余　蘭，王　毅

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 分析化學(xué)教研室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

道真洛龍黨參多糖對(duì)小鼠免疫活性的影響

余蘭，王毅

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 分析化學(xué)教研室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 探討從遵義道真洛龍黨參中提取的黨參多糖對(duì)小鼠免疫活性的影響。方法 采用水溶劑煎煮提取、乙醇沉淀及Sevage法去蛋白制備道真洛龍黨參多糖(COP-1、COP-2、COP-3)，環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑進(jìn)行腹腔注射，建立免疫功能低下動(dòng)物模型，灌胃道真洛龍黨參多糖，測(cè)定小鼠碳粒廓清速率、胸腺、脾臟指數(shù)。昆明種雄性小鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組、道真洛龍黨參多糖COP-1、COP-2、COP-3組共6組，每組12只，環(huán)磷酰胺造模，多糖灌胃，7 d后測(cè)定小鼠胸腺及脾臟指數(shù)。結(jié)果 模型組中小鼠脾臟和胸腺指數(shù)較正常對(duì)照組降低(P<0.01)，陽(yáng)性藥組、道真洛龍黨參多糖COP-1、COP-2、COP-3組的小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均較高于模型組(P<0.01)。結(jié)論 道真洛龍黨參多糖可減輕環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能抑制，不同分子量黨參多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠遺傳物改變具有拮抗作用。

[關(guān)鍵詞]道真洛龍黨參多糖；免疫；小鼠；碳粒廓清速率；脾臟；胸腺

黨參是桔?？浦参稂h參，包含素花黨參與川黨參的干燥根。其性味甘平、無(wú)毒，是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益藥，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之功效[1]，主要產(chǎn)于貴州、四川、山西等地。黨參的成分復(fù)雜，主要含有多糖、黨參皂苷、生物堿類(lèi)、甾體類(lèi)、萜類(lèi)等成分[2]。黨參被用來(lái)治療脾肺氣虛，氣血不足，心悸氣短，內(nèi)熱消渴等癥狀的疾病，其中黨參多糖具有增強(qiáng)小鼠體力和非特異性免疫、抗疲勞、抗缺氧、抗應(yīng)激和抗衰老等功能，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用[3]。

“洛龍黨參”產(chǎn)于貴州省遵義市道真縣洛龍鎮(zhèn)，是川黨參(CodonopsistangshenOliv.)的生態(tài)型變種，是貴州省著名的特有藥材，質(zhì)量?jī)?yōu)良[4]。目前，有關(guān)道真洛龍黨參多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究還較少，龔其海等[5]報(bào)道了道真洛龍黨參及其移栽到其他地區(qū)同品種黨參所含多糖均可減輕環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)所致小鼠免疫功能抑制，并且異地移栽后的洛龍黨參所含多糖具有免疫功能增強(qiáng)的作用，然而未對(duì)不同劑量和分子量的黨參進(jìn)行系統(tǒng)研究。為此，本研究以道真洛龍黨參為藥材，提取分離粗多糖后對(duì)其組成進(jìn)行純化分析，獲得不同分子量的洛龍黨參多糖。研究觀察不同分子量的道真洛龍黨參多糖對(duì)環(huán)磷酰胺藥物所引起的小鼠免疫器官損傷的影響，以期為道真洛龍黨參資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠共72只，雌雄各半，每只(20±2)g，SPF級(jí)，由中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(渝)2012-0006。

1.2主要藥品及試劑無(wú)血清1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，環(huán)磷酰胺(CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，黃芪顆粒(貴州漢方制藥有限公司)，印度墨汁(南京都萊生物技術(shù)有限公司)，道真洛龍黨參(購(gòu)于遵義市道真縣洛龍鎮(zhèn)黨參種植戶，并經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為真品)。

1.3主要儀器MSA125P-100DU型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]，T9型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，R-205型旋蒸蒸發(fā)儀(瑞典Buch公司)，Modulyod 0230型冷凍干燥機(jī)(美國(guó)賽默飛科技有限公司)。

1.4道真洛龍黨參多糖的提取與純化將從道真苗族仡佬族自治縣洛龍鄉(xiāng)采集的新鮮黨參根曬干、洗凈、切片、烘干，制成黨參飲片。道真洛龍多糖提取方法參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公布號(hào)CN104147042 A，得到不同分子量的道真洛龍黨參多糖COP-1、COP-2、COP-3[6]，其分子質(zhì)量分別3 500、7 000、10 000左右?？偺呛坎捎帽椒?硫酸法[7]測(cè)定，測(cè)得總糖含量為92.18%。

