金辰光，陳瑞戰(zhàn)，譚　莉，常清泉，陸　娟，章雯雯

(長(zhǎng)春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032)

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響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶提取夏枯草多糖

金辰光，陳瑞戰(zhàn)，譚莉，常清泉，陸娟，章雯雯

(長(zhǎng)春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130032)

[摘要]本文探索和優(yōu)化一種高效的復(fù)合酶解技術(shù)從夏枯草中提取多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶添加量(A)、提取溫度(B)和溶液pH值(C)三因素三水平的Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝。得到最佳提取條件：纖維素酶濃度0.4%、果膠酶濃度0.8%、木瓜蛋白酶濃度0.8%，提取溫度61℃，pH 6.2。在此條件下夏枯草粗多糖的提取得率為11.57±0.48% (n=3)，與預(yù)測(cè)得率(12.01%)基本一致。說(shuō)明優(yōu)化得到的工藝合理、可行，復(fù)合酶提取得率高、能耗低，是一種很有希望的提取方法。

[關(guān)鍵詞]夏枯草；多糖；復(fù)合酶；優(yōu)化

夏枯草(PrunellavulgarisL.)為唇形科(Labiatae)，夏枯草屬(Prunella)植物，多年生草本。廣泛分布于歐亞溫帶地區(qū)及熱帶山區(qū)，主要含有多糖[1]、黃酮[2]、三萜、甾醇、有機(jī)酸、揮發(fā)油及其苷類等活性成分[3]，有免疫增強(qiáng)[4]、抗腫瘤、抗氧化[1]、抗結(jié)核[5]，清肝、明目、清熱、散結(jié)等功效[6]。糖生物學(xué)研究表明，多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[7]、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化[5-6]、抗衰老等多種生理活性，廣泛應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域。

多糖的提取是多糖研究的基礎(chǔ)，它不僅影響提取得率，還影響多糖的結(jié)構(gòu)和活性[8]。多糖提取方法有熱水浸提、酸堿浸提、超聲輔助提取[9]、微波輔助提取以及酶解提取等[10]，其中酶解提取具有得率高、溫度低、活性高等優(yōu)點(diǎn)[11]。但復(fù)合酶解提取夏枯草多糖的研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本文采用復(fù)合酶提取夏枯草多糖，并且對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為夏枯草資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與材料

夏枯草果穗曬干并用高速粉碎機(jī)碎成粉末，過(guò)60目篩備用；截留分子量3500Da透析袋(北京瑞達(dá)恒輝科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100，上海愛(ài)朗儀器有限公司)，高速離心機(jī)(Heraeus Multifuge X1R，德國(guó))，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1601，北京北分瑞利分析儀器)；纖維素酶(TCI化城工業(yè)發(fā)展有限公司，日本，25000U/g)、果膠酶(TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司，日本，40000U/g)、木瓜蛋白酶(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，6000U/mg)，硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2酶解法提取多糖

夏枯草粉末分別用石油醚、95%乙醇回流兩次，脫脂、脫色、除去低聚糖和小分子雜質(zhì)，最后揮干溶劑，得到預(yù)處理樣品。

稱取3g預(yù)處理樣品，加入適量蒸餾水，浸泡6h，按照選定的加酶量(纖維素酶：果膠酶：木瓜蛋白酶=1∶2∶2)、酶解溫度和pH值在水浴鍋中提取60min，提取完成后沸水浴滅活2min。提取溶液離心，收集上清液并減壓濃縮至原體積的20%以下，加入無(wú)水乙醇至乙醇最終濃度為80%，在4℃溫度下沉化24h。離心后收集沉淀，利用Sevag法脫蛋白，用截留分子量3500Da的透析袋流水透析48h，最后凍干得到夏枯草粗多糖 (PPs)。采用硫酸—苯酚法測(cè)定多糖含量[6]。PPs提取得率(Y)公式:Y (%) = (M/W) ×100%，其中M是多糖的含量，W代表樣品凈重。以葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(Abs)為縱坐標(biāo)，線性擬合繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程為：

Abs=0.06329C-0.03835(R2=0.9994).

1.3熱回流提取多糖

預(yù)處理后的樣品加適量蒸餾水浸泡6h，在100℃溫度下回流提取2h，離心收集上清液，反復(fù)操作兩次，合并提取液。提取液按照前文1.2小節(jié)中的步驟處理。

1.4響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken Design (BBD)中心組合設(shè)計(jì)，以PPs提取得率Y(%)為響應(yīng)值，考察三個(gè)獨(dú)立變量：加酶量(A)、酶解溫度(B)和pH值(C)(每個(gè)因素取 3 個(gè)水平)對(duì)提取得率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和PPs得率如表1所示，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次；并利用Design Expert(8.0版)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用ANOVA法進(jìn)行方差分析。在P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　夏枯草多糖提取率的響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

