王衛(wèi)遠(yuǎn)　李俊芳　聶尚燕　劉曦　趙陽

(邯鄲市中心醫(yī)院，1.免疫科;2.感染科,河北 邯鄲 056001)

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非諾貝特通過上調(diào)PPARα抑制LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞TLR4表達(dá)的實驗研究

王衛(wèi)遠(yuǎn)1李俊芳1聶尚燕2劉曦1趙陽1

(邯鄲市中心醫(yī)院，1.免疫科;2.感染科,河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的探討PPARα激動劑非諾貝特對LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)控作用，以及潛在的分子機制。方法將THP-1細(xì)胞分為4組即對照組(Control組)、LPS組、LPS+非諾貝特 (LPS+Feno組)和LPS+非諾貝特+PPARα拮抗劑GW6471組(LPS+Feno+GW組)。在干預(yù)4小時后使用qPCR法和western blotting法對THP-1細(xì)胞TLR4和PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果與Control組相比較，在LPS干預(yù)4小時后 THP-1細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯增加，PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯下降，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；但LPS組較LPS+Feno組TLR4表達(dá)的增加水平和PPARα表達(dá)的下降水平更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS刺激狀態(tài)下非諾貝特對于TLR4和PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)的改善作用可被PPARα拮抗劑GW6471顯著抑制，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論在LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下，非諾貝特可以通過上調(diào)PPARα的轉(zhuǎn)錄合成抑制THP-1細(xì)胞TLR4表達(dá)，最終減輕炎癥水平。研究表明非諾貝特具有潛在的炎癥調(diào)控作用，為非諾貝特等PPARα激動劑應(yīng)用于炎癥性疾病的臨床治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】非諾貝特； THP-1細(xì)胞； Toll樣受體4； 氧化物酶體增殖激活受體α； GW6471

Fenofibrate suppresses LPS-induced TLR4 expression through up-regulation of PPARα in THP-1 cellsWANG Weiyuan1, LI Junfang1, NIE Shangyan2,etal

(1.DepartmentofRheumatology,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China;

2.DepartmentofInfectiousDisease,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the value of fenofibrate in LPS-enhanced TLR4 expression in THP-1 cells and its underlying molecular mechanism. MethodsTHP-1 cells were divided into ate+PPARα inhibitor GW6471 group (LPS+Feno+GW group). After 4 hours interventions, qPCR and western blotting were used to measure the mRNA and protein expression of TLR4 and PPARα in THP-1 cells. ResultsAfter 4 hours LPS stimulation, the mRNA and protein expression of TLR4 was remarkably enhanced, and the mRNA and protein expression of PPARα was significantly reduced. Then, we found that LPS-enhanced expression of TLR4 and LPS-reduced PPARα were noticeably improved by fenofibrate in THP-1 cells. Furthermore, our data also figured out that these effects of fenofibrate were substantially blocked by PPARα inhibitor GW6471. ConclusionFenofibrate inhibited LPS-enhanced TLR4 expression probably via up-regulation of PPARα in THP-1 cells.

【Key words】Fenofibrate; THP-1 cells; Toll-like receptor 4; Peroxisome proliferators-activated receptor α; GW6471

研究發(fā)現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞的異常的過度活化在強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展的過程中扮演著重要的角色[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)炎癥狀態(tài)下誘導(dǎo)的TLR4的過度表達(dá)與巨噬細(xì)胞過度活化有密切的聯(lián)系。同時，有大量研究證實氧化物酶體增殖激活受體α (Peroxisome proliferators-activated receptor α, PPARα)對于炎癥狀態(tài)誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)具有重要的調(diào)控作用[6, 7]。非諾貝特(fenofibrate)作為PPARα激動劑目前主要用于高脂血癥的臨床治療[8, 9]。近期多個研究表明非諾貝特可以通過促進(jìn)PPARα的表達(dá)有效調(diào)控過度的炎癥反應(yīng)[10, 11]。本研究主要觀察PPARα激動劑非諾貝特對LPS誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)控作用，以及潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料第一鏈cDNA合成試劑盒和PCR試劑盒購自日本Takara公司；鼠抗人TLR 4抗體、鼠抗人PPARα抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；非諾貝特和GW6471均購買于美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購買于美國Gibco公司；小牛血清購買于杭州四季清公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞常規(guī)接種在含15% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2細(xì)胞活性檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL約含5×103個細(xì)胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細(xì)胞16h至24h，使細(xì)胞同步化。將THP-1細(xì)胞分為4組即對照組(Control組)、LPS組、LPS+非諾貝特 (LPS+Feno組)和LPS+非諾貝特+PPARα拮抗劑GW6471組(LPS+Feno+GW組)。其中Control組細(xì)胞加入PBS；LPS組和LPS+Feno組加入終濃度為1μg/ml 的LPS溶液進(jìn)行干預(yù)；LPS+Feno組加入終濃度為50μM的非諾貝特進(jìn)行干預(yù)，LPS+Feno+GW組加入終濃度為50μM的GW6471進(jìn)行干預(yù)[12]。

