張蒙，盛鑌，馬鵬德，張昌文，徐勇

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核糖體蛋白L6在前列腺癌中的表達(dá)及臨床意義

張蒙，盛鑌，馬鵬德，張昌文，徐勇△

摘要:目的探討核糖體蛋白L6（RPL6）在前列腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR （RT-qPCR）和Western blot檢測RPL6在前列腺癌組織（80例）及癌旁組織（62例）中的表達(dá)水平，分析RPL6mRNA表達(dá)水平與前列腺癌患者的臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果RPL6在前列腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P < 0.05)；血清前列腺特異性抗原（PSA）值高、Gleason評分高、臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RPL6mRNA表達(dá)水平增高（均P < 0.05），而不同年齡、精囊侵襲、血管侵犯及手術(shù)切緣陽性情況患者的RPL6mRNA表達(dá)水平無明顯差異(均P > 0.05)。RPL6mRNA高表達(dá)前列腺癌患者的術(shù)后無生化復(fù)發(fā)生存率較低（χ2=4.530,P= 0.033）。結(jié)論RPL6表達(dá)水平增高與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)；或可用其作為初步判斷前列腺癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：核糖體蛋白L6；前列腺癌；實(shí)時熒光定量PCR；預(yù)后

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，在發(fā)達(dá)國家其位居男性新發(fā)腫瘤的第一位[1]。近年來，隨著生活方式的西方化、人口老齡化以及診療技術(shù)的革新，前列腺癌在我國的發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅著我國男性的健康[2]。因此，研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對于前列腺癌的診治具有重要意義。核糖體蛋白L6（ribosomal protein L6, RPL6）是核糖體大亞基的組成蛋白，在白血病、胃癌中存在異常表達(dá)，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[3-4]。在前列腺癌中RPL6的表達(dá)情況及其臨床意義尚少見報道。本研究旨在探討RPL6在前列腺癌中的表達(dá)及其臨床意義，為前列腺癌的診療提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料收集我院泌尿外科2007年1月—2013年5月手術(shù)切除的前列腺癌標(biāo)本80例及癌旁標(biāo)本62例，術(shù)后立即采集標(biāo)本，液氮速凍后放于-80℃保存。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，患者術(shù)前均未行放、化療及雄激素剝奪治療。收集患者以下幾項(xiàng)資料：年齡、術(shù)前血清前列腺特異性抗原（PSA）值、Gleason評分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、精囊侵犯、病理分期及手術(shù)切緣陽性情況。生化復(fù)發(fā)的定義為：前列腺癌根治術(shù)后連續(xù)2次監(jiān)測血清PSA的值均大于0.2 μg/L。

1.2主要試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒購自Roche公司，兔抗人RPL6多克隆抗體購自美國Pro?teintech公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司。引物由蘇州金唯智公司合成。

1.3RT-qPCR檢測RPL6mRNA表達(dá)Trizol法提取組織標(biāo)本的總RNA，反轉(zhuǎn)錄之前檢測RNA的濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，在Eco Real-Time PCR System上檢測RPL6mRNA的表達(dá)。RPL6引物序列：上游5′-ATGGCGGGTGAAAAAGTTG-3′，下游5′-TCCTCACAAATTGGTGTTCTAAAT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游5′-GGAAGATGGTGATGGGATT- 3′。擴(kuò)增體系10 μL，SYBR Greenmaster 5 μL，上、下游引物混合物0.2 μL，cDNA模板1 μL，無酶水3.8 μL。反應(yīng)條件為：94℃3min，然后94℃30 s，58℃30 s，72℃1min，共40個循環(huán)，最后72℃延伸5min。RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果通過相對定量法（2-△△Ct）進(jìn)行分析，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Western blot檢測RPL6蛋白表達(dá)取100mg組織標(biāo)本，加入哺乳動物蛋白抽提裂解液并超聲破碎，4℃12 000×g離心10min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人RPL6多克隆抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3 000）室溫孵育1h后，滴加ECL顯影液，以GAPDH作為內(nèi)參，凝膠成像儀顯像并記錄結(jié)果。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計處理，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；生存分析用Kalpan-Meier曲線估計，行Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組RPL6mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果前列腺癌組織中RPL6mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織，見圖1、2。

2.2前列腺癌中RPL6mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系以RPL6mRNA在前列腺癌中表達(dá)水平的均數(shù)（1.74）為分界點(diǎn)，高于平均數(shù)的為高表達(dá)組（49例），低于平均數(shù)的為低表達(dá)組（31例），分析RPL6mRNA的表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明，血清PSA值高、Gleason評分高、臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RPL6mRNA表達(dá)水平增高（均P < 0.05），而不同年齡、血管侵犯、精囊侵襲及手術(shù)切緣陽性患者的RPL6mRNA表達(dá)水平無明顯差異(均P > 0.05)，見表1。

