徐芳

慢性根尖周炎感染根管內糞腸球菌檢測和中間普氏菌基因多態(tài)性研究

徐芳

目的 探討慢性根尖周炎感染根管內糞腸球菌檢測和中間普氏菌基因多態(tài)性特點。方法 選取需根管再治療和未經(jīng)根管治療的慢性根尖周炎患者各20例，對根管內細菌樣本采集，行DNA提出，檢測糞腸球菌，并分析中間普氏基因多態(tài)性。結果 需根管再治療的患者E.f檢出11例，檢出率為55%；未經(jīng)根管治療的患者E.f檢出2例，檢出率為10%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，經(jīng)AP-PCR電泳對中間普氏菌行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各樣本中均各有1種基因型。結論 在原發(fā)慢性根尖周炎病例感染根管中，糞腸球菌有較低檢出率，而在再治療病例中，檢出率明顯增高，與根管治療時再感染可能相關。同時，中間普氏菌具基因多態(tài)性，可為臨床治療提供參考依據(jù)。

慢性根尖周炎感染；根管內糞腸球菌；中間普氏基因多態(tài)性

根尖周炎為臨床口腔科領域一種常見的慢性感染性病變，由起源自牙髓病的致病因素引發(fā)。根管治療術是現(xiàn)階段已被證實的最有效治療本病的方案，在無菌條件下，依據(jù)操作原則實施，可達85%～96%初次成功率[1]。針對少部分無效的患者，根管充填后在根尖周或根管內殘留的微生物感染是主要引發(fā)治療失敗的原因，檢測治療失敗的患者根管內細菌，如糞腸球菌（E.f），并行中間普氏菌基因多態(tài)性研究，可為臨床治療提供參考依據(jù)，本研究探討慢性根尖周炎感染根管內糞腸球菌檢測和中間普氏菌基因多態(tài)性特點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取選取江西省景德鎮(zhèn)市牙病防治所口腔科2014年5月～2015年5月收治的40例慢性根尖周炎患者，其中需根管再治療和未經(jīng)根管治療各20例，需根管再治療男14例，女6例，年齡19～45歲，平均（28.5±2.5）歲，未經(jīng)根管再治療男15例，女5例，年齡19～46歲，平均（28.9±2.4）歲，2組間基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義?；颊邔Ρ敬螌嶒灳橥猓瑢⒒既硐到y(tǒng)疾病，根尖有竇道者排除。

1.2 方法 （1）采集樣本：患牙上橡皮障，將所有修復體、充填體去除，用75%酒精對患牙消毒，取蒸餾水沖洗。需根管再治療的患牙，應用G鉆將冠2/3的根充材料去除，根尖1/3根充材料取出，在1 mL Ringer′液管中放置。若有液體自根管滲出，可取無菌紙捻插入，深度與根尖孔距離1 mm，在根管內紙捻停留1 mm取出，重復3次，在1 mL Ringer′液管放入所有紙捻。（2）DNA提?。禾崛H標準菌株：E.f、中間普氏菌（P.i,ATCC25261）。（3）PCR分析：取1.5%瓊脂糖凝膠對樣本

PCR擴增產(chǎn)物電泳、拍照，對E.f檢出率計算，并分析中間普氏菌基因多態(tài)性。中間普氏菌基因多態(tài)性分析方法：用中間普氏菌特異引物PCR對克隆樣本檢測，結果為陽性者，檢測菌株基因多態(tài)性，采用隨機引物擴增，取10μL產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，成像應用凝膠原像分析儀分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

需根管再治療的患者E.f檢出11例，檢出率為55%；未經(jīng)根管治療的患者E.f檢出2例，檢出率為10%；差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，經(jīng)AP-PCR電泳對中間普氏菌行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各樣本中均各有1種基因型。

3 討論

分析口腔科慢性根尖周炎病例采用根管治療結果失敗的原因，與患者感染根管內微生物緊密關聯(lián)。失敗病例中，有66.7%～72.0%的根管微生物檢出率。Siqueira JF Jr等[2]研究示，在治療失敗病例患牙根管內對微生物提取，與未經(jīng)治療壞死牙髓中提取的微生物明顯不同。未治療的根管系統(tǒng)以典型的多微生物混合感染為表現(xiàn)，以專性革蘭陽性及陰性厭氧菌為優(yōu)勢菌。治療失敗的病例，為單一菌種感染樣本占約1/3，兼性厭氧菌比例有所增加，向優(yōu)勢菌群轉變，而革蘭陽性菌因各種機械化治療措施的實施，有更強抵抗性，在檢出細菌中占主導[3-4]。根管治療失敗的患牙，常有特征性種屬細菌分離出，其中腸球菌的存在已引起臨床重視，因其較少在未用治療方案的感染根管中出現(xiàn)，而感染根管內腸球菌E.f最常檢出，占80%～90%。

E.f為一種革蘭陽性兼性厭氧菌，屬重要的人類機會感染病原菌，也屬人體正常菌群。其常在人類的口腔、陰道、腸道寄居，但口腔分布較少。在再感染根管病例中，E.f是最常被檢出的細菌，初次治療的病例中偶被檢出，根管治療失敗的病例中，檢出率有所增高。本次選取的再治療患者，有高達55%的E.f檢出率，明顯高于未經(jīng)治療者[5]。表明E.f為根管治療時被帶入根管內。研究示，當氫氧化鈣液pH達11.5時，可殺死99.99%的

