張明輝，李　菲，張　瑋，吳　芹，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

金釵石斛總生物堿對(duì)Aβ25-35所致大鼠海馬組織Aβ含量的影響

張明輝，李菲，張瑋，吳芹，石京山

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察金釵石斛總生物堿(Dendrobium nobil Lindl. Alkaloids, DNLA)對(duì)β-淀粉樣蛋白(Aβ25-35)誘導(dǎo)的大鼠癡呆模型海馬組織Aβ含量的影響。方法 雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、DNLA低劑量(40 mg/kg/d)及高劑量組(80 mg/kg/d)。預(yù)給藥7 d后，雙側(cè)海馬注射 Aβ25-35(1 μg/μL, 5 μL)，假手術(shù)組注射同體積生理鹽水，術(shù)后繼續(xù)灌胃14 d，Morris水迷宮檢查大鼠空間學(xué)習(xí)成績， Western blot法檢測海馬組織Aβ1-42含量，β淀粉樣前體蛋白(APP)和β淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1(BACE1)的蛋白表達(dá)。結(jié)果 雙側(cè)海馬注射Aβ25-35后，模型組大鼠空間學(xué)習(xí)成績明顯比假手術(shù)組差，給予DNLA后可改善大鼠空間學(xué)習(xí)成績；模型組大鼠海馬Aβ1-42、APP和BACE1蛋白量均明顯高于假手術(shù)組；與模型組比較，DNLA給藥可明顯減少海馬組織Aβ1-42的含量，降低APP和BACE1蛋白在海馬組織的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 DNLA具有改善Aβ25-35所致大鼠癡呆模型的作用，可能與減少海馬組織Aβ1-42產(chǎn)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]金釵石斛總生物堿；β-淀粉樣蛋白；β淀粉樣前體蛋白；β淀粉樣蛋白前體蛋白裂解酶1；大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理學(xué)特征為細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)沉積、細(xì)胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化等[1]。減少AD患者腦中Aβ含量一直是AD治療學(xué)的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

我國名貴中藥材金釵石斛(DendrobiumnobilLindl.)具有“壯筋骨，補(bǔ)腎益力”等功效，其主要化學(xué)成分包括生物堿、多糖、酚類、揮發(fā)油等[2-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛總生物堿(DendrobiumnobilLindl. Alkaloids, DNLA)具有降低AD模型大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白異常磷酸化的作用[4]，然而是否能夠降低AD腦中Aβ的含量仍不清楚，故本研究擬采用Aβ25-35誘導(dǎo)AD大鼠模型，觀察DNLA對(duì)該模型大鼠空間學(xué)習(xí)的作用及腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Sprague-Dawley (SD)大鼠，雄性，體重250~300 g購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005]。

1.2主要試劑及儀器設(shè)備金釵石斛總生物堿采用醇提毛細(xì)管氣象色譜法分析，根據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)離子色譜峰檢測生物堿的百分比，總生物堿純度71.2%，其中主要為石斛堿(90.7%)，石斛次堿次之。

Aβ25-35：美國Sigma公司；APP抗體：美國Abcam公司；Aβ1-42、BACE1、β-actin抗體：life sciences公司；BCA蛋白含量測定試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；ECL發(fā)光劑：江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；大鼠腦立體定位儀：深圳瑞沃德生命科技有限公司；全自動(dòng)凝膠圖像分析儀：美國BIO-RAD公司。

1.3動(dòng)物分組及處理SD大鼠40只隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組、模型組、DNLA低劑量組和DNLA高劑量組。假手術(shù)組及模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg/d、DNLA低、高劑量治療組分別灌胃DNLA(40、80 mg/kg/d)，預(yù)給藥1周后制模。采用7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀上，常規(guī)皮膚消毒切開頭部皮膚，海馬進(jìn)針坐標(biāo)為：前囟后3.5 mm，中線旁2.0 mm，硬腦膜下3.5 mm(根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定)。定位后用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器垂直進(jìn)針，雙側(cè)海馬緩慢注入5 μL Aβ25-35(1 μg/μL，無菌生理鹽水配制，37 ℃孵育7 d使成聚集態(tài))，留針5 min，緩慢退出注射器后縫合皮膚切口，假手術(shù)組注入等體積無菌生理鹽水，制模后繼續(xù)給藥2周。

1.4Morris水迷宮檢測大鼠空間學(xué)習(xí)能力給藥結(jié)束前4 d，行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)由水池、攝像頭和電腦3部分組成，水池直徑120 cm，水深為平臺(tái)上2 cm。固定水下平臺(tái)的位置，記錄大鼠從不同入水點(diǎn)至找到平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)，以比較各組大鼠空間學(xué)習(xí)的能力，每天4次，連續(xù)4 d。

1.5Western blot法檢測蛋白含量行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠麻醉后斷頭于冰上迅速分離海馬組織，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度?？偟鞍捉?jīng)PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，孵育Aβ1-42、APP、BDNF抗體，ECL發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

2結(jié)果

2.1DNLA對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響各組大鼠的學(xué)習(xí)成績隨著訓(xùn)練天數(shù)逐漸變好，訓(xùn)練至第3~4天各組數(shù)據(jù)出現(xiàn)差異，模型組大鼠逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組，而給予DNLA后可縮短逃避潛伏期(P<0.05,見圖1)。

。圖1　金釵石斛總生物堿對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)的影響

2.2DNLA對(duì)大鼠海馬組織Aβ1-42含量的影響雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)Aβ25-352周后大鼠海馬組織內(nèi)Aβ1-42的含量顯著增加(P<0.05)。給予DNLA 3周可明顯降低模型大鼠海馬組織內(nèi)Aβ1-42的含量(P<0.05，見圖2)。