Fig.1　The relative expression level of RPL6mRNA in prostate cancer tissues and noncancerous tissues圖1　前列腺癌組織和癌旁組織中的RPL6mRNA表達(dá)水平

Fig.2　The relative expression level of RPL6 protein in prostate cancer tissues (T) and noncancerous tissues (N)圖2　前列腺癌組織和癌旁組織中的RPL6蛋白表達(dá)水平

Tab.1　The relationship between RPL6 expression and clinicopathological features of prostate cancer表1　RPL6mRNA表達(dá)水平與前列腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3RPL6mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系生存曲線結(jié)果表明：RPL6mRNA高表達(dá)前列腺癌患者的術(shù)后無生化復(fù)發(fā)生存率較低（χ2=4.530，P=0.033），見圖3。

Fig.3　The relationship between RPL6mRNA expression with biochemical recurrence-free survival time in patients with prostate cancer圖3　前列腺癌患者中RPL6mRNA表達(dá)與無生化復(fù)發(fā)生存時間的關(guān)系

3　討論

核糖體蛋白是核糖體的主要組成成分，其在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要的作用。近年來，越來越多的研究表明核糖體蛋白除了參與組成核糖體之外，也參與細(xì)胞的生長、增殖及凋亡等眾多生理活動的調(diào)控[5]。近年來的研究表明，核糖體蛋白在多種腫瘤中存在異常表達(dá)[6-11]，核糖體蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的重要作用受到越來越多的關(guān)注。

在腫瘤進(jìn)展的過程中，癌基因Myc和抑癌基因PTEN、pRb及p53可以直接參與調(diào)控核糖體的產(chǎn)生及蛋白質(zhì)的翻譯[12-14]，這揭示了一些癌基因或者抑癌基因可以通過調(diào)控核糖體蛋白或核糖體的產(chǎn)生來調(diào)控腫瘤的進(jìn)展，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖及轉(zhuǎn)移。在胃癌中，RPL6可通過上調(diào)細(xì)胞周期素E促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[15]。但是在前列腺癌中，RPL6是否通過上述機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展需要進(jìn)一步的探索?？傊?，研究核糖體蛋白在參與組成核糖體之外的生物學(xué)功能，有利于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，還為探索癌癥潛在診療靶點(diǎn)提供了新的可能。

本研究通過RT-qPCR及Western blot技術(shù)分別在mRNA和蛋白水平上檢測了RPL6在前列腺癌組織中以及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，RPL6在前列腺癌組織中的表達(dá)明顯增高，提示其在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演一定的角色，具有潛在的輔助診斷及作為治療靶點(diǎn)的價值。這一研究結(jié)果與RPL6在胃癌[4]中表達(dá)上調(diào)結(jié)果相似。此外，筆者分析了RPL6mRNA的表達(dá)量與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示RPL6mRNA表達(dá)水平增高與前列腺癌患者較高的血清PSA值、高Gleason評分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及血管侵犯有關(guān)，與患者的年齡、精囊侵犯及手術(shù)切緣陽性無關(guān)。隨后筆者對RPL6mRNA的表達(dá)情況與患者的無生化復(fù)發(fā)生存率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RPL6mRNA的患者的生存時間明顯較低表達(dá)患者低，說明RPL6基因的高表達(dá)降低了前列腺癌患者術(shù)后的生存時間。由于樣本數(shù)量有限，今后需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以便更好地了解RPL6的異常表達(dá)在前列腺癌中的意義。

綜上，本研究結(jié)果提示RPL6在前列腺癌中高表達(dá)，與前列腺癌的一些臨床病理參數(shù)具有一定的相關(guān)性，且在前列腺癌患者的預(yù)后預(yù)測中具有潛在的指導(dǎo)價值，但是有關(guān)RPL6在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制目前還不明確，仍需要進(jìn)一步的深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Siegel RL,miller KD, Jemal A.Cancer statistics, 2015[J].CA Can?cer J Clin, 2015, 65(1):5-29.doi: 10.3322/caac.21254.

[2]han SJ, Zhang SW, Chen WQ, et al.Analysis of the status and trends of prostate cancer incidence in China [J].Chinese Clinical Oncology, 2013, 18(4):330-334.[韓蘇軍，張思維，陳萬青，等.中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志, 2013, 18(4):330-334] .doi:10.3969/j.issn.1009-0460.2013.04.009.

[3] Chenh, Xie ZX, Jiangh, et al.Effect of ribosomal protein L6 on drug resistance and apoptosis in K562/A02 cells[J].Journal of Ex?perimentalhematology, 2007, 15(2):292-295.

[4] Wu Q, Gou Y, Wang Q, et al.Downregulation of RPL6 by siRNA in?hibits proliferation and cell cycle progression ofhuman gastric can?cer cell lines [J].PLoS One, 2011, 6(10):e26401.doi: 10.1371/jour?nal.pone.0026401.