1.2.3細(xì)胞MCP-1 和HMGB1 mRNA表達(dá)檢測qPCR法檢測THP-1細(xì)胞TLR4和PPARα mRNA表達(dá)水平，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞的總RNA并合成cDNA。然后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl，使用β-actin作為內(nèi)參照。引物序列如下：TLR4正義5′-TGG ATA CGT TTC CTT ATA AG-3′，反義5′-GAA ATG GAG GCA CCC CTTC-3′；PPARα正義5′-GGCG AATATGC TCAATGGT-3′，反義5′-GGCCA CGAATTTTG AGGTTA-3′；β-actin正義：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反義：5′-GCTCAGGAG GAGCAAT GATCT-3′。使用2-ΔΔCt法對MCP-1和HMGB1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定，ΔΔCt = (Ct,目標(biāo) -Ct,β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標(biāo)-Ct, β-actin)對照組[13]。

1.2.4Western blotting法檢測細(xì)胞中MCP-1 和HMGB1蛋白表達(dá)水平干預(yù)4h后，按照試劑盒操作要求，首先提取THP-1細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體TLR4 (1∶1000)、PPARα (1∶1000)和β-actin (1∶2000)，4°C孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 11.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)干預(yù)4h后，對THP-1細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平使用qPCR法和western blotting法進(jìn)行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)后TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯增加，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+Feno組TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)升高更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS刺激狀態(tài)下非諾貝特對于TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)的改善作用可被PPARα拮抗劑GW6471顯著抑制，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表1和圖1。

表1　THP-1細(xì)胞PPARα和TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

注：與Control組相比較①P<0.05；與LPS組相比較②P<0.05；與LPS+Feno組相比較③P<0.05。

2.2PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)干預(yù)4h后，對THP-1細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)水平使用qPCR法和western blotting法進(jìn)行檢測。與Control組相比較，在LPS干預(yù)后PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯降低，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。但LPS組較LPS+Feno組PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)降低更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS刺激狀態(tài)下非諾貝特對于PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)的改善作用可被PPARα拮抗劑GW6471顯著抑制，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表1和圖2。

圖1THP-1細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的western blotting結(jié)果

Figure 1Western blotting result of the protein expression of TLR4 in THP-1 cells

圖2THP-1細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)的western blotting結(jié)果

Figure 2Western blotting result of the protein expression of PPARα in THP-1 cells

