基上(以MS為基本培養(yǎng)基)，用于愈傷組織的誘導(dǎo)。培養(yǎng)條件：溫度(20±1)℃，暗培養(yǎng)。愈傷組織誘導(dǎo)率=愈傷組織數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表1可知，以藏紅花種球和幼葉為外植體，在MS加植物激素的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但在誘導(dǎo)率上具有顯著性差異(P<0.05)。以種球?yàn)橥庵搀w愈傷組織誘導(dǎo)率高于幼葉，且愈傷組織較為致密，更有利于后期分化出種苗(圖1)。因此在藏紅花組織培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)適宜的外植體是種球，但在培養(yǎng)時(shí)間上幼葉更早誘導(dǎo)出愈傷組織。

2.2不同激素種類及配比對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響以藏紅花種球?yàn)橥庵搀w，考察了3種植物激素6-BA、KT、NAA及不同濃度配比對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)激素配比KT 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高達(dá)68%，且愈傷組織淺黃色,較致密,表面光滑，繼代后保持旺盛生長(zhǎng)；在愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間上該激素配比愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間為7~10 d，少于其他激素配比時(shí)間。KT和NAA的組合在誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)時(shí)間上整體優(yōu)于6-BA和NAA的組合，因此前者的組合更適宜藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)，即最佳誘導(dǎo)激素配比是MS+ KT 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L。

表1　不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織情況

注：A.種球，B.幼葉。Note:A.Seedball; B.Young leaves圖1　不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況Fig.1　Situation of callus induction of different explants

2.3不同添加物對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3.1不同濃度椰乳對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。以藏紅花種球?yàn)橥庵搀w，在MS加激素的培養(yǎng)基中添加椰乳濃度分別為0、50、100、150 mL/L，每組接種外植體100個(gè)。由圖2可知，愈傷組織的誘導(dǎo)率為100 mL/L>50 mL/L>150 mL/L>0。在椰乳濃度10 mL/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到77%，而不添加椰乳的愈傷組織誘導(dǎo)率僅為47%，說明椰乳對(duì)藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)起到明顯的促進(jìn)作用。

觀察發(fā)現(xiàn)，添加椰乳的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織淺黃色，較致密，比不添加椰乳的愈傷組織生長(zhǎng)更旺盛，繼代后也能旺盛生長(zhǎng)；而且在誘導(dǎo)時(shí)間上添加椰乳的時(shí)間也較短。

2.3.2不同濃度活性炭對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。以藏紅花種球?yàn)橥庵搀w，在MS加激素的培養(yǎng)基中添加活性炭的濃度分別為0、1、3、5 g/L，每組接種外植體100個(gè)。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中活性炭的濃度為3 g/L時(shí)藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)率最高達(dá)75%，其次是5 g/L，不添加活性炭的誘導(dǎo)率最低。

表2　不同植物激素種類及配比誘導(dǎo)愈傷組織情況

圖2　不同濃度椰乳對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.2　Effects of coconut milk concentration on callus induction rate of Crocus sativus L.

圖3　不同濃度活性炭對(duì)藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的影響Fig.3　Effects of activated carbon concentration on callus induction rate of Crocus sativus L.

觀察發(fā)現(xiàn)，添加活性炭能有效地抑制褐化現(xiàn)象，藏紅花愈傷組織生長(zhǎng)旺盛；而無活性炭的培養(yǎng)基上藏紅花愈傷組織出現(xiàn)明顯的褐化現(xiàn)象甚至死亡(圖4)。

注：A.活性炭濃度為3 g/L；B.0.Note:A.Concentration of activated carbon was 3 g/L; B.Concentration of activated carbon was 0.圖4　不同活性炭濃度下愈傷組織誘導(dǎo)情況Fig.4　Callus induction under different concentrations of activated carbon

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)對(duì)影響藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)的3個(gè)主要因素進(jìn)行研究，結(jié)果表明，最適宜的外植體是藏紅花種球，因?yàn)榉N球上分布了多個(gè)芽點(diǎn)，生長(zhǎng)活性最高。袁麗紅等[6]、王壽芹等[7]、汪洋等[8]均使用藏紅花球莖為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，取得了較好的效果。該研究得出的最適宜的培養(yǎng)基是MS+ KT 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L，這與一些報(bào)道有一定的差異，如張潔等[9]誘導(dǎo)愈傷組織使用的培養(yǎng)基是MS與6-BA和2,4-D的組合，陳書安等[10]使用的是MS與6-BA和NAA的組合，說明藏紅花愈傷組織的誘導(dǎo)激素組合并不是唯一的，擴(kuò)展到整個(gè)組織培養(yǎng)也是如此。最適宜的培養(yǎng)基外源添加物椰乳濃度是100 mL/L，活性炭濃度是3 g/L，椰乳可能在愈傷組織誘導(dǎo)中增加天然組分營(yíng)養(yǎng)，與合成成分相比具有保護(hù)愈傷組織的作用，王壽芹等[7]也使用了椰乳。在藏紅花組織培養(yǎng)中，外植體褐化是最常見的問題之一，如果褐化嚴(yán)重會(huì)造成愈傷組織的部分死亡，所以如何抑制褐化是藏紅花組織培養(yǎng)中的一個(gè)關(guān)鍵問題?；钚蕴烤哂形接泻ξ镔|(zhì)的能力，張潔等[9]、陳書安等[10]均使用活性炭來抑制或減緩褐化，取得了較好的效果。該試驗(yàn)獲得了較為穩(wěn)定的藏紅花愈傷組織誘導(dǎo)方法，為工廠化快速繁殖藏紅花或提取有效活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期2015-12-28

作者簡(jiǎn)介陳明亮(1984- )，男，安徽六安人，從事植物組織培養(yǎng)研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事遺傳育種研究。

基金項(xiàng)目江蘇省科學(xué)技術(shù)廳2014年度蘇北科技專項(xiàng)資金項(xiàng)目(BN2014057)。

中圖分類號(hào)S 503.53;R 282.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-123-03