2.3DNLA對(duì)大鼠海馬組織APP和BACE1蛋白表達(dá)的影響為分析DNLA降低模型大鼠海馬組織Aβ含量的機(jī)制，本研究觀察了淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)及與Aβ產(chǎn)生密切相關(guān)的酶BACE1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，模型大鼠海馬組織內(nèi)APP和BACE1蛋白表達(dá)水平均高于假手術(shù)組(P<0.05)，而給予DNLA后均可降低其蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，提示DNLA可通過減少Aβ的產(chǎn)生從而降低海馬組織中Aβ1-42的含量(見圖3)。

±s,n=9; *:P<0.05 vs Sham; #: P<0.05 vs Model?！　D2　金釵石斛總生物堿對(duì)大鼠海馬組織Aβ1-42含量的影響

±s, n=9; *:P<0.05 vs Sham; #: P<0.05 vs Model。圖3　金釵石斛總生物堿對(duì)大鼠海馬組織APP和BACE1蛋白表達(dá)的影響

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35聚集可激活膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至死亡[5-6]。采用海馬內(nèi)注射聚集態(tài)Aβ25-35，誘發(fā)腦內(nèi)炎癥[7]及神經(jīng)細(xì)胞損傷[8]模擬AD的動(dòng)物模型已廣泛用于AD的研究。在AD病理情況下，APP主要經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切產(chǎn)生39-43個(gè)氨基酸的Aβ片段[9-10]，其中Aβ1-42聚集性最強(qiáng)，最具神經(jīng)細(xì)胞毒性。Aβ1-42聚集與AD 患者腦中神經(jīng)元的變性密切相關(guān)，因此抑制Aβ1-42產(chǎn)生與聚集可防止AD的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠雙側(cè)海馬注射聚集態(tài)的Aβ25-35后2周，大鼠空間學(xué)習(xí)能力下降，同時(shí)海馬組織中Aβ1-42和APP水平明顯高于對(duì)照組，給予DNLA后，明顯改善模型大鼠的空間學(xué)習(xí)成績，并降低模型大鼠海馬Aβ1-42和APP的蛋白水平。

β-分泌酶是Aβ產(chǎn)生的關(guān)鍵限速酶，體內(nèi)主要的β分泌酶是β淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme, BACE1)。其活性的高低對(duì)Aβ的產(chǎn)生有重要作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在過度表達(dá)BACE1的APP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中，Aβ的產(chǎn)生顯著增多[14]；而在敲除BACE1基因的動(dòng)物模型中Aβ幾乎完全消失[15]。通過抑制BACE1以降低腦內(nèi)Aβ水平，被認(rèn)為是防治AD的一個(gè)有效靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠海馬組織內(nèi)的BACE1蛋白水平明顯高于假手術(shù)組，各DNLA給藥組大鼠海馬內(nèi)BACE1的蛋白表達(dá)量均顯著低于模型組，提示DNLA具有抑制BACE1蛋白高表達(dá)的作用。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)DNLA能減輕AD的兩大特征性病理變化：減輕AD樣炎癥模型大鼠海馬tau蛋白磷酸化、抑制海馬周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]；本次結(jié)果提示DNLA改善Aβ25-35誘導(dǎo)的大鼠空間學(xué)習(xí)能力，減少模型大鼠海馬組織Aβ1-42的含量，揭示DNLA極有可能是防治AD的中藥有效成分，為深入研究DNLA抗AD提供了基礎(chǔ)。

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[收稿2015-11-23;修回2015-12-29]

Effect ofDendrobiumnobilLindl. Alkaloids on the product of Aβ in hippocampus of rats induced by Aβ25-35

ZhangMinghui，LiFei，ZhangWei，WuQin，ShiJingshan

(Department of Pharmacology, Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To observe the effect of Dendrobium nobil Lindl. Alkaloids (DNLA) on the production of β-amyloid (Aβ1-42) in hippocampus of rats induced by Aβ25-35. Methods Forty Sprague-Dawley rats were randomed into four groups: sham, model, DNLA 40 mg/kg/d and 80 mg/kg/d groups. Rats were orally pre-treated with different doses of DNLA for 1 week, and then model rats were injected 5 μl Aβ25-35(1 μg/μl) into the lateral hippocampus, sham rats were injected equal volume of normal saline instead of Aβ. After operation rats were given DNLA or distill water for another 2 weeks. Morris water maze was used to test the spatial learning performance of rats; the content of Aβ1-42and the protein expression of β-amyloid precursor protein (APP) and β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1 (BACE1) in hippocampi were assayed by western blot. Results After injecting Aβ25-35into hippocampus, model rats decreased the spatial learning capability compared with sham rats, rats treated with DNLA significantly improved the performance. The content of Aβ1-42and the protein expression of APP and BACE1 in hippocampus of model rats were significantly increased. However, the content of Aβ1-42and the protein expression of APP and BACE1 were reduced in the hippocampi of DNLA-treated rats. Conclusion DNLA could ameliorate the spatial learning performance of Aβ25-35induced AD rat model, and this effect may be related to decreases in generation of Aβ1-42.

[Key words]Dendrobium nobil Lindl. Alkaloids; β-amyloid; β-amyloid precursor protein; β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1; rats

[中圖法分類號(hào)]R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)01-0018-04

[通信作者]石京山，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：30660208)；貴州省科技基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合JZ字[2014]2016)；貴州省教育廳自科項(xiàng)目(NO:黔教科2010043)；遵義醫(yī)學(xué)院院招標(biāo)課題基金項(xiàng)目(NO: F-612)。