[5] De LashA, Perucho L, Paciucci R, et al.Ribosomal proteins as nov?el players in tumorigenesis[J].Cancermetastasis Rev, 2014, 33(1): 115-141.doi: 10.1007/s10555-013-9460-6.

[6] An SJ, Chen JK, Liu LL, et al.Over-expressed genes detected by suppression subtractivehybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE [J].Biomed Environ Sci, 2005, 18(5):302-306.

[7] Ohl F, Jungm, Xu C, et al.Gene expression studies in prostate can?cer tissue: which reference gene should be selected for normaliza?tion [J].Jmolmed (Berl), 2005, 83(12):1014-1024.

[8] Wangm,hu Y, StearnsmE.RPS2: a novel therapeutic target in prostate cancer [J].J Exp Clin Cancer Res, 2009, 28:6.doi: 10.1186/1756-9966-28-6.

[9]huang CJ, Chien CC, Yang SH, et al.Faecal ribosomal protein L19 is a genetic prognostic factor for survival in colorectal cancer[J].J Cellmolmed, 2008, 12(5B):1936- 1943.doi: 10.1111/j.1582-4934.2008.00253.x.

[10] Pomeroy SL, Tamayo P, Gaasenbeekm, et al.Prediction of central nervous system embryonal tumour outcome based on gene expres?sion[J].Nature, 2002, 415(6870):436-442.

[11]huang XP, Zhao CX, Li QJ, et al.Alteration of RPL14 in squamous cell carcinomas and preneoplastic lesions of the esophagus[J].Gene, 2006, 366(1):161-168.

[12] ClemensmJ.Targets andmechanisms for the regulation of transla?tion inmalignant transformation [J].Oncogene, 2004，23(18):3180-3188.

[13] Pestov DG, Strezoska Z, Lau LF, et al.Evidence of p53-dependent cross-talk between ribosome biogenesis and the cellcycle: effects of nucleolar protein Bop1 on G(1)/S transition[J].Mol Cell Biol，2001， 21(13):4246-4255.

[14] Boon K, CaronhN, Van Asperen R, et al.N-myc enhances the ex?pression of a large set of genes functioning in ribosome biogenesis and protein synthesis[J].EMBO J, 2001, 20(6):1383-1393.

[15] Gou Y, Shi Y, Zhang Y, et al.Ribosomal protein L6 promotes growth and cell cycle progression through upregulating cyclin E in gas?tric cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，393(4): 788-793.doi: 10.1016/j.bbrc.2010.02.083.

（2015-07-01收稿2015-08-05修回）

（本文編輯閆娟）

Expression and clinical significance of ribosomal protein L6 in prostate cancer

ZHANGmeng, SHENG Bin,mA Pengde, ZHANG Changwen, XU Yong△
The Second Affiliatedhospital of Tianjinmedical University, Tianjin Institute of Urology, Tianjin 300211, China
△Corresponding Author E-mail:xuyongprof@163.com

Abstract:Objective To explore the expression of ribosomal protein L6 (RPL6) in prostate cancer and its clinical sig?nificance.Methods RT-qPCR and Western blot assay were used tomeasure themRNA transcription and protein expres?sion levels of RPL6 in prostate cancer tissues (n=80) and adjacent non-cancerous tissues (n=62).The relationship between RPL6mRNA expression level and clinicopathological factors of prostate cancer was statistically analyzed.Results ThemRNA and protein expression levels of RPL6 were significantlyhigher in prostate cancer tissues compared with those of non-cancerous tissues (P < 0.05).There werehigher serum expression levels of prostate specific antigen (PSA) andhigher Gleason score in prostate cancer tissues.The expression level of RPL6mRNA was significantlyhigher in patients with lymph nodemetastasis and late clinical stage (P < 0.05).There were no significant differences in PSA levels between different ages, with or without seminal vesicle invasion and different surgicalmargin status (P > 0.05).Kaplan-Meier survival analysis of biochemical recurrence (BCR)-free survival time showed the significantly lower recurrent rate in patients withhigh RPL6mRNA expression（χ2=4.530,P=0.033).Conclusion The elevated expression of RPL6may play a role in the development of prostate cancer, and which can be used as a tumormarker to assess the prognosis of prostate cancer.

Key words:ribosomal protein L6; prostate cancer; real-time quantitative PCR; prognosis

通訊作者△E-mail:xuyongprof@163.com

作者簡介：張蒙（1990），男，碩士在讀，主要從事前列腺癌的基礎(chǔ)與臨床研究

基金項(xiàng)目：天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃(12JCYBJC31400)

中圖分類號：R737.25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/59076

作者單位：天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院、天津市泌尿外科研究所（郵編300211）