3討論

持續(xù)而過度的單核巨噬細(xì)胞活化在強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)等自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[14,15]。一方面過度活化的巨噬細(xì)胞可以通過釋放大量的如TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥介質(zhì)、蛋白水解酶以及氧化應(yīng)激產(chǎn)物直接導(dǎo)致靶器官和組織的損傷；另一方面還可通過合成和釋放MCP-1等炎癥分子誘導(dǎo)和趨化更多的炎癥細(xì)胞激活和浸潤，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)[16,17]。試驗研究表明單核巨噬細(xì)胞表面存在多種受體分子。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4, TLR4)屬于模式識別受體(pattern recognition receptors, PRR)，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞表面[17,18]。TLR4可通過與LPS和CpG-DNA等病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)結(jié)合發(fā)揮生理學(xué)作用[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)TLR4-LPS結(jié)合后會誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞以及組織細(xì)胞合成和釋放大量的炎癥介質(zhì)和分子，最終導(dǎo)致炎癥瀑布樣反應(yīng)(inflammatory cascade reaction)的出現(xiàn)[17, 18]。目前認(rèn)為TLR4的過度表達(dá)與RA和SLE等多種自身免疫性疾病時單核巨噬細(xì)胞的過度活化密切相關(guān)[19,20]。Kirchner M等研究發(fā)現(xiàn)幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis)和SLE患者外周血CD14+單核細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)水平較對照組顯著增加[19]。錢雷等研究發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下RA患者早期外周血單核細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)水平較健康對照組患者增加更加明顯[20]。同時，大量研究還顯示TLR4的基因多態(tài)性與RA和SLE等疾病的發(fā)生亦有密切的聯(lián)系[21]。Dhaouadi T等的研究發(fā)現(xiàn)TLR4的基因多態(tài)性與RA和SLE的發(fā)生存在密切聯(lián)系[21]。有研究表明阻斷和下調(diào)單核巨噬細(xì)胞表面的TLR4有助于抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[22]。Yang Y等的研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞IL-6、NO和TNF-α等炎癥分子的釋放和表達(dá)，并認(rèn)為該機制與下調(diào)TLR4的表達(dá)密切相關(guān)[22]。

非諾貝特作為人工合成的PPARα激動劑目前主要用于高脂血癥的臨床治療[8-10]。目前研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)家族主要包括PPARα、PPAR/和PPAR三種亞型，其均為配體誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄受體[8-10]。當(dāng)PPARs被對應(yīng)的配體結(jié)合后，PPAR通過與PPAR反應(yīng)調(diào)節(jié)元件(PPAR-responsive regulatory elements, PPREs)和視黃醇類X受體(retinoid X receptor, RXR)相結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生理學(xué)作用[8-10]。目前多個研究發(fā)現(xiàn)PPARα在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中扮演著重要的角色[23, 24]。Ann SJ等研究發(fā)現(xiàn)PPARα激動劑非諾貝特可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞CXCL2、TNF-α和IL-6等多種炎癥分子的合成和釋放，并認(rèn)為該機制與抑制TLR4表達(dá)密切相關(guān)[23]。Shen W等的實驗證實在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎動物模型中非諾貝特可以通過上調(diào)PPARα抑制TLR4的表達(dá)，并有效改善病變組織的炎癥反應(yīng)水平[24]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，在LPS干預(yù)4小時后人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯增加，PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯下降，(P均<0.05)；但LPS組較LPS+Feno組TLR4表達(dá)的增加水平和PPARα表達(dá)的下降水平更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。同時，在LPS刺激狀態(tài)下非諾貝特對于TLR4和PPARα mRNA和蛋白的表達(dá)的改善作用可被PPARα拮抗劑GW6471顯著抑制，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果表明在THP-1細(xì)胞中非諾貝特可以通過促進(jìn)PPARα的合成抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4的表達(dá)。

4結(jié)論

本研究表明，在LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下，非諾貝特可以通過上調(diào)PPARα的轉(zhuǎn)錄合成抑制THP-1細(xì)胞TLR4表達(dá)，最終減輕炎癥水平。提示非諾貝特具有潛在的炎癥調(diào)控作用，為非諾貝特等PPARα激動劑應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的臨床治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]王云, 王禮文. 免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的致病機制研究進(jìn)展[J]. 中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 22(04): 370-373.

[2]吳振彪, 盧寧, 王彥宏, 等. GM-CSF對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者單核細(xì)胞合成MMP的影響[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué), 2005, 25(05): 394-397.

[3]王吉波, 謝榮愛, 李華, 等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑魏思?xì)胞及中性粒細(xì)胞CD44表達(dá)及其臨床意義[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2010, 14(07): 501-502.

[4]Liu Y, Yin H, Zhao M,etal. TLR2 and TLR4 in autoimmune diseases: a comprehensive review [J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2014, 47(2): 136-147.

[5]Yang ZX, Liang Y, Zhu Y,etal. Increased expression of Toll-like receptor 4 in peripheral blood leucocytes and serum levels of some cytokines in patients with ankylosing spondylitis [J]. Clin Exp Immunol, 2007, 149(1):48-55.