E.f，但臨床現(xiàn)用的氫氧化鈣pH多僅可達9.5%～10.0%，E.f無法完全被消滅。

本研究所選樣本在根管填充時，未將氫氧化鈣作為根管內用藥，仍有較高的E.f檢出率，與前次治療醫(yī)生的操作技術相關。本次選取的需根管再治療的20例慢性根尖周炎樣本，大部分前次采用根管方案治療時有缺陷存在，如根管成形與清理不足、根充欠填、充填物繼發(fā)齲壞等。未徹底清理和封閉根管系統(tǒng)，增加了E.f滲入或殘留風險。病原菌在根管中匿藏，可經(jīng)未嚴密封閉的部位在滲漏的組織液中獲取生長所需營養(yǎng)，當入侵至根尖周組織，可對根尖周病變的發(fā)生和發(fā)展促進[6-7]。E.f所具有的其它特性與其高檢出率也有較緊密相關性。E.f對多種殺菌藥物及機械化學預防具廣泛抵抗力。有針對感染牙模型展開的研究示，取4%NaCIO應用，作用5 min，可達60%對E.f的清除率。分析原因，是殺菌藥物與在牙本質小管內存在的目標菌無法直接接觸。有學者將E.f在離體牙根管內植入，應用NaCIO溶液沖洗后顯示，顯著降低了E.f數(shù)量，但7 d后再行觀察，再感染根管可達80%，提示此細菌有較快的形成再感染的速度。E.f可在治療后未檢出其他協(xié)作菌的根管內生長，在治療失敗的患者中，表現(xiàn)為單一E.f感染的病例約占30%。此外，生物膜形成是治療后E.f長期在根管內存留的主要原因，生物膜中E.f有更復雜的代謝過程，且其對營養(yǎng)要求不高，繁殖迅速，可對根尖區(qū)缺氧環(huán)境耐受，進而較難達到徹底清除目標，極易引發(fā)根管治療失敗。

中間普氏菌（P.intermedia）以蛋白水解酶、脂多糖、囊泡、凝集素等為主要致病因子，是一種產(chǎn)黑色素、革蘭陰性專性厭氧菌。有研究顯示[8]，其與牙周疾病的發(fā)生關聯(lián)密切，為主要可疑致病菌。在慢性根尖周炎感染根管中有較高檢出率，表明其與根尖周感染可能也相關。依據(jù)纖毛類型差異，可將其按20種基因型劃分，在臨床收治的慢性牙周炎病例牙周袋中，有P.intermedia17、W729等4種基因型檢出，但根尖周感染中，中間普氏菌有無基因多態(tài)性存在，不同基因型作用如何，本研究選取慢性根尖周患者，在患牙感染根管中，應用隨機引物RCR技術觀察中間普氏菌基因多態(tài)性，結果顯示，所有慢性根尖周炎感染的40例患者中，經(jīng)AP-PCR電泳對中間普氏菌行基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)各樣本中均各有1種基因型。慢性根尖周炎病發(fā)過程除與致病菌種類相關外，還與致病菌毒力因子有一定相關性，而基因型不同的菌株在毒力致病性上可能存有明顯差異，即存在致病菌基因多態(tài)性。本研究不同的病例有不同基因型，體現(xiàn)了基因多態(tài)性，可為慢性根尖周炎感染中間普氏菌致病機制的研究提供依據(jù)。

綜上所述，在原發(fā)慢性根尖周炎病例感染根管中，糞腸球菌有較低的檢出率，而在再治療病例中，檢出率明顯升高，與根管治療時再感染可能相關。同時，中間普氏菌具基因多態(tài)性，可為臨床治療提供參考依據(jù)。

[1] 樊明文，周學東.牙體牙髓病學[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：200.

[2] Siqueira JF Jr,Rocas IN,Alves FR,et al.Selected endodontic pathogens in the apical third of infected root canals:A molecular inverstigation[J].J Endod, 2004,30(9):638-643.

[3] 唐子圣，曹慧敏，劉正，等.應用16 SrDNA結合膜芯片檢測3種產(chǎn)黑色素牙周牙疑致病菌[J].上?？谇会t(yī)學，2006，15（3）：290-293.

[4] 孫慧斌，鄧婧，王云，等.根管治療失敗病例根管內微生物的分子生物學檢測[J].實用口腔醫(yī)學雜志，2010，26（1）：96-99.

[5] 魏玉芬.不同處理方式對急性根尖周炎的療效觀察[J].當代醫(yī)學，2011，17（35）：106-107.

[6] 閆培芳，梁景平，李超倫，等.慢性根尖周炎根管中8種厭氧菌檢出分析[J].口腔醫(yī)學，2006，26（4）：250-252.

[7] 張英姿，曾建軍.碘仿糊劑與Vitapex治療難治性根尖周炎臨床療效觀察[J].當代醫(yī)學，2010，16（22）：46.

[8] Lyer D, Anaya-Bergman C,Jones K,et al.AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rech repeat internalin-like protein[J].Infec Immun,2010,78(6): 2385-2396.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.30.029

江西 333000 江西省景德鎮(zhèn)市牙病防治所（徐芳）