1.5動(dòng)物分組和處理72只雌雄各半的昆明種小鼠(20±2)g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、道真洛龍黨參多糖COP-1低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性藥組共6組，每組12只小鼠。除正常對(duì)照組外，小鼠采用腹腔注射環(huán)磷酰胺粉針劑100 mg/kg的劑量，腹腔注射誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型，1次/d，注射3次，其中正常對(duì)照組注射生理鹽水。造模后，連續(xù)給藥7 d，1次/d。陽(yáng)性給藥組給予黃芪顆粒灌胃，劑量為200 mg/kg；道真洛龍多糖低劑量組、中劑量組及高劑量組分別給予400、600、800 mg/kg的黨參多糖灌胃。給予同體積的生理鹽水灌胃模型組、正常對(duì)照組。

1.6測(cè)定小鼠靜注碳粒廓清速率末次給藥24 h后小鼠進(jìn)行稱(chēng)重，將1%明膠溶液稀釋5倍的印度墨汁對(duì)小鼠尾靜脈注射，注射量為0.1 mL/10g，分別在5 min(t1)、10 min(t2)時(shí)取小鼠外周血。在8 mL的0.1% CaCO3溶液中加入80 μL小鼠外周血液，然后在分光光度計(jì)680 nm處測(cè)定此溶液的吸光度A1、A2，并計(jì)算小鼠碳粒廓清指數(shù)K。第2次取血后將小鼠斷椎處死，無(wú)菌條件下取出肝、脾、胸腺，用生理鹽水沖洗，吸干稱(chēng)重，計(jì)算吞噬指數(shù)α。碳粒廓清指數(shù)(K)= lgA2- lgA1/(t2-t1)，α=體重/(脾重+肝重)×K1/3。

1.7小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的計(jì)算按照1.6中處理，稱(chēng)重，計(jì)算小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。計(jì)算公式: 脾臟指數(shù)=(脾臟重量/小鼠體重)×10，胸腺指數(shù)=(胸腺重量/小鼠體重)×10。

2結(jié)果

2.1不同劑量的道真洛龍黨參多糖(COP-1)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響

2.1.1COP-1對(duì)小鼠注碳粒廓清速率和吞噬指數(shù)的影響小鼠外周血取樣，按照公式計(jì)算小鼠的注碳粒廓清率K和吞噬指數(shù)α，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組K和α指標(biāo)均低于正常對(duì)照組(P<0.01)，但道真洛龍黨參多糖COP-1中、高劑量組和陽(yáng)性藥組的α與K均高于模型組(P<0.01)。其中道真洛龍黨參多糖COP-1中劑量組和高劑量組相互的差異不顯著(見(jiàn)表1)。

組別劑量(mg/kg)靜注碳粒廓清速率K吞噬指數(shù)α脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)正常對(duì)照組—0.027±0.0105.42±1.023.43±0.733.19±1.28模型組—0.010±0.006**3.67±0.73**1.82±0.55**1.08±0.26**黃芪顆粒藥組2000.021±0.002##5.27±0.21##6.21±2.04##1.84±0.51##COP-1低4000.022±0.0184.12±2.432.82±0.871.39±0.47COP-1中6000.021±0.012##4.51±1.83#4.68±1.11##1.97±0.02##COP-1高8000.024±0.019##4.73±1.19##4.19±1.83##1.99±0.07##

**：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；#：與模型組比較，P<0.05；##：與模型組比較，P<0.01。

2.1.2COP-1對(duì)小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響小鼠處死取材后按照公式計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。模型組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯低于正常對(duì)照組小鼠(P<0.01)，陽(yáng)性藥，中劑量及高劑量組的臟器指標(biāo)均明顯高于模型組(P<0.01)，其中道真洛龍黨參多糖COP-1中劑量組和高劑量組的相互差異并不顯著(見(jiàn)表1)。

2.2不同分子質(zhì)量的道真洛龍黨參多糖(COP-1、COP-2、COP-3)對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響小鼠處死取材后按公式計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。模型組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)，陽(yáng)性藥組、COP-1藥組、COP-2藥組、COP-3藥組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均高于模型組(P<0.01)，而COP-1、COP-2、COP-3組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表2)。

組別劑量(mg/kg) 胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)正常對(duì)照組—3.05±1.223.27±0.81模型組—1.14±0.29**1.73±0.57**黃芪顆粒藥組2001.84±0.51##6.21±2.04##COP-16001.97±0.02##4.68±1.11##COP-26001.71±0.12##4.26±1.33##COP-36001.92±0.27##4.59±1.65##