2結(jié)果與分析

2.1單因素對(duì)多糖得率的影響

如圖1a所示，在固定酶解溫度60℃、水料比5mL·g-1和pH值為6條件下，復(fù)合酶添加量在0.25%~2.5%時(shí)與多糖得率成正效應(yīng)關(guān)系，之后進(jìn)一步增加酶添加量時(shí)則多糖得率下降。說(shuō)明3種生物酶對(duì)植物細(xì)胞組織具有很好的酶解功能，并能夠提高多糖在水中的溶解性[12]，總量高于2.5%后多糖得率開(kāi)始下降，其原因可能是多糖被過(guò)量的纖維素酶、蛋白酶和果膠酶降解所致[13-14]。所以酶添加量應(yīng)選擇在1.5%～2.5%之間。

固定酶添加量為2%、pH值為6、酶解溫度為55℃，水料比對(duì)多糖提取得率的影響如圖1b所示。在20～50 mL·g-1的水料比范圍內(nèi)，隨水料比的增加，多糖的提取得率增加，當(dāng)水料比超過(guò)50mL·g-1后，多糖得率不再明顯增加，說(shuō)明多糖在水料比為50mL·g-1時(shí)可以充分溶解在溶劑中。在一般情況下，水料比高，組織細(xì)胞內(nèi)外的多糖濃度梯度大，利于多糖由組織細(xì)胞內(nèi)部向周圍提取溶劑的擴(kuò)散，提取得率增加。但過(guò)分增大水料比會(huì)增加后處理的工作量，降低提取效率。故而在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中將水料比固定在50mL·g-1。

如圖1c所示，在固定其它實(shí)驗(yàn)條件情況下，酶解過(guò)程中的pH對(duì)多糖的提取得率的影響較為復(fù)雜。在pH為3~4時(shí)，多糖得率與pH值成反效應(yīng)，可能是過(guò)酸條件下，酶的空間結(jié)構(gòu)受到了破壞，影響了與底物的結(jié)合，從而使提取得率下降[12,14]。而pH值從4升高到7時(shí)，多糖得率大幅升高，之后又再次降低，說(shuō)明提取過(guò)程中過(guò)高的pH值會(huì)降低酶的活性。所以，應(yīng)選擇在pH值4～6下進(jìn)行酶解提取。

如圖1d所示，當(dāng)酶添加量為2%、水料比為50mL·g-1、pH值為6時(shí)，在溫度由30℃提升到60℃的過(guò)程中，多糖提取得率穩(wěn)步上升，表明溫度可以改進(jìn)多糖的傳質(zhì)效率，隨著提取溫度的提高，多糖在溶劑中的溶解度、擴(kuò)散系數(shù)增大，提取溶劑的粘度降低，這些都有利于多糖的提取。然而，過(guò)高的溫度也可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其在提取過(guò)程中降解[8,10]，提取得率降低。因此，選擇60℃左右的提取溫度較為適宜。

圖1　酶添加量(a), 水料比(b), pH(c)和酶解溫度(d)對(duì)多糖提取得率的影響

2.2響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1模型擬合與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件范圍，選擇酶添加量、酶解溫度和pH值三個(gè)因素，每三因素取三個(gè)水平進(jìn)行BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。通過(guò)軟件模擬出各因素對(duì)提取得率的二次多項(xiàng)式為：Y(%)=11.57-0.32A+0.29B+0.78C+0.44AB-1.54AC+0.55BC-1.53A2-0.59B2-2.82C2.

方差分析(ANOVA)結(jié)果如表2所示。F值(65.32)和P值(P<0.0001)的結(jié)果表明模型極其顯著。同時(shí)失擬項(xiàng)F值(0.074)和P值(0.9708)表明失擬不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間有良好的關(guān)聯(lián)性。決定系數(shù)(R2=0.9882)，調(diào)整后的決定系數(shù)(R2=0.973)也證實(shí)該模型是高度顯著的。同時(shí)，變異系數(shù)(CV%=3.62)也表明實(shí)驗(yàn)值的高度可靠性。從表2還可看出線性相關(guān)系數(shù)(A，B和C)，二次項(xiàng)系數(shù)(A2，B2和C2)和交互項(xiàng)系數(shù)(AB，AC和BC)均顯著(P<0.05)。其中交互項(xiàng)系數(shù)AC與二次項(xiàng)系數(shù)A2和C2極顯著(P<0.0001)。