[6]Mao AP, Shen J, Zuo Z. Expression and regulation of long noncoding RNAs in TLR4 signaling in mouse macrophages [J]. BMC Genomics, 2015, 16:45.

[7]張偉義, 朱濤. 脂多糖LPS對糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞RBD-2表達(dá)的影響[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2011, 23(09): 1629-1633.

[8]陳加飛, 王全華, 吳芹, 等. PPAR-α參與血管緊張素Ⅳ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2011, 31(10): 1094-1098.

[9]Harivenkatesh N, David DC, Haribalaji N,etal. Efficacy and safety of alternate day therapy with atorvastatin and fenofibrate combination in mixed dyslipidemia: a randomized controlled trial [J]. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2014, 19(3): 296-303.

[10] Yang FJ, He YH, Zhou JH. Fenofibrate pre-treatment suppressed inflammation by activating phosphoinositide 3 kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling in renal ischemia-reperfusion injury [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2015, 35(1): 58-63.

[11] Osada M, Sakai T, Kuroyanagi K,etal. Treatment of experimental autoimmune uveoretinitis with peroxisome proliferator-activated receptor α agonist fenofibrate [J]. Mol Vis, 2014, 20: 1518-1526.

[12] Dana N, Javanmard SH, Fazilati M,etal. A comparison of peroxisome proliferator-activated receptor-α agonist and antagonist on human umbilical vein endothelial cells angiogenesis [J]. Adv Biomed Res, 2013, 2:54.

[13] 尹鵬, 胡君, 儲著凌, 等. 替米沙坦通過上調(diào)PPAR-γ促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TIMP-1表達(dá)的實驗研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2014, 26(02): 160-162.

[14] 謝長好, 王元元, 李志軍, 等. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD14+單核細(xì)胞表達(dá)PD-L1的分析和意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2012, 28(04): 429-432.

[15] 尤海燕, 芮金兵, 焦志軍, 等. 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞亞群測定及意義[J]. 江蘇醫(yī)藥, 2010, 36(13): 1489-1491.

[16] 徐劍鋮, 毛寶齡, 胡明冬, 等. 急性呼吸窘迫綜合征患者外周血單核細(xì)胞mCD14的表達(dá)及意義[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2006, 18(01): 10-11.

[17] Tao Zhu, Dao-xin Wang, Wei Zhang,etal. Andrographolide Protects Against LPS-induced Acute Lung Injury by Inactivation of NF-κB [J]. PLOS ONE, 2013, 8(2): e56407.

[18] Li JY, Liu Y, Gao XX,etal. TLR2 and TLR4 signaling pathways are required for recombinant Brucella abortus BCSP31-induced cytokine production, functional upregulation of mouse macrophages, and the Th1 immune response in vivo and in vitro [J]. Cell Mol Immunol, 2014, 11(5):477-494.

[19] Kirchner M, Sonnenschein A, Schoofs S,etal. Surface expression and genotypes of Toll-like receptors 2 and 4 in patients with juvenile idiopathic arthritis and systemic lupus erythematosus [J]. Pediatr Rheumatol Online J, 2013, 11(1):9.

[20] 錢雷, 汪曉鶯, 呂麗君, 等. 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者早期外周血單個核細(xì)胞Toll樣受體2、4表達(dá)及意義[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2012, 27(08):659-662.

[21] Dhaouadi T, Sfar I, Haouami Y,etal. Polymorphisms of Toll-like receptor-4 and CD14 in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis [J]. Biomark Res, 2013, 1(1):20.

[22] Yang Y, Li S, Yang Q,etal. Resveratrol reduces the proinflammatory effects and lipopolysaccharide- induced expression of HMGB1 and TLR4 in RAW264.7 cells [J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 33(5):1283-1292.

[23] Ann SJ, Chung JH, Park BH,etal. PPARα agonists inhibit inflammatory activation of macrophages through upregulation of β-defensin 1 [J]. Atherosclerosis, 2015, 240(2):389-397.

[24] Shen W, Gao Y, Lu B,etal. Negatively regulating TLR4/NF-κB signaling via PPARα in endotoxin-induced uveitis [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1842(7):1109-1120.

(收稿日期：2015-05-25； 編輯： 陳舟貴)

【中圖分類號】R 329.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.008