宋天姣　曹倩文　王　娜　田　雨　鄭全輝

華北理工大學　河北唐山　063000；①河北省慢性疾病重點實驗室

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小鼠皮下及肺轉移腫瘤模型制備

宋天姣曹倩文王娜田雨鄭全輝①

華北理工大學河北唐山063000；①河北省慢性疾病重點實驗室

[摘要]①目的經皮下和尾靜脈注射，制備小鼠黑色素瘤細胞增殖、轉移模型。②方法體外培養(yǎng)黑色素瘤細胞，分別經腋部皮下和尾靜脈注射接種C57BL/6小鼠，接種劑量分別為1×106/只和3×105/只，2周后觀察黑色素瘤形成及肺部轉移情況。③結果黑色素瘤細胞注射2周后，經皮下接種的小鼠腋窩出現(xiàn)明顯腫瘤，成瘤率達100%;經尾靜脈注射的小鼠肺部出現(xiàn)大量黑色素瘤結節(jié)， 腫瘤轉移率達90%。④結論經皮下和尾靜脈注射方法能夠成功制備小鼠的腫瘤細胞增殖和轉移模型。

[關鍵詞]腫瘤細胞黑色素瘤增殖轉移

Preparation of subcutaneous and pulmonary metastasis mouse models

SONGTianjiao,CAOQianwen,WANGNa,etal

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.MethodsMelanoma cells(1×106/100uL)were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3×105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metastasis mouse model.Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melanoma cell injection.ResultsThe subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100%.The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98%.ConclusionTumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully prepared by subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.

[KEYWORDS]Tumor cell metastasis.Melanoma.Proliferation.Transfer

目前惡性腫瘤已成為一類嚴重威脅人類健康的多發(fā)病和常見病，其發(fā)病機制仍未完全闡明，對腫瘤有效的治療措施還處在不斷探索之中。小鼠腫瘤模型在揭示腫瘤發(fā)病原因，探索發(fā)病機制以及評估治療措施中有著不可替代的作用[1]。本研究以體外培養(yǎng)的黑色素瘤B16細胞作為瘤種，采用皮下和尾靜脈注射方法建立腫瘤細胞增殖和轉移模型，以期為后續(xù)腫瘤免疫學發(fā)病機制和治療研究提供實驗基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株。小鼠B16黑色素瘤細胞由中國醫(yī)學科學院藥物研究所惠贈，在含10%胎牛血清及雙抗(青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL)的RPMI 1640(GIBCO公司)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件是飽和濕度、37℃、5%CO，2～3d更換1次培養(yǎng)液，細胞達到95% 融合時用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化、傳代培養(yǎng)。

1.1.2動物。C57BL/6 小鼠由中國食品藥品檢定研究院提供[許可證號：SCXK(京)2009-0017],SPF級環(huán)境培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1小鼠皮下黑色素瘤模型制備。消化、收集B16黑色素瘤，離心去上清，用無菌生理鹽水洗滌2次，將細胞懸浮于生理鹽水中，臺盼藍染色細胞活力大于95%，進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度為1×107/mL,對小鼠進行皮下接種。①分組：取6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠20只，隨機分成實驗和對照組，每組10只；②接種：對小鼠腋下皮膚進行酒精消毒，實驗組小鼠注射B16細胞100μL/只(1×106)，對照組小鼠注射等量生理鹽水，2周后解剖小鼠觀察腫瘤生長情況。

1.2.2小鼠肺轉移黑色素瘤模型的制備。收集B16黑色素瘤細胞，用無菌生理鹽水調整細胞濃度為3×106/mL。選取6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠20只，分組同上。小鼠首先用紅外燈照射3～5min，待尾靜脈清晰可見后酒精消毒。實驗組小鼠注射黑色素瘤細胞100μL(3×105)/只，對照組小鼠注射等量生理鹽水。2周后解剖小鼠觀察肺黑色素瘤轉移。

2結果

2.1B16黑色素瘤細胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)B16黑色素瘤細胞，當其密度達到細胞瓶的95%時傳代、擴增培養(yǎng)，直至細胞數(shù)量達到接種要求,見圖1。

圖1　B16黑色素瘤細胞培養(yǎng)。放大倍數(shù)：40×

2.2皮下黑色素瘤小鼠制備實驗組小鼠在皮下接種B16細胞7d后腋下開始出現(xiàn)可觸及的腫瘤，成瘤率達100% (10/10);2周后腫瘤明顯增大，幾乎累及整個小鼠的腋窩。解剖小鼠后可見明顯腫瘤團塊形成，見圖2。