**：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；##：與模型組比較，P<0.01。

3討論

環(huán)磷酰胺對(duì)淋巴細(xì)胞具有明顯抑制作用，常被作為免疫抑制劑使用，用此藥建立免疫抑制動(dòng)物模型[8-10]。小鼠靜注碳粒廓清速率實(shí)驗(yàn)反映小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力強(qiáng)弱，用注碳粒廓清指數(shù)速率(K)和吞噬指數(shù)來(lái)進(jìn)行判定。注碳粒廓清指數(shù)速率愈大，小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬活性愈強(qiáng)，清除靜脈中異物的清除率高、迅速，吞噬功能愈強(qiáng)；反之則弱。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。體內(nèi)的脾臟與胸腺器官對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有著非常重要的影響，脾臟與胸腺器官相對(duì)質(zhì)量的變化能夠作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫的表征，其高低取決于其中淋巴細(xì)胞增殖的程度，可估計(jì)免疫功能的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常昆明種小鼠采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型，造模后，測(cè)量小鼠的體重及脾臟、胸腺指數(shù)與正常對(duì)照組小鼠對(duì)比，數(shù)值均明顯下降，說(shuō)明免疫抑制動(dòng)物模型造模成功。黃芪顆粒藥組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均高于模型組(P<0.01)，說(shuō)明選擇的陽(yáng)性對(duì)照藥能顯著性地增強(qiáng)小鼠的免疫功能，而與正常組對(duì)照，胸腺指數(shù)顯著降低而脾臟指數(shù)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，這可能與黃芪顆粒對(duì)小鼠免疫活性的具體作用靶點(diǎn)不一致所致，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

龔其海等[5]文獻(xiàn)報(bào)道，道真洛龍黨參及其移栽后的洛龍黨參所含粗多糖都對(duì)小鼠免疫功能有增強(qiáng)作用，說(shuō)明經(jīng)移栽后洛龍黨參的黨參粗多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響未發(fā)生改變。本研究在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠模型，選用市售黃芪顆粒作為陽(yáng)性對(duì)照，考察道真洛龍黨參中提取、分離的不同分子量洛龍黨參多糖(COP-1、COP-2、COP-3)的增強(qiáng)免疫功能作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，道真洛龍黨參多糖COP-1中劑量、高劑量組都具有與陽(yáng)性對(duì)照藥黃芪顆粒相似的增強(qiáng)免疫功能的效果，測(cè)量的小鼠碳粒廓清速率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均明顯高于模型組小鼠，表明了洛龍黨參COP-1中劑量、高劑量組多糖均可減輕CTX所致小鼠免疫功能的抑制作用，但COP-1中劑量、高劑量組相互差異不顯著。值得注意的是，不同分子量的黨參多糖對(duì)于小鼠臟器指標(biāo)的影響表明，COP-1、COP-2、COP-3均具有減輕CTX對(duì)小鼠免疫功能的抑制作用，但相互差異并不顯著。提示道真洛龍黨參多糖的主要活性部位可能是不同分子量的均一多糖協(xié)同作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究表面道真洛龍黨參多糖COP-1、COP-2、COP-3對(duì)于小鼠的肝臟和脾臟器官活性有一定增強(qiáng)作用，能夠抵抗CTX對(duì)小鼠免疫功能的抑制作用，促使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的免疫細(xì)胞，提高免疫抑制小鼠的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，起到增強(qiáng)機(jī)體免疫作用的功效。

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[收稿2015-12-09;修回2016-01-03]

(編輯：王靜)

Study on immunological activities of polysaccharides isolated fromRadixcodonopsison immune function in mice

YuLan，WangYi

(Department of Analytical Chemistry of School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the effects of purified polysaccharides from Luolong Radix codonopsis on depressed immune function induced by cyclophosphamide (CTX) in mice. Methods To extract and purify polysaccharides from Luolong Radix codonopsis. 72 mice were randomly divided into blank, model, positive (Astragalus membranaceus), low (400),medium (600), and high (800 mg/kg) dose groups of COP-1,and compared the efficacy of COP-1 (wt. 3 500), COP-2 (wt. 7 000), and COP-3 (wt 10 000) at 600 mg/kg daose．Model with depressed immune function was induced by cyclophosphamide at the dose of 100 mg /kg for consecutive 3 days，meanwhile polysaccharides were administrated by gavage 7 days later.The carbon clearance rate, thymus and spleen index were calculated to confirm the effects of polysaccharides on the depressed immune function.Results Thymus and spleen index of model group were significantly decreased. However, thymus，spleen index of positive，mid- and high-dose of COP-1, and different molecular weight groups of COP-1, COP-2,and COP-3 were significantly increased than those of model group. Conclusion Polysaccharides from Luolong Radix Codonopsis may attenuate the depression of immune function induced by CTX in mice，and different molecular weight polysaccharides were not statistically significant genetic material injury in mice induced by CTX.

[Key words]polysaccharides; immune function; mouse; carbon clearance rate; spleen; thymus

[中圖法分類(lèi)號(hào)]R979.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)01-0010-04

[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳基金資助項(xiàng)目(NO：LH[2014]7563)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(NO：ZMKD2013-006)。