表2　擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析

注：* P<0.05, 顯著；** P<0.0001, 極顯著。

2.2.2響應(yīng)面分析

酶解法提取夏枯草多糖工藝中酶添加量、酶解pH值和酶解溫度3個(gè)因素之間交互作用對(duì)多糖提取得率的影響如圖2所示。

圖2　酶添加量(A)、提取液溫度(B)、溶液pH(C)兩兩交互對(duì)提取得率的影響

當(dāng)溶液pH值固定在6時(shí)，酶添加量(A)，酶解溫度(B)和它們相互作用對(duì)多糖得率的影響如圖2a和圖2b所示。兩項(xiàng)因素對(duì)多糖得率的影響均成拋物線形，即隨酶添加量和酶解溫度的增大，多糖得率呈先增大后降低的趨勢(shì)，因此在提取工藝中適當(dāng)增加酶添加量和酶解溫度可以提高多糖得率[12]。由圖2c和圖2d可知，隨著溶液pH值(C)和酶添加量(A)的增大提取得率逐漸增加，在pH值為6.4 和加酶量為1.8% 時(shí)夏枯草多糖的得率達(dá)到最大值；當(dāng)溶液pH值和酶添加量繼續(xù)增大時(shí)，多糖得率開(kāi)始降低，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)控制酶用量和溶液pH值。由圖2e和圖2f 和方差分析可知，溶液pH值(C)和酶解溫度(B)的交互作用中，溶液pH值對(duì)夏枯草多糖得率的影響極顯著，且在固定酶添加量時(shí)酶解溫度對(duì)多糖的影響程度遠(yuǎn)不及溶液pH值的影響，兩項(xiàng)交互作用的影響也在中心條件附近達(dá)到最大。

由表2和圖2可知，酶解法提取夏枯草多糖的工藝參數(shù)中，各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)椋好附鈖H值>酶添加量>酶解溫度>水料比。其中酶添加量、酶解溫度和酶解pH值均達(dá)到極顯著水平。由表2可知，酶解溫度、酶添加量與溶液pH值都存在交互作用，其中溶液pH值與酶添加量的交互影響達(dá)到極顯著水平。

2.3不同提取方法的比較

復(fù)合酶解法提取得率為12%，比熱回流法高出3%，說(shuō)明酶解法提取多糖更加高效；且復(fù)合酶可以降解蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提高了多糖的純度；與傳統(tǒng)熱回流法比較，酶解提取的溫度為61℃，而熱回流提取的溫度是100℃，酶解法提取溫度較熱回流提取大幅降低，這樣既降低了雜質(zhì)成分的溶出，又最大限度地保持了多糖的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明復(fù)合酶解法提取夏枯草多糖工藝優(yōu)勢(shì)明顯，具有良好的發(fā)展前景。

3結(jié)論

本研究采用復(fù)合酶解法提取夏枯草多糖，該工藝通過(guò)酶水解破碎植物細(xì)胞壁的作用，使細(xì)胞內(nèi)多糖物質(zhì)充分溶出，從而顯著提高了夏枯草多糖得率。各因素對(duì)夏枯草多糖提取得率的影響次序?yàn)椋好附鈖H值>酶添加量>酶解溫度>水料比。最佳提取工藝條件為：酶添加量2%(纖維素酶0.4%、果膠酶0.8%、木瓜蛋白酶0.8%)、水料比50mL·g-1、酶解溫度61℃、酶解pH 6.2；在此最佳條件下，復(fù)合酶法提取夏枯草多糖的得率為11.57 ± 0.48%，與模型預(yù)估值12.01%接近，說(shuō)明優(yōu)化得到的模型準(zhǔn)確、可靠。建立的提取工藝較常規(guī)的提取方法，得率高、條件溫和，可以廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取。

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Response Surface Optimization of Complex Enzyme Extraction Polysaccharides fromPrunellaVulgaris

JIN Chen-guang, CHEN Rui-zhan, TAN Li, CHANG Qing-quan, LU Juan，ZHANG Wen-wen

(Faculty of Chemistry, Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032, China)

Abstract:In this study, an efficient complex enzyme extraction (CEE) technology was developed and optimized to extract polysaccharides from Prunella vulgaris. On the basis of single factor test, response surface methodology (RSM) based on a three-factor three-level Box-Behnken Design (BBD) was employed to optimize the extraction conditions including enzyme concentration, extraction temperature and pH. The optimal extraction conditions were as follows: cellulase 0.4%, pectinase 0.8%, papain 0.8%, extraction temperature 61℃, pH 6.2. Under these conditions, the experimental yield was 11.57 ± 0.48%, which is well in close agreement with the value predicted (12.01%) by the model. These results demonstrated that the optimal extraction technology is reasonable and feasible. The CEE is a promising extraction method that offers higher yield and lower energy cost.

Key words:Prunella vulgaris; polysaccharides; complex enzyme; optimization

[通訊作者]陳瑞戰(zhàn)(1967- )，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事天然有機(jī)化合物研究。

[作者簡(jiǎn)介]金辰光(1988- )，男，碩士研究生，從事天然有機(jī)化合物研究。

[基金項(xiàng)目]吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目([2014]258，[2015]355)；長(zhǎng)春師范大學(xué)研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃(cscxy2014003)。

[收稿日期]2015-11-10

[中圖分類號(hào)]O629.12

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-7602(2016)02-0049-05