圖2　小鼠皮下黑色素瘤模型制備

2.3黑色素瘤肺轉移小鼠制備B16細胞尾靜脈注射2周后處死小鼠，取肺組織觀察。實驗組小鼠發(fā)生黑色素瘤細胞肺轉移率達90%(9/10)。由圖3可以看出，對照組小鼠肺臟成粉紅色，表面光滑；實驗組小鼠肺臟蒼白，各個肺葉都長有大量黑色素瘤結節(jié)。

圖3　小鼠肺轉移黑色素瘤模型制備

3討論

腫瘤動物模型在研究人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制，體內觀察各種腫瘤治療效果以及探索新的腫瘤治療途徑方面發(fā)揮重要作用。在各類動物中，由于小鼠具有明確、穩(wěn)定的遺傳性狀，對腫瘤易感以及成本較低的優(yōu)點，因而廣泛應用于腫瘤的基礎和臨床研究。小鼠腫瘤模型按照建立方法可分為多種類型，如：基因修飾小鼠腫瘤模型，自發(fā)和誘發(fā)小鼠腫瘤模型以及移植小鼠腫瘤模型[2]。后者將移植抗原性與宿主相同的腫瘤細胞系接種于小鼠體內，由于不存在或僅有很低的移植排斥反應，因而腫瘤細胞能夠穩(wěn)定生長且生物性狀很少發(fā)生改變，故成為國內外常用的腫瘤動物模型制備方法之一。

B16黑色素瘤細胞是來源于C57BL/6小鼠的自發(fā)性腫瘤細胞，同時也是為數(shù)不多產生色素的腫瘤細胞系之一[3]。B16細胞具備大多數(shù)腫瘤細胞的共同特點如生長迅速，MHCⅠ類分子表達低易逃避機體免疫監(jiān)視，侵襲性強易發(fā)生轉移等[4]。在本次實驗中我們觀察到皮下注射B16細胞小鼠腫瘤形成快，成瘤率高，且成瘤率受細胞注射劑量的影響小?？蔀楹罄m(xù)腫瘤干預處理或腫瘤發(fā)展機理研究提供便利條件。

尾部靜脈注射是制備腫瘤轉移模型的常用方法, 我們預實驗中嘗試不同劑量的B16細胞如1×105/只、3×105/只和1×106/只注射, 發(fā)現(xiàn)1×105/只劑量組肺轉移率低，約50%，可能與細胞數(shù)量少有關。而采用1×106/只注射，發(fā)現(xiàn)有些小鼠在注射完之后，出現(xiàn)痙攣，活動下降，隨后死亡，估計是形成癌栓，造成了肺栓塞的緣故[5]。因此，我們采用3×105/只注射，發(fā)現(xiàn)B16細胞的肺轉移率能夠達到90%，且肺部的黑色素瘤結節(jié)比較清晰，肉眼即可計數(shù)腫瘤轉移灶數(shù)目，對腫瘤轉移干預處理的后續(xù)研究提供了便利、可行的實驗材料。

在此實驗中，我們通過黑色素瘤B16細胞的皮下注射和尾靜脈注射建立了腫瘤細胞體內增殖和轉移的小鼠模型，且兩種腫瘤模型的制備操作簡便，成瘤率和轉移率高，實驗周期短，為后續(xù)研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移機制以及探索腫瘤治療新途徑提供了實驗基礎。

參考文獻

[1]張峻嶺,陳子逸,陳國衛(wèi),等. 新的臨床前研究小鼠模型：腫瘤患者來源的移植瘤[J].腫瘤,2014,34(3):291-294

[2]Qiu W,Gloria H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev, 2013,32(0):1007-1012

[3]Scott A, Elizabeth W, Abigail L，et al. Local expression of interleukin‐2 by B16 melanoma cells results in decreased tumour growth and long‐term tumour dormancy[J]. Immunology, 2013, 138(3): 280-292

[4]Nayoung L, Steven R, Tobias S. Melanoma stem cells and metastasis: mimicking hematopoietic cell trafficking?[J]. Lab Invest,2014, 94(1): 13-30

[5]陳愉生，林小芬，李鴻茹，等.肺癌轉移瘤動物模型的建立[J]. 中國實驗動物學報,2014,22(5): 32-34

(張愛國編輯)

【通訊作者】鄭全輝。

【作者簡介】宋天姣(1994-)，女，本科生。研究方向：腫瘤免疫。

【基金項目】國家自然科學基金項目(編號：8137311)；河北省自然科學基金項目(編號：p013209019)；華北理工大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：X2015153)。

[中圖分類號]Q 784

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